朱文芳 林金輝

乳腺癌是世界上女性癌癥死亡的主要原因之一，主要發(fā)生于乳腺上皮組織的惡性腫瘤[1]。目前乳腺癌患者除外科手術(shù)之外，化療對(duì)各個(gè)類型的乳腺癌均有重要的抑制作用[1]。多柔比星（DOX）是臨床一線用于乳腺癌治療的化療藥物，然而，隨著化療周期的延長(zhǎng)，乳腺癌細(xì)胞通過上調(diào)對(duì)P-糖蛋白（P-gp）和多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）的表達(dá)導(dǎo)致DOX 的耐藥性越來越強(qiáng)，同時(shí)高累積劑量的DOX 毒副作用增強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致化療失敗。因此，尋找提高DOX 化療敏感性且無毒副作用的藥物具有重要的臨床意義[2]。研究發(fā)現(xiàn)，天然產(chǎn)物能夠作為潛在的耐藥調(diào)節(jié)劑，逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥繼而更好地殺死腫瘤細(xì)胞[3]。五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）是五味子果實(shí)中的一種二苯并環(huán)辛二烯類天然產(chǎn)物，已被證明具有多種生物活性，包括抗炎、抗腫瘤及心血管保護(hù)等活性[4]。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)Sch B 是P-gp和MRP1 的有效抑制劑，能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性（MDR）[5]。但Sch B 逆轉(zhuǎn)腺癌DOX 耐藥的作用機(jī)制尚不清楚，本研究將探討Sch B 逆轉(zhuǎn)乳腺癌DOX 耐藥的可能作用機(jī)制，以期為Sch B 臨床抗乳腺癌的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 Sch B（批號(hào)S117968）和DOX（批號(hào)A183027）購(gòu)自上海阿拉丁有限公司。

1.2 細(xì)胞系 乳腺癌細(xì)胞MCF7 購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫(kù)；乳腺癌細(xì)胞MCF7 耐多柔比星MCF7/ARD 由實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 主要試劑和儀器 RPMI/1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；P-gp（批號(hào)ab234884）、MRP1（批號(hào)ab260038）、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（p-STAT3，批號(hào)ab267373）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3，批號(hào)ab68153）、c-Myc（批號(hào)ab32072）、磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，批號(hào)ab8245）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；MTT[（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴化銨）]細(xì)胞增殖（批號(hào)ST316）、結(jié)晶紫染色液（批號(hào)C0121）、末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C1091）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。CO2培養(yǎng)箱（BBD6220，美國(guó)Thermo 公司）和MK3 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）、低溫高速離心機(jī)（5920R，德國(guó)Eppendorf 公司）、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀（LAS4000，美國(guó)通用公司）、正置熒光（DM3000，德國(guó)徠卡公司）。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞MCF7和MCF7/ARD細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI/1640 培養(yǎng)基中，將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基每2 天換1 次。

1.4.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 將MCF7和MCF7/ADR 以2×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96 孔板中，分別加入不同濃度的DOX（1、5、10、20、40、60、80、100μg/mL）以 及 DOX（1、5、10、20、40、60、80、100μg/mL）+Sch B（20μg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)72h，更換含MTT 的新鮮培養(yǎng)基，再孵育4h。加入二甲基亞砜（DMSO），使用酶標(biāo)儀測(cè)量490nm 處的吸光度來評(píng)估細(xì)胞增殖抑制率，計(jì)算IC50和耐藥倍數(shù)。

1.4.3 集落實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖水平 將MCF7/ADR接種在6 孔板中，加入DOX（50μg/mL）、Sch B（20μg/mL）以及DOX（50μg/mL）+Sch B（20μg/mL）孵育7 天，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，再用結(jié)晶紫染色15min，在顯微鏡下拍攝獲得圖像，計(jì)算細(xì)胞集落數(shù)。

1.4.4 TUNEL 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將MCF7/ADR接種在6 孔板中，加入DOX（50μg/mL）、Sch B（20μg/mL）以及DOX（50μg/mL）+Sch B（20μg/mL）孵育24h，4%多聚甲醛4℃固定細(xì)胞。PBS 清洗，用0.2%曲拉通X-100（Triton X-100）通透細(xì)胞，加入平衡緩沖液室和r-末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶（rTdT）孵育緩沖液PBS 清洗，二脒基苯基吲哚（DAPI）染核，加適量抗熒光淬滅劑，封片，使用熒光顯微鏡成像，分析細(xì)胞凋亡率。

1.4.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞愈合情況 將MCF7/ADR 接種在6 孔板中，培養(yǎng)基中孵育直至生長(zhǎng)至80%左右，加入DOX（50μg/mL）、Sch B（20μg/mL）以及DOX（50μg/mL）+Sch B（20μg/mL）孵育24h，用無菌移液器槍頭在6 孔板內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞劃痕，隨機(jī)視野，分別在0h和24h 通過拍攝來評(píng)估細(xì)胞遷移率。

