黃鶴，張念志

安徽省中醫(yī)院 安徽合肥 230031

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）簡(jiǎn)稱慢阻肺，是一種可以預(yù)防和治療的慢性氣道炎癥性疾病，氣流受限不完全可逆為其主要特征。慢阻肺臨床癥狀呈進(jìn)行性加重，以胸悶、氣喘，呼吸困難為主要表現(xiàn)。相關(guān)資料結(jié)果顯示COPD發(fā)病率有顯著地區(qū)差異。我國(guó)農(nóng)村地區(qū)人群中COPD的男性患病率明顯高于女性，部分欠發(fā)達(dá)地區(qū)患病率高達(dá)9.88%，給社會(huì)和家庭帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)[1]。

慢阻肺的炎癥反應(yīng)主要累及肺部及氣道。反復(fù)肺部感染，氣道炎細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致黏液高分泌，形成氣道的反復(fù)損傷和修復(fù)，最終導(dǎo)致氣道重塑[2]。氣道阻塞和結(jié)構(gòu)重塑會(huì)導(dǎo)致通氣功能障礙，造成機(jī)體慢性缺氧，引起相應(yīng)的病理生理學(xué)改變。肺血管在長(zhǎng)期缺氧或伴有CO2潴留條件下收縮明顯增強(qiáng)，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖凋亡均發(fā)生障礙，最終導(dǎo)致COPD相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓的產(chǎn)生。

ROCK1是廣泛存在于人體組織中RhoA/Rho 激酶信號(hào)通路上的一個(gè)重要信號(hào)分子。近年來相關(guān)學(xué)者已經(jīng)認(rèn)識(shí)到慢阻肺相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓與RhoA/Rho激酶信號(hào)通路密切相關(guān)[3-4]。因此本實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同人群外周血清ROCK1水平及其肺動(dòng)脈收縮壓，并探究?jī)烧咧g的相關(guān)性。

資料與方法

1 入組標(biāo)準(zhǔn)

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 COPD診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《2019慢性阻塞性肺疾病全球倡議》，具有相應(yīng)癥狀、體征及影像學(xué)特征的對(duì)象均在我院肺功能室行肺功能測(cè)定，檢查前一天均未使用任何支氣管擴(kuò)張劑及糖皮質(zhì)激素。吸入支氣管擴(kuò)張劑沙丁胺醇后，肺功能測(cè)定顯示 FEV1/FVC<70%才可診斷。

1.1.2 肺動(dòng)脈高壓診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2018年中國(guó)肺高血壓（Pulmonary hypertension PH）診斷和治療指南，靜息狀態(tài)下右心導(dǎo)管所測(cè)肺動(dòng)脈平均壓（mPAP）≥25mm Hg即可作出診斷。目前認(rèn)為mPAP=0.61×肺動(dòng)脈收縮壓（PASP）+2 mmHg，因此PASP≥40mm Hg 即可診斷為 PH[5]。本實(shí)驗(yàn)采用心臟彩超所估測(cè)肺動(dòng)脈收縮壓值作為診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 參照入組標(biāo)準(zhǔn)，入選45例分為3組，每組15例。A組為健康體檢者不伴有肺動(dòng)脈高壓 ，B、C兩組均為我科住院治療符合COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者，且 C組患者還符合心臟彩超診斷為肺動(dòng)脈高壓的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①除外近期使用過他汀類藥物[6]；②除外合并其他嚴(yán)重疾病如肝腎功能不全、腫瘤等疾病；③除外其他類疾病所致肺動(dòng)脈高壓，如結(jié)締組織疾病、先天性心臟病、心臟瓣膜病、左心疾病、胸廓畸形、肺血栓栓塞、睡眠呼吸障礙等疾病引起的肺高壓。

2 一般資料

選取同一時(shí)期在安徽省中醫(yī)院呼吸內(nèi)科住院治療或體檢中心體檢健康者共45例。參照入組標(biāo)準(zhǔn)，入選45例分為3組。A組15例為健康體檢者不伴有肺動(dòng)脈高壓，B組15例為單純COPD患者，C組15例為COPD并發(fā)