唐 瑤，楊 建，郭正成 ，郝 峰，寧金鷹，康金森

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊830011；2新疆天然藥物活性組分與釋藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830000；

3康源博創(chuàng)（北京）生物科技有限公司，北京100010)

乳腺癌是女性發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，在分子水平上主要表現(xiàn)出高度異質(zhì)性,包括幾個(gè)具有不同腫瘤生物學(xué)特性的分子亞群：管腔A 型(Lu?minal A)、管 腔B 型(Luminal B)、HER-2 過(guò) 表 達(dá) 型(HER-2+)、基底樣型(三陰性，Basal-like)以及正常樣型[1]。約70% 的乳腺癌患者呈雌激素受體(ER)陽(yáng)性，有效的內(nèi)分泌治療能夠改善ER 陽(yáng)性患者的預(yù)后，但乳腺癌患者對(duì)內(nèi)分泌治療的耐藥性仍然是該疾病的臨床挑戰(zhàn)[2]。細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(CDK)4/6抑制劑是目前乳腺癌靶向治療藥物研究的最新熱點(diǎn)，CDK4/6抑制劑正迅速改變激素受體(HR)陽(yáng)性人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)陰性(HR+/HER2-)晚期乳腺癌的治療格局，能夠有效地延遲內(nèi)分泌抵抗的出現(xiàn)[3]。 目前帕博西尼(Palbociclib)、瑞博西尼(riboci?clib)、和?，斘髂?abemaciclib)3種口服特異性CDK4/6 抑制劑已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于HR+／HER2－乳腺癌患者的一線治療[4]。雖然CDK4/6抑制劑可以有效改善HR+／HER2－乳腺癌患者的預(yù)后,但不同的個(gè)體對(duì)CDK4/6 抑制劑敏感性不同，大多數(shù)患者在接受CDK4/6抑制劑治療后出現(xiàn)耐藥。腫瘤耐藥主要分為內(nèi)源性耐藥和獲得性耐藥，其耐藥機(jī)制十分復(fù)雜。目前國(guó)內(nèi)建立腫瘤耐藥細(xì)胞株的方法主要使用藥物篩選法，包括大劑量藥物沖擊療法和濃度遞增法[5]。研究認(rèn)為基于藥物劑量遞增建立腫瘤耐藥細(xì)胞主要是通過(guò)化療藥物持續(xù)作用,使用腫瘤細(xì)胞生理和遺傳特性發(fā)生改變,從而產(chǎn)生獲得性耐藥[6]。本實(shí)驗(yàn)以帕博西尼(palbociclib)為誘導(dǎo)藥物，人HR+／HER2-細(xì)胞T47D為誘導(dǎo)對(duì)象，探究人源乳腺癌細(xì)胞系(T47D)對(duì)帕博西尼耐藥的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試藥培養(yǎng)基RPMI-1640(Hyclone，SH30809.01)；0.25% 胰酶(Solarbio，T1320)；100×青鏈霉素混合液(Solarbio，P1400)；1×磷酸鹽緩沖液PBS(Solarbio，P1020-500)；10×磷酸鹽緩沖液PBS (Solarbio，P1022-500)；牛胰島素(Solarbio，I8040)；胎牛血清FBS(Gibco，10099-141)；CellTiter-Glo? Luminescent Cell Viability Assay(Promega， G7572)； Palbociclib (selleck， PD-0332991)，總RNA 提取試劑盒RNeazy Plus MiniKit(250)(QIAGEN，74136)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix(TAKARA，RR036A)，PowerUp ?SYBR ?Green premix (Thermo，A25742)；抗磷酸Rb(CST，8516T)；總Rb(CST，9313T)、CDK2(CST，18048T)；CDK4(CST，12790T)；CDK6(CST，13331T)；CCND1(CST，55506T)；內(nèi)參GAPDH(CST，5174S)；均為抗兔單克隆抗體；及其相應(yīng)的二抗Anti-rabbit IgG, HRPlinked Antibody(CST，7074S)；引物由中國(guó)北京瑞博興科合成。

1.2 儀器96 孔透明平底黑壁板(Corning)；Spectra?Max 多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀(MD)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)；生物安全柜(Thermo Scientific)；倒置顯微鏡(Olympus，CKX41SF)；iBlot 2 Dry Blotting System(In?vitrogen)；Mini-Protean Tera 小型垂直電泳槽(Bio-Rad)；ImageQuant ?LAS 4000 Image Analyzer (GE Healthcare Bio-Sciences AB)；7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems?Thermo)。