1.4.6 Western blot 法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 將MCF7/ADR 接種在6 孔板中，加入DOX（50μg/mL）、Sch B（20μg/mL）以及DOX（50μg/mL）+Sch B（20μg/mL）孵育48h，加入細(xì)胞裂解液后收集細(xì)胞，測(cè)定蛋白濃度。用SDS-PAGE 凝膠分離蛋白質(zhì)樣品，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用5%牛血清白蛋白封閉膜，加入一抗后在4℃下孵育過夜，然后加入相應(yīng)的二抗中，于室溫孵育2h。對(duì)蛋白條帶進(jìn)行曝光，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0和GraphPad8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。本研究數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩者間比較采用t 檢驗(yàn)。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DOX 聯(lián)合Sch B 用藥后耐藥細(xì)胞株MCF7/ADR 的耐藥倍數(shù) MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DOX 對(duì)MCF7和MCF7/ADR 的IC50 值分別為（4.01±0.15）、（50.78±0.67）μmol/L，耐藥倍數(shù)為12.66；DOX 聯(lián)合Sch B 后 對(duì)MCF7 及MCF7/AD 的IC50 值 分 別 為（2.28±0.34）、（13.24±0.58）μmol/L，耐藥倍數(shù)為5.81，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 Sch B 對(duì)MCF7、MCF7/ADR細(xì)胞的IC50 及耐藥倍數(shù)

2.2 DOX 聯(lián)合Sch B 用藥后耐藥細(xì)胞株MCF7/ADR 的細(xì)胞集落數(shù)量細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)表明，相對(duì)DOX 組和Sch B 組，DOX+Sch B 組的細(xì)胞集落數(shù)明顯減少，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

表2 各組細(xì)胞集落數(shù)比較（個(gè)，）

表2 各組細(xì)胞集落數(shù)比較（個(gè)，）

注：DOX 組為50μg/mL 的DOX 處理；Sch B 組為20μg/mL 的Sch B處理；DOX+Sch B 組為50μg/mL 的DOX+20μg/mL 的Sch B 處理；DOX 為多柔比星；Sch B 為五味子乙素；與DOX 組相比，aP＜0.01；與Sch B 組相比，bP＜0.01

2.3 DOX 聯(lián)合Sch B 用藥后耐藥細(xì)胞株MCF7/ADR細(xì)胞凋亡率 Tunel 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DOX 組、Sch B組以及DOX+Sch B 組的細(xì)胞凋亡水平，三組凋亡率分別為（27.17±2.57）%、（33.67±3.21）%、（74.67±4.51）%，結(jié)果顯示，與單藥組比較，DOX+Sch B 組明顯增加MCF7/ADR細(xì)胞的凋亡水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1、表3。

圖1 DOX 聯(lián)合Sch B 用藥后提高耐藥細(xì)胞株MCF7/ADR的細(xì)胞凋亡率

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較（%，）

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較（%，）

注：DOX 組為50μg/mL 的DOX 處理；Sch B 組為20μg/mL 的Sch B處理；DOX+Sch B 組為50μg/mL 的DOX+20μg/mL 的Sch B 處理；DOX 為多柔比星；與DOX 組相比，aP＜0.01；與Sch B 組相比，bP＜0.01

2.4 DOX 聯(lián)合Sch B 用藥后耐藥細(xì)胞株MCF7/ADR 的細(xì)胞遷移率細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)DOX 組和Sch B 組，DOX+Sch B 組的細(xì)胞遷移率降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2、表4。

表4 各組細(xì)胞遷移率比較（%，）

表4 各組細(xì)胞遷移率比較（%，）

注：DOX 組為50μg/mL 的DOX 處理；Sch B 組為20μg/mL 的Sch B處理；DOX+Sch B 組為50μg/mL 的DOX+20μg/mL 的Sch B 處理；DOX 為多柔比星；與DOX 組比較，aP＜0.01；與Sch B 組比較，bP＜0.01

圖2 DOX 聯(lián)合Sch B 用藥后降低耐藥細(xì)胞株MCF7/ADR 的細(xì)胞遷移

2.5 DOX 聯(lián)合Sch B 用藥后耐藥細(xì)胞株MCF7/ADR 的P-gp 與MRP1 蛋白表達(dá)水平 Western blot結(jié)果顯示，DOX+Sch B 組的P-gp 與MRP1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），說明DOX 聯(lián)合Sch B 后通過降低P-gp 與MRP1 的蛋白水平逆轉(zhuǎn)耐藥。見圖3、表5。

表5 各組P-gp 與MRP1 的蛋白表達(dá)水平比較（）

表5 各組P-gp 與MRP1 的蛋白表達(dá)水平比較（）

注：DOX 組為50μg/mL 的DOX 處理；Sch B 組為20μg/mL 的Sch B處理；DOX+Sch B 組為50μg/mL 的DOX+20μg/mL 的Sch B 處理；DOX 為多柔比星；Sch B 為五味子乙素；P-gp 為P-糖蛋白；MRP1為多藥耐藥相關(guān)蛋白1；與DOX 組比較，aP＜0.01；與Sch B 組比較，bP＜0.01

