余慧君 彭 暉

青葙皂苷（Celosins，CES）是中藥青葙子的主要有效成分，其化合物類別為五環(huán)三萜皂苷類，共9類，其中CESⅠ、Ⅱ是其發(fā)揮藥理作用的主要成分。研究發(fā)現(xiàn)，CES 具有抗腫瘤、降血脂、降血糖的作用[1-2]。然而，目前關(guān)于CES 對心肌細胞保護作用及機制的研究較少。氧化應(yīng)激與心肌肥厚、心力衰竭、缺血性心臟病及原發(fā)性高血壓等的發(fā)病機制有關(guān)，在這些病理過程中產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）[3]。ROS 過度積累，造成氧化應(yīng)激。作為活躍的高耗氧量的器官，心臟易受到氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細胞壞死及凋亡[4-5]?？寡趸疦rf2/ARE 信號通路既能平衡細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，還能誘導(dǎo)細胞內(nèi)的抗氧化酶清除多余的ROS[6]。有報道表明，Nrf2/ARE 信號通路調(diào)控細胞氧化應(yīng)激過程，與動脈粥樣硬化形成密切相關(guān)，在心血管疾病中發(fā)揮重要作用[7-8]。本研究應(yīng)用H2O2誘導(dǎo)H9c2 心肌細胞損傷模型，探討CES 對抗心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的作用機制。

1 實驗材料

1.1 細胞株 大鼠心肌細胞H9c2（批號RDCL-012）購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.2 試劑及儀器 噻唑藍（MTT）（上海源葉生物科技有限公司，批號S19063），高糖培養(yǎng)基（DMEM 培養(yǎng)基）及胎牛血清FBS（美國Gibco 公司，批號12800017、10270106），細胞核蛋白提取試劑盒，RIPA蛋白裂解液，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司，批號分別為P0027、P0012S、P0015C、P0018FS），ROS 測定試劑盒[翌圣生物科技（上海）有限公司，批號50101ES01]，Western blot 一抗均為兔抗，包括含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3，9 剪切體（cleaved caspase-3，cleaved caspase-9）、血紅素氧合酶1（HO-1）、核因子E2 相關(guān)因子（Nrf2）、β 肌動蛋白（β-actin）、組蛋白H3（Histone H3）、B 淋巴細胞瘤-2 基因（Bcl-2）（美國abcam 公司，批號分別為ab32539、ab32351、ab32124、ab137550、ab68477、ab5694、ab1791），Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號MA0220）。流式細胞儀（美國BD 公司，型號CancoⅡ），酶標(biāo)儀、電泳儀、凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad 公司，型號分別為Cytation1、1658001、GelDoc EZ）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) H9c2細胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%青霉素與鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，在5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 MTT 法測細胞活力 H9c2 心肌細胞用0.25%胰酶消化為單細胞懸液，于96 孔板中按4000 個/孔接種，培養(yǎng)24h 后，設(shè)置對照組、H2O2處理組、低劑量CES（25μg/mL）+H2O2處理組、中劑量CES（50μg/mL）+H2O2處理組、高劑量CES（100μg/mL）+H2O2處理組，分別加入100μL 培養(yǎng)液，給藥組則將CES 用培養(yǎng)基稀釋為低、中、高（25、50、100μg/mL）三個劑量加入藥物組孔中作用24h 后，H2O2處理組和CES 給藥組中均加入300μmol/L H2O2培養(yǎng)4h，按說明書操作并在490nm 波長下測量吸光度。

2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 將6 孔板中的H9c2細胞分為對照組、H2O2處理組、低劑量CES（25μg/mL）+H2O2處理組、中劑量CES（50μg/mL）+H2O2處理組、高劑量CES（100μg/mL）+H2O2處理組。除了對照組，每組中加入培養(yǎng)基稀釋的H2O2，使其最終濃度為300μmol/L 并繼續(xù)培養(yǎng)4h，利用胰酶將細胞消化為單細胞懸液，離心后加入200μL binding buffer 重懸，按說明書進行Annexin V/PI 染色后，流式儀檢測細胞凋亡率。