1.3 細(xì)胞人乳腺癌細(xì)胞系T47D 購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)；人乳腺癌帕博西尼耐藥細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T47D 人乳腺癌細(xì)胞采用RPMI-1640(含有10% 胎牛血清，1×青鏈霉素混合液)培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2~3 天更換培養(yǎng)液，貼壁生長(zhǎng)良好的乳腺癌細(xì)胞經(jīng)0.25% 胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.2 人乳腺癌帕博西尼耐藥細(xì)胞株的建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T47D 細(xì)胞，置于含抑制劑帕博西尼的新鮮培養(yǎng)液，抑制劑梯度為0.5、1、2、5、10、20、50 μmol，從最低濃度0.5 μmol開(kāi)始，抑制劑處理細(xì)胞24 h后撤去含帕博西尼換新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞正常生長(zhǎng)后加入更高濃度的抑制劑進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)，反復(fù)傳代并使之穩(wěn)定，直到最高濃度50 μmol，最終得到耐受帕博西尼的混合克隆。用不含抑制劑的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)混合克隆14 d，使細(xì)胞恢復(fù)狀態(tài)，采用Promega CellTiter-Glo方法檢測(cè)帕博西尼對(duì)親代細(xì)胞和耐藥細(xì)胞混合克隆生長(zhǎng)抑制作用，計(jì)算IC50值和耐藥指數(shù)(RI)。當(dāng)混合克隆耐藥指數(shù)≥5 時(shí)，再進(jìn)行單克隆挑選。同法采用Promega CellTiter-Glo 方法檢測(cè)帕博西尼對(duì)耐藥細(xì)胞單克隆生長(zhǎng)抑制作用，計(jì)算IC50和耐藥指數(shù)。單克隆耐藥指數(shù)≥5 時(shí)，認(rèn)定耐藥細(xì)胞株構(gòu)建完成。本研究經(jīng)過(guò)10個(gè)月獲得了穩(wěn)定的人乳腺癌帕博西尼耐藥細(xì)胞株，命名為T(mén)47D-PalR(帕博西尼維持濃度為20 μmol)。所有實(shí)驗(yàn)均在停用帕博西尼抑制劑，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)兩周后取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行。

1.4.3 細(xì)胞藥物敏感度實(shí)驗(yàn)(CTG) 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期T47D和T47D-PalR細(xì)胞并采用血小板計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排斥法檢測(cè)細(xì)胞活力，確保細(xì)胞活力在90%以上。調(diào)整細(xì)胞濃度為5.55×103個(gè)/mL；分別添加180 μL 細(xì)胞懸液至96 孔板中，使細(xì)胞終密度為1 000 個(gè)/mL。將96 孔板中的細(xì)胞置于37℃、5%CO2、95% 濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。首先配制10×藥物溶液，最高濃度為100 μmol，9 個(gè)濃度，稀釋3.16 倍，實(shí)驗(yàn)時(shí)每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。在接種有細(xì)胞的96 孔板中每孔加入20 μL 梯度稀釋的10×藥物溶液，使藥物終濃度為最高濃度10 μmol，9 個(gè)濃度，3.16 倍稀釋。將已加藥處理的96 孔板置于37℃、5%CO2、95% 濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)10 d(中途補(bǔ)液)，后采用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega) )多功能讀板器上檢測(cè)暴露10 d后的細(xì)胞存活率。使用GraphPad Prism8.0軟件分析數(shù)據(jù)，利用非線性S 曲線回歸來(lái)擬合數(shù)據(jù)得出劑量-效應(yīng)曲線，并由此計(jì)算IC50值和耐藥指數(shù)。細(xì)胞存活率/=(Lum 待測(cè)藥-Lum 培養(yǎng)液對(duì)照)/(Lum 細(xì)胞對(duì)照-Lum 培養(yǎng)液對(duì)照)×100%；耐藥指數(shù)=抑制劑對(duì)耐藥細(xì)胞株生長(zhǎng)的半數(shù)抑制濃度/抑制劑對(duì)親代細(xì)胞株生長(zhǎng)的半數(shù)抑制濃度。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)耐藥基因表達(dá) 按照RNeazy Plus Mini Kit(250)(74136；QIAGEN)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，NanoDropND-2000 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA 的純度和濃度。按照Prime Script RT Master Mix(RR036A，TAKARA)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 擴(kuò)增操作說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR 擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37℃預(yù)變性15 min；85℃變性5 s，循環(huán)1 次；4℃無(wú)限循環(huán)。使用SYBR Green qPCR Mas?ter Mix 熒光定量qPCR 試劑盒(Thermo，A25742)進(jìn)行Real-time PCR，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火/延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，以GAPDH為內(nèi)參照，依據(jù)目的基因相對(duì)表達(dá)量RQ=2-△△Ct算法分析相關(guān)耐藥基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，各基因引物序列見(jiàn)表1。