圖3 DOX 聯(lián)合Sch B 用藥后下調(diào)耐藥細(xì)胞株MCF7/ADR 的P-gp 與MRP1 蛋白水平

2.6 DOX 聯(lián)合Sch B 用藥后對(duì)耐藥細(xì)胞株MCF7/ADR 的STAT3 通路的影響 Western blot 結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞株MCF7/ADR 中的STAT3 通路處于激活狀態(tài)，而DOX+Sch B 組的p-STAT3和STAT3 信號(hào)通路下游c-Myc 的蛋白水平降低（P＜0.01），說明DOX 聯(lián)合Sch B 后通過抑制STAT3 通路逆轉(zhuǎn)耐藥。見圖4、表6。

表6 各組p-STAT3和c-Myc 的蛋白表達(dá)（）

表6 各組p-STAT3和c-Myc 的蛋白表達(dá)（）

注：DOX 組為50μg/mL 的DOX 處理；Sch B 組為20μg/mL 的Sch B處理；DOX+Sch B 組為50μg/mL 的DOX+20μg/mL 的Sch B 處理；DOX 為多柔比星；Sch B 為五味子乙素；p-STAT3 為磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3；STAT3 為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激酶因子3；與DOX 組相比，aP＜0.01；與Sch B 組相比，bP＜0.01

圖4 DOX 聯(lián)合Sch B 用藥后抑制耐藥細(xì)胞株MCF7/ADR 的STAT3 通路

3 討論

乳腺癌是目前影響女性死亡的原因之一，化療是治療乳腺癌的主要手段[1]。DOX 是臨床上乳腺癌化療的一線藥物，但在治療過程中容易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象，是臨床上化療失敗的主要原因[2]。研究發(fā)現(xiàn)，P-gp 與MRP1 蛋白是介導(dǎo)DOX 多藥耐藥的主要蛋白[2]，通過抑制P-gp 與MRP1 蛋白的表達(dá)是逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞DOX 耐藥的有效措施。

研究發(fā)現(xiàn)，活性天然產(chǎn)物單體Sch B 具有逆轉(zhuǎn)P-gp 與MRP1 蛋白介導(dǎo)耐藥的能力。李秋萍和蓋亞男[6]發(fā)現(xiàn)Sch B 具有能夠逆轉(zhuǎn)人骨肉瘤細(xì)胞U-2OS多藥耐藥的效果，其機(jī)制與下調(diào)耐藥株的MRP1 基因、蛋白水平以及抑制磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶（PI3K/Akt）通路激活有關(guān)。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，Sch B 濃度依賴性地逆轉(zhuǎn)HL60/ADR 耐藥，這與化療藥物對(duì)MRP1 介導(dǎo)的耐藥及增加化療藥物的積聚能力有關(guān)[7]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于DOX 單藥組，Sch B 聯(lián)合DOX 后能夠有效逆轉(zhuǎn)MCF7/ADR 的耐藥性，增加耐藥細(xì)胞MCF7/ADR 對(duì)DOX 的敏感性。腫瘤細(xì)胞一般具有較強(qiáng)的生存能力和適應(yīng)力，能夠形成集落狀態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)Sch B 增強(qiáng)DOX 對(duì)MCF7/ADR 的集落形成抑制能力。細(xì)胞凋亡是一種常見的程序性細(xì)胞死亡方式，化療藥物通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡繼而起到抗腫瘤作用。相對(duì)于DOX 單藥組，聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率明顯升高，說明Sch B 能夠通過提高DOX 對(duì)MCF7/ADR 的細(xì)胞凋亡從而起到逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。同時(shí)，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移往往是腫瘤治療失敗的主要原因，因此我們對(duì)細(xì)胞遷移進(jìn)行相關(guān)的研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Sch B 聯(lián)合DOX 后降低耐藥細(xì)胞株MCF7/ADR 的細(xì)胞劃痕愈合率。

研究表明，STAT3 信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞化療耐藥性有關(guān)，腫瘤細(xì)胞能夠通過激活STAT3 信號(hào)通路來降低化療藥物導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，繼而誘發(fā)耐藥現(xiàn)象[8]。其中，STAT3 活化介導(dǎo)乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。研究表明致癌性細(xì)胞因子通過與細(xì)胞膜的相應(yīng)受體結(jié)合后導(dǎo)致STAT3 與酪氨酸磷酸化通道相偶聯(lián)后被激活，從而調(diào)節(jié)其下游c-Myc 等靶基因表達(dá)，參與腫瘤化療耐藥，說明抑制STAT3 通路對(duì)逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥具有一定的臨床意義[9]。進(jìn)一步的Western blot 的結(jié)果表明，Sch B 聯(lián)合DOX 后能夠下調(diào)p-STAT3和STAT3 信號(hào)通路下游c-Myc 的蛋白水平，說明Sch B 能夠通過有效抑制STAT3 通路起到逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞株MCF7/ADR 在DOX聯(lián)合Sch B 聯(lián)合作用下，P-gp 與MRP1 蛋白表達(dá)水平也明顯降低。

綜上所述，Sch B 可能有效逆轉(zhuǎn)MCF7細(xì)胞DOX 耐藥，為臨床上使用Sch B 等中藥逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但更需要體內(nèi)外的進(jìn)一步研究。