王仙偉 雷 虹 何欣威 朱 峰 柯紹發(fā)

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是腦梗、心梗、高血壓等心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，涉及炎癥細(xì)胞浸潤，脂質(zhì)代謝紊亂，氧化應(yīng)激，內(nèi)皮細(xì)胞損傷等一系列反應(yīng)過程[1-2]。心腦血管疾病死亡率高居榜首[3-4]。研究表明，炎癥因子白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）參與AS 炎癥反應(yīng)，同時(shí)脂質(zhì)失衡、細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流減少是AS 發(fā)生、發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)之一[5-6]。前期有效防治AS 病理進(jìn)展可降低心腦血管疾病的發(fā)病率與死亡率。升麻苷（cimicifugoside）為防風(fēng)的有效成分，能夠改善內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子IL-6、TNF-α 的釋放，抑制單核與內(nèi)皮細(xì)胞黏附性增高，從而達(dá)到抑制AS 炎性反應(yīng)的作用，腺嘌呤核苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ATPbinding cassette A1，ABCA1）是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一，其可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流進(jìn)而達(dá)到平衡脂質(zhì)的作用[7-9]，本文探討升麻苷防治AS 的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞 THP-1 人單核細(xì)胞（批號(hào)SCSP-567，中科院上海細(xì)胞生物所）。

1.2 藥品 升麻苷（批號(hào)D83729，上海源葉生物科技有限公司）。

1.3 試劑與儀器 RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清均購自Gibco 公司（批號(hào)27387663、12337648）；CCK8試劑盒（批號(hào)AJ30298，DOJINDO 公司）；佛波酯（PMA）（批號(hào)52391EA03，上海翊圣生物科技有限公司）；ECL 極超敏顯色液（批號(hào)P0018FM，碧云天公司）；IL-6 與TNF-α ELISA 試劑盒、油紅O 染色試劑盒（批號(hào)H007-2、H053-56、D027-1-1，南京建成）；β-actin 抗體（批號(hào)CS-2311，武漢博士德生物科技有限公司）；；ABCA1、IL-6、TNF-α 抗體（批號(hào)ab66217、ab233706、ab255275，Abcam 公司）。Cytation1多功能酶標(biāo)儀（美國Biotek），純水儀（美國MILLIPORE 公司，Synthesis A10），倒置顯微鏡（日本尼康，Ti2），雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國Odyssey CLX）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 泡沫細(xì)胞誘導(dǎo)及鑒定 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640（含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素、100μg/mL 鏈霉素）培養(yǎng)液中，靜置培養(yǎng)于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，每36h 換液1 次，每48～72h傳代1 次，于傳代3 次后第1 天取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞鋪板實(shí)驗(yàn)，每次細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中使用150nmol PMA 孵育細(xì)胞24h，正常THP-1細(xì)胞在400 倍光鏡下呈懸浮狀態(tài)，為圓形或卵圓形，而PMA 刺激后顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則且大部分細(xì)胞伸出偽足，證實(shí)THP-1細(xì)胞已分化成為巨噬細(xì)胞[10]，更換孔板培養(yǎng)液后加入終濃度為50mg/L 的低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)THP-1 源性巨噬細(xì)胞泡沫化48h 后加入升麻苷進(jìn)行干預(yù)研究。

2.2 油紅O 染色 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞培養(yǎng)于6 孔板，經(jīng)分化處理后使用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗，3×5min。50%異丙醇固定1min，油紅O 紅色儲(chǔ)備液染色10min，復(fù)染液染色3～5min，水洗30～60s，封片后鏡檢。

2.3 CCK8 法測定細(xì)胞存活率 96 孔板四周外圈孔板鋪PBS，于中間孔板部分鋪濃度為2×104個(gè)/mL 的泡沫細(xì)胞200μL，每組6 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h，使得細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期。各組加入體積分?jǐn)?shù)為10%的CCK8試劑，作用3h 后，使用Cytation1 酶標(biāo)儀測量450nm處的吸光度，統(tǒng)計(jì)分析后計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.4 TNF-α 及IL-6 測定 將ox-LDL 誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞傳代后，接種對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞于6 孔板中，密度為3×104個(gè)/mL，培養(yǎng)于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)48h 后收集各組細(xì)胞上清液，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行TNF-α 及IL-6 測定。

2.5 Western blot 檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液（含苯甲基磺酰氟1mmol/L），置于冰上裂解30min 后12000r/min 4℃離心15min。離心獲得蛋白用BCA 法測定濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液于95℃變性15min。8%～12% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，電泳后的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，然后用5%的脫脂奶粉室溫封閉1h，TBST 洗膜3 次后孵育相應(yīng)一抗（1∶1000）4℃過夜，TBST 洗膜3次后室溫孵育相應(yīng)二抗（1∶5000）2h，使用ECL 試劑盒化學(xué)發(fā)光，F(xiàn)luor chem R 成像系統(tǒng)掃描分析蛋白條帶。