1.4.5 免疫蛋白印跡檢測(cè) 采用RIPA 蛋白裂解液進(jìn)行細(xì)胞總蛋白的提取，并用Gold-BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒進(jìn)行總蛋白的濃度測(cè)定并對(duì)上清液進(jìn)行定量。將等量的蛋白質(zhì)樣品加入6×loading buffer 中，95℃煮沸10 min變性。將總蛋白在4%～12%的聚丙烯酰胺梯度預(yù)制膠(SDS-PAGE)進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳；待蛋白條帶跑到膠底部0.5 cm 處，停止電泳，然后轉(zhuǎn)印跡到PVDF 膜上。將目的蛋白條帶置于5%脫脂牛奶中4℃過(guò)夜或室溫2 h 封膜后，PBST 緩沖液洗滌3 次，每次5 min；之后進(jìn)行抗體一抗孵育4℃過(guò)夜或室溫2 h。次日洗膜后使用HRP 偶聯(lián)的二抗在室溫下于搖床上緩慢孵育1～2 h，PBST緩沖液洗滌3次，每次10 min；用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑(SuperSignal West Femto Maxi?mum Sensitivity Substrate, Thermo，34096；SuperSignal?West Atto ultra-sensitive substrate，A38555) 在Im?ageQuant ?LAS 4000 Image Analyzer (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden)上通過(guò)CCD 凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。使用ImageJ 軟件(1.8.0,USA)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS24.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗(yàn)；多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANO?VA)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察可見(jiàn)T47D 細(xì)胞呈多角形，形態(tài)較一致，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)均勻；T47D-PalR 細(xì)胞大小、形態(tài)均發(fā)生變化，體積明顯變小、觸角明顯增多，細(xì)胞更細(xì)長(zhǎng),向梭形轉(zhuǎn)變，且生長(zhǎng)相對(duì)松散，細(xì)胞內(nèi)尤其是近胞膜處有較多深色物質(zhì)聚集，見(jiàn)圖1。

2.2 T47D/T47D-PalR 細(xì)胞的耐藥程度及藥物敏感度分析T47D-PalR、T47D-PalR-clone 39# 細(xì)胞對(duì)palbociclib 的敏感性弱于其親本細(xì)胞T47D(P<0.05)；IC50分 別 為(0.069±0.022)μmol 和(4.281±0.204)μmol，均大于10 μmol；T47D-PalR、T47D-PalR-clone 39#對(duì)帕博西尼的RI 分別為62.0 及>144.9，屬高度耐藥,見(jiàn)圖2、表2。

表2 T47D細(xì)胞和T47D-PalR細(xì)胞及T47D-PalR-clone 39#對(duì)palbociclib的藥物敏感度（±s，n=3）

表2 T47D細(xì)胞和T47D-PalR細(xì)胞及T47D-PalR-clone 39#對(duì)palbociclib的藥物敏感度（±s，n=3）

注：與T47D比較，* P< 0.05。

cellline T47D T47D-PalR T47D-PalR-clone 39#IC50/μmol 0.069±0.022 4.281±0.204*>10 RI-62.0>144.9

2.3 T47D-PalR 乳腺癌耐藥細(xì)胞對(duì)CDK4/6 抑制劑的交叉耐藥性T47D 對(duì)Palbociclib、ribociclib、abe?maciclib 敏 感，IC50值 分 別 為(0.054±0.020) μmol、(0.145±0.050) μmol、(0.035±0.010) μmol；T47D-PalR對(duì)Palbociclib、ribociclib、abemaciclib 不敏感，IC50值分別為(4.281±0.167) μmol、>10 μmol、>10 μmol 耐藥指數(shù)RI分別為91.2、>69.0、>285.7，見(jiàn)圖3、表3。