2.4 檢測細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生 將細胞按4000 個/孔接種在96 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h 后，按2.3 中方式給藥處理。培養(yǎng)結(jié)束后收集細胞用于ROS 檢測。采用ROS 測試劑盒測定細胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生量。取各處理組細胞，加入終濃度為10μM DCFH-DA（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate），在孵箱中孵育30min后，PBS 洗3 次，采用流式細胞儀測定細胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生量。

2.5 Western blot 檢測相關(guān)蛋白表達 取2.3 給藥處理不同組別的細胞，提取細胞全蛋白；對于核內(nèi)Nrf 的表達檢測，則收集細胞利用細胞核蛋白抽提試劑盒提取蛋白，以上蛋白均經(jīng)過BCA 蛋白濃度檢測試劑盒檢測其蛋白濃度，取相同蛋白量制備Western blot 上樣樣本。分組加入樣品槽內(nèi)進行電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜并封閉，按1∶1000 進行下列抗體的孵育：caspase -9、caspase -3、bcl -2、Nrf2、HO -1、β -actin、Histone H3。一抗孵育過夜后，進行二抗孵育，待清洗后進行ECL 化學(xué)發(fā)光處理，利用凝膠成像系統(tǒng)檢測。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t 檢驗。當(dāng)P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 CES 改善H2O2誘導(dǎo)的H9c2 心肌細胞活力MTT 實驗結(jié)果表明，與對照組比較，300μmol/L H2O2處理H9c2 心肌細胞后細胞活力明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而不同濃度的CES 處理的心肌細胞活力明顯提升（P 均＜0.05），見表1。

表1 各組H9c2 心肌細胞存活率比較（%，）

表1 各組H9c2 心肌細胞存活率比較（%，）

注：對照組為未經(jīng)處理的H9c2 心肌細胞；H2O2 處理組為300μmol/L H2O2 處理組；低、中、高劑量CES+H2O2 處理組分別為25、50、100μg/mL CES 同時加300μmol/L H2O2 處理細胞；CES 為青葙皂苷；與對照組比較，aP＜0.05；與H2O2 處理組比較，bP＜0.05

3.2 CES 降低H2O2誘導(dǎo)的H9c2 心肌細胞凋亡率凋亡檢測實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，H2O2可顯著誘導(dǎo)H9c2 心肌細胞凋亡（P＜0.05）。而CES 的處理能降低H2O2誘導(dǎo)的H9c2細胞凋亡，且效果具有劑量依賴性（P 均＜0.05）。因此，CES 的處理可以改善H2O2引起的H9c2 心肌細胞凋亡，見表2、圖1。

表2 各組H9c2 心肌細胞凋亡率比較（%，）

表2 各組H9c2 心肌細胞凋亡率比較（%，）

注：對照組為未經(jīng)處理的H9c2 心肌細胞；H2O2 處理組為300μmol/L H2O2 處理組；低、中、高劑量CES+H2O2 處理組分別為25、50、100μg/mL CES 同時加300μmol/L H2O2 處理細胞；CES 為青葙皂苷；與對照組比較，aP＜0.05；與H2O2 處理組比較，bP＜0.05

圖1 青葙皂苷（CES）有效改善H2O2 誘導(dǎo)的H9c2 心肌細胞凋亡

3.3 CES 對凋亡相關(guān)信號通路蛋白表達的影響Western blot 實驗顯示，與H2O2處理組比較，低、中、高劑量CES 明顯降低H2O2處理的H9c2 心肌細胞Bax、cleaved caspase-9 與cleaved caspase-3 蛋白的表達，上調(diào)Bcl-2 蛋白的表達，見圖2。

圖2 青葙皂苷（CES）對凋亡相關(guān)蛋白的影響

3.4 CES 預(yù)處理可抑制細胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生 通過檢測不同處理組內(nèi)H2O2誘導(dǎo)的H9c2 心肌細胞ROS產(chǎn)生量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H2O2處理后，細胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生量明顯增加（P＜0.05），而經(jīng)CES 處理組，ROS 含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05），見表3。

表3 各組中ROS 產(chǎn)生水平比較（%，）

表3 各組中ROS 產(chǎn)生水平比較（%，）

注：對照組為未經(jīng)處理的H9c2 心肌細胞；H2O2 處理組為300μmol/L H2O2 處理組；低、中、高劑量CES+H2O2 處理組分別為25、50、100μg/mL CES 同時加300μmol/L H2O2 處理細胞；ROS 為活性氧；與對照組比較aP＜0.05；與H2O2 處理組比較，bP＜0.05

3.5 CES 調(diào)控Nrf2/ARE 信號通路 Western blot 結(jié)果顯示，H2O2處理組細胞核內(nèi)Nrf2 的核轉(zhuǎn)位減少，抗氧化酶HO-1 的表達減少；而經(jīng)CES 處理后，細胞內(nèi)Nrf2 及HO-1 的表達回調(diào)，表明CES 可通過調(diào)控Nrf2/ARE 信號通路發(fā)揮抗氧化作用，見圖3。

圖3 青葙皂苷（CES）對細胞內(nèi)Nrf2/ARE 信號通路的調(diào)控

4 討論

氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化和抗氧化作用失衡導(dǎo)致，其中ROS 的過量產(chǎn)生是造成心肌細胞損傷的重要因素之一[9-10]。同時，在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的缺血和再灌注階段，都會產(chǎn)生過量的ROS 以維持細胞正常機能與氧化還原狀態(tài)[11-12]。而H2O2為造成氧化應(yīng)激的主要成分，可以進入細胞內(nèi)發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量的ROS，從而造成細胞損傷。

Nrf2 是細胞應(yīng)對氧化應(yīng)激的新興的轉(zhuǎn)錄因子之一，其可調(diào)控抗氧化反應(yīng)原件依賴基因的表達，從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)因氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的病理結(jié)果[13]。在正常條件下，Nrf2 與可kelch 樣ech 相關(guān)蛋白1（Keap1）結(jié)合，而在氧化應(yīng)激情況下，Keap1 在氧化或烷基化過程中發(fā)生構(gòu)象變化，將Nrf2 與Keep1 分離，Nrf2易位至細胞核，開始與一種稱為肌筋膜性纖維肉瘤的轉(zhuǎn)錄因子異二聚，由此產(chǎn)生的復(fù)合物與抗氧化反應(yīng)原件ARE 結(jié)合并啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄HO-1、QO1 等的表達，產(chǎn)生抗氧化防御系統(tǒng)而發(fā)揮心肌細胞的作用[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，CES 可以激活Nrf2，促進其核轉(zhuǎn)移，同時降低HO-1 表達，說明CES 可能通過調(diào)控Nrf2/ARE 信號通路抑制H2O2誘導(dǎo)的細胞氧化應(yīng)激損傷。

氧化應(yīng)激損傷促進線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開放，促進細胞色素C、caspase-9、caspase-3的活化，引起心肌細胞的凋亡[16-17]。我們研究發(fā)現(xiàn)，H2O2處理的可引起H9c2 心肌細胞中凋亡相關(guān)蛋白的改變，表明線粒體受損，線粒體凋亡通路被活化。而細胞經(jīng)不同濃度的CES 預(yù)處理后，凋亡相關(guān)蛋白的表達水平得到逆轉(zhuǎn)，表明CES 可能通過調(diào)控線粒體凋亡通路，對H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡具有保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)的H9c2 心肌細胞心肌損傷模型中ROS 產(chǎn)生量增加，而CES 處理可降低細胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生量，此結(jié)果顯示，CES 可能通過減少ROS 的產(chǎn)生而改善心肌細胞凋亡。

綜上所述，該研究表明CES 具有抗氧化、抗凋亡作用，并可能通過調(diào)控Nrf2/ARE 信號通路從而改善H2O2誘導(dǎo)的H9c2 心肌細胞損傷。