2.6 細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出率測定 采用閃爍計(jì)數(shù)法測定，細(xì)胞孵育結(jié)束后接種于24 孔板，調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，當(dāng)細(xì)胞融合率到達(dá)90%時(shí)，使用0.2μCi/mL[3H]膽固醇孵育24h。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 液洗滌細(xì)胞3 次，再用含1% FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)液平衡24h。PBS 洗滌細(xì)胞后使用閃爍液裂解細(xì)胞，用閃爍計(jì)數(shù)法檢測培養(yǎng)液和細(xì)胞中的[3H]膽固醇。膽固醇流出率=（培養(yǎng)液counts/min 值）/（總counts/min 值）×100%，其中總counts/min 值=培養(yǎng)液counts/min 值+細(xì)胞counts/min 值，以百分比（%）顯示統(tǒng)計(jì)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 8.0和SPSS 20.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，進(jìn)行單因素方差分析（多組）或Student’s t 檢驗(yàn)（兩組），P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 以PMA 誘導(dǎo)THP-1 單核細(xì)胞，24h 后可見細(xì)胞呈梭形貼壁生長，多數(shù)細(xì)胞伸出偽足，說明細(xì)胞已分化為巨噬細(xì)胞（見圖1A）。對(duì)分化的巨噬細(xì)胞使用ox-LDL孵育48h，使用10%油紅O 染色，顯微鏡下觀察可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量紅色脂質(zhì)顆粒，呈現(xiàn)出泡沫細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)，見圖1B。

圖1 THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞的誘導(dǎo)分化（油紅O 染色×40）注：A 為PMA 誘導(dǎo)分化的THP-1 單核細(xì)胞；B 為油紅O 染色oxLDL 孵育后的巨噬細(xì)胞

3.2 不同濃度升麻苷對(duì)THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞存活率的影響 不同濃度升麻苷處理THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞48h，CCK8 法檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示，與空白對(duì)照相比，升麻苷濃度≤64μg/mL 時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且細(xì)胞活力維持在90%以上，因此該范圍濃度內(nèi)升麻苷對(duì)細(xì)胞作用無明顯毒性；而當(dāng)濃度到128、256μg/mL 時(shí)，細(xì)胞活力降低（P＜0.05 或P＜0.01），表明高濃度升麻苷處理細(xì)胞可能存在毒性，進(jìn)而選擇16、64μg/mL 作為后續(xù)藥物干預(yù)濃度，見表1。

表1 各組細(xì)胞活力比較（%，）

表1 各組細(xì)胞活力比較（%，）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01

3.3 升麻苷對(duì)THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞上清液TNF-α、IL-6 含量影響 THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞組上清液中TNF-α 與IL-6 的含量明顯增加，表明經(jīng)誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有明顯的炎癥反應(yīng)（P＜0.01），而經(jīng)16、64μg/mL 升麻苷干預(yù)，可降低培養(yǎng)液中TNF-α與IL-6 的含量，且呈現(xiàn)出濃度相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01），見表2。

表2 升麻苷對(duì)THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞TNF-α、IL-6含量影響（pg/mL，）

表2 升麻苷對(duì)THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞TNF-α、IL-6含量影響（pg/mL，）

注：ox-LDL 為氧化低密度脂蛋白；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-6為白介素-6；與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與ox-LDL 模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01

3.4 升麻苷對(duì)THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)影響 Western blot 檢測結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，ox-LDL 模型組的IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)均明顯增加，膜整合蛋白ABCA1 表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。經(jīng)16、64μg/mL 升麻苷藥物干預(yù)后，IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)量降低，ABCA1 蛋白表達(dá)量增強(qiáng)（P＜0.05 或P＜0.01），見表3、圖2。

表3 升麻苷對(duì)THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞IL-6、TNF-α和ABCA1 蛋白表達(dá)影響（）

表3 升麻苷對(duì)THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞IL-6、TNF-α和ABCA1 蛋白表達(dá)影響（）

注：ox-LDL 為氧化低密度脂蛋白；IL-6 為白介素-6；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；ABCA1 為腺嘌呤核苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1；與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與ox-LDL 模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01

圖2 升麻苷對(duì)THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)影響（n=4）

3.5 升麻苷對(duì)THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇流出影響 ox-LDL 模型組泡沫細(xì)胞處理后膽固醇流出率較對(duì)照組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。經(jīng)16、64μg/mL 升麻苷干預(yù)細(xì)胞后膽固醇流出率進(jìn)一步增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01），見表4。

表4 升麻苷對(duì)THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇流出的影響（%，）

表4 升麻苷對(duì)THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇流出的影響（%，）

注：ox-LDL 為氧化低密度脂蛋白；與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與ox-LDL模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01