圖3 不同濃度的CDK4/6抑制劑對(duì)T47D和T47D-PalR細(xì)胞的增殖抑制率影響

表3 T47D細(xì)胞和T47D-PalR細(xì)胞對(duì)3種CDK4/6抑制劑的IC50值及耐藥指數(shù)(±s)

表3 T47D細(xì)胞和T47D-PalR細(xì)胞對(duì)3種CDK4/6抑制劑的IC50值及耐藥指數(shù)(±s)

藥物帕博西尼瑞博西尼?，斘髂酙C50 (μmol)T47D 0.054±0.020 0.145±0.050 0.035±0.010 T47D-PalR 4.281±0.167>10>10耐藥指數(shù)91.2>69.0>285.7

2.4 T47D 和T47D-PalR 細(xì)胞中有關(guān)耐藥基因的mRNA 表達(dá)與T47D 細(xì)胞相比較，T47D-PalR 細(xì)胞的CDK2、CDK4、CDK6、E2F1、CCND1 等耐藥基因的相對(duì)表達(dá)量均有所升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05），其中CDK6 顯 著性高表達(dá)(P<0. 001)；Rb 的mRNA 表達(dá)在T47D 與T47D-PalR 中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 T47D和T47D-PalR細(xì)胞的基因譜表達(dá)分析

2.5 免疫蛋白印跡(Western-Blot) 檢測(cè)T47D 和T47D-PalR 細(xì)胞中有關(guān)耐藥基因的蛋白表達(dá)與T47D 比較，T47D-PalR 細(xì)胞中P-Rb、CDK4、CDK6、E2F1、CCND1等蛋白表達(dá)增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中CDK6 的蛋白表達(dá)顯著性升高(P<0.01)；CDK2與總的Rb蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5 T47D和T47D-PalR細(xì)胞中CDK2、CDK4、CDK6、E2F1、CCND1、P-Rb和Rb的蛋白表達(dá)

3 討論

帕博西尼是首個(gè)獲批的細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶4 和6(CDK4/6)抑制劑，與來(lái)曲唑聯(lián)合用于雌激素受體陽(yáng)性(ER+)、人表皮生長(zhǎng)因子受體2 陰性(HER2-)的婦女晚期乳腺癌[7]。目前，CDK4/6細(xì)胞周期激酶的小分子抑制劑已在雌激素受體(ER) 陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌中表現(xiàn)出了顯著的臨床療效，盡管它們的細(xì)胞抑制作用受到原發(fā)性和獲得性耐藥性的限制[8]。為了探討CDK4/6 抑制劑的獲得性抗性的機(jī)制，本研究采用帕博西尼低濃度梯度遞增法構(gòu)建了長(zhǎng)期暴露于CDK4/6 抑制劑帕博西尼(PD0332991) 的乳腺癌耐藥細(xì)胞株T47D-PalR。有學(xué)者認(rèn)為，耐藥指數(shù)小于5 為低度耐藥，耐藥指數(shù)5～15 為中度耐藥，耐藥指數(shù)大于15 屬于高度耐藥[9]。據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，T47D-PalR 細(xì)胞不僅耐藥性能穩(wěn)定，且屬于高度耐藥。此外，T47D還對(duì)其他CDK4/6 抑制劑瑞博西尼、?，斘髂峋哂薪徊婺退幮?，是探究CDK4/6 抑制劑耐藥機(jī)理以及藥物逆轉(zhuǎn)耐藥篩選的理想細(xì)胞模型。

激素受體陽(yáng)性乳腺癌的增殖依賴(lài)于細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶4 和6。CDK4 和CDK6 在細(xì)胞增殖中起關(guān)鍵作用，細(xì)胞周期蛋白D 是CDK4 和CDK6 激酶的調(diào)節(jié)劑。CDK4/6和細(xì)胞周期蛋白D 一起形成活性復(fù)合物，磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因(Rb)繼而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞進(jìn)入S期[10]。在體外，CDK4/6抑制劑有效地阻滯腫瘤細(xì)胞從G1 期進(jìn)展到S 期，防止ER 陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系的增殖[11]。 研究表明失調(diào)的細(xì)胞周期蛋白D1-CDK4/6 復(fù)合物在許多癌癥(包括乳腺癌)的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[12]。cyclin D-CDK4/6-RB 通路的失調(diào)導(dǎo)致增值異常，是乳腺癌發(fā)病機(jī)制的早期步驟[13]。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有研究報(bào)道，CDK4/6 抑制劑的耐藥機(jī)制包括細(xì)胞周期素(Cyclins) -CDKs 復(fù)合物增加、Cyclin-CDK4/6-P16-Rb 通路激活、腫瘤免疫微環(huán)境改變和腫瘤細(xì)胞適應(yīng)[14]。