4 討論

心腦血管疾病嚴(yán)重危害人類生命健康，AS 是心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，其與心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)有著密切的關(guān)系，以AS 為基礎(chǔ)的缺血性事件發(fā)病率和死亡率仍在迅速增加[11-13]。IL-6是一種上游炎性細(xì)胞因子，在導(dǎo)致AS 的下游炎癥反應(yīng)中起重要作用[6]，此外，促炎細(xì)胞因子TNF-α 可以激活血液中的單核細(xì)胞，這是炎癥狀態(tài)的標(biāo)記[5，9，14]。ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體是調(diào)節(jié)膽固醇外排的重要組成部分，被稱為逆向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)的把守蛋白，而ABCA1是該蛋白家族的重要成員，其具有多種復(fù)雜的功能，能介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)磷脂和膽固醇流出，并且在HDL 代謝過程中起重要作用進(jìn)而維持巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的穩(wěn)態(tài)[7，15-17]。巨噬細(xì)胞來源的泡沫細(xì)胞凋亡導(dǎo)致AS斑塊壞死核心的形成，減少斑塊區(qū)域細(xì)胞基質(zhì)的排泄，可能導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定和大多數(shù)心血管并發(fā)癥[13，17]。AS的發(fā)生、發(fā)展全程都伴隨著泡沫細(xì)胞的形成，若能夠抑制泡沫細(xì)胞的形成同時(shí)減少斑塊內(nèi)部的脂質(zhì)沉積是目前抗AS 的主要治療策略[18]。

中醫(yī)認(rèn)為，AS 屬于脈絡(luò)病變范疇，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)涉及中醫(yī)“眩暈”“胸痹”“中風(fēng)”等疾病。病因多屬本虛標(biāo)實(shí)，氣虛、陰傷、血虛為發(fā)病之本，風(fēng)、火、痰、瘀為發(fā)病之標(biāo)，本病病位在脈絡(luò)，脈絡(luò)失養(yǎng)是AS重要的病理機(jī)制?！侗静菪戮帯费裕骸胺里L(fēng)，味甘、辛，氣溫，升也，陽也，無毒。系太陽本經(jīng)之藥，又通行脾、胃二經(jīng)。古人曾分上、中、下以療病，其實(shí)，治風(fēng)則一?！狈里L(fēng)解表祛風(fēng)，勝濕，止痙，研究表明，其具有顯著的抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛作用[19-21]?；谏鲜隼碚?，本實(shí)驗(yàn)通過研究防風(fēng)中的主要成分升麻苷，從中西醫(yī)結(jié)合角度探討升麻苷對(duì)AS 病變過程中泡沫細(xì)胞的藥理作用。

AS 的病理變化包括脂質(zhì)條紋、纖維斑塊、粥樣斑塊、復(fù)合病變等，而泡沫細(xì)胞是AS 病變的早期細(xì)胞學(xué)特征。泡沫細(xì)胞由單核/巨噬細(xì)胞和從動(dòng)脈中膜遷移到內(nèi)膜的平滑肌細(xì)胞攝取大量脂質(zhì)而成。本研究使用的THP-1 人源性單核細(xì)胞經(jīng)過PMA 與ox-LDL 聯(lián)合誘導(dǎo)后制備的THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞是目前研究AS 最為常用的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法[22]。結(jié)果顯示，經(jīng)過ox-LDL 處理后的THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞TNF-α 與IL-6 顯著降低，而加入本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的低、高濃度的升麻苷后，均可降低上述炎癥因子的分泌。因此升麻苷在一定程度可改善泡沫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。本研究還顯示，經(jīng)過ox-LDL 處理后的泡沫細(xì)胞ABCA1 的表達(dá)明顯降低，而加入低、高濃度的升麻苷后，可升高ABCA1 的表達(dá)。本研究結(jié)果還顯示，ox-LDL 超載條件下，升麻苷能夠促進(jìn)胞內(nèi)膽固醇外排，抑制THP-1 巨噬細(xì)胞模型膽固醇的積累。這提示，升麻苷可能是通過上調(diào)ABCA1 表達(dá)，促進(jìn)泡沫細(xì)胞膽固醇流出，發(fā)揮抑制泡沫細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的作用。目前認(rèn)為PPARγ-LXRα 通路是調(diào)控ABCA1 蛋白表達(dá)的核心通路[23-25]，下一步我們將會(huì)探討升麻苷是否通過該通路影響ABCA1 蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到抑制胞內(nèi)膽固醇積累的作用，并在動(dòng)物模型中觀察其對(duì)動(dòng)脈硬化斑塊的干預(yù)作用?？傊?，細(xì)胞研究結(jié)果初步表明，升麻苷可能具有抗AS 進(jìn)展的作用，值得進(jìn)一步深入研究。