在雌激素受體陽(yáng)性(ER＋)乳腺癌中，CDK4/6 激酶的失調(diào)激活是大多數(shù)乳腺癌的標(biāo)志。CDK4 的異常表達(dá)會(huì)激活細(xì)胞周期蛋白-CDK4/6-Rb 通路進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞耐藥[15]。Pancholi 等[16]的研究發(fā)現(xiàn)CDK4 的表達(dá)增加導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞對(duì)palbociclib 產(chǎn)生耐藥性。C Yang 等[17]研究發(fā)現(xiàn)獲得性CDK6 擴(kuò)增可以促進(jìn)乳腺癌對(duì)CDK4/6 抑制劑的耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞T47D-PalR 中，CDK4 和CDK6 的mRNA 及蛋白的表達(dá)均明顯升高，與上述研究一致，提示CDK4 或CDK6 的過(guò)表達(dá)是本研究中T47D-PalR 耐藥細(xì)胞對(duì)CDK4/6 抑制劑耐藥的主要機(jī)制。但CDK4、CDK6 的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致對(duì)CDK4/6 抑制劑耐藥的確切機(jī)制尚不清楚，亟待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

作為CDK4/6抑制劑的主要靶點(diǎn)，RB被認(rèn)為是治療敏感性最重要的生物標(biāo)志物之一，是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵檢查點(diǎn)[18]。E2F 是RB 的下游轉(zhuǎn)錄因子。細(xì)胞周期蛋白D-CDK4/6 對(duì)RB 的磷酸化釋放E2F，導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程所需的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄[19]。近15%的乳腺癌已檢測(cè)到細(xì)胞周期蛋白D2 基因及CCND1的擴(kuò)增，并且已確定在超過(guò)一半的原發(fā)性ER+ 乳腺癌，細(xì)胞周期蛋白D1 在mRNA 和蛋白質(zhì)上的表達(dá)上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期蛋白E-CDK2 復(fù)合物會(huì)磷酸化RB，釋放E2F 并促進(jìn)進(jìn)入S 期，CDK2 通路的過(guò)度激活介導(dǎo)了對(duì)CDK4/6 抑制劑的抗性[20]。另有報(bào)道，在高達(dá)50% 乳腺癌中發(fā)生了細(xì)胞周期蛋白D1 的過(guò)度表達(dá)，可進(jìn)一步導(dǎo)致Rb 蛋白的異常磷酸化和失活[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，T47D-PalR 耐藥后，CCND1、E2F1的mRNA 和蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，另外還包括CDK2的擴(kuò)增及Rb的磷酸化增強(qiáng)，提示Rb蛋白的異常磷酸化可能受CDK2 的異常表達(dá)和E2F1 的持續(xù)激活及CCND1 的過(guò)表達(dá)等多種因素的影響，而CCND1-CDK4/6-Rb-E2F1 的異常激活和CDK2 的擴(kuò)增與CDK4/6 抑制劑的抗性有關(guān)。

綜上所述，本研究通過(guò)選擇性CDK4/6 抑制劑帕博西尼低濃度梯度遞增成功構(gòu)建了穩(wěn)定耐受帕博西尼的人乳腺癌耐藥細(xì)胞株T47D-PalR，其形態(tài)與親本細(xì)胞T47D存在明顯差異，且耐藥性高，符合乳腺癌耐藥細(xì)胞的特征。本次研究結(jié)果表明，乳腺癌細(xì)胞對(duì)帕博西尼耐藥可能是一個(gè)多基因和多條通路共同參與的過(guò)程，CDK4 和CDK6 的CCND1、E2F1 水 平 是CDK4/6 抑制劑的潛在生物標(biāo)志物，并為進(jìn)一步研究CDK4/6 抑制劑耐藥的確切機(jī)制提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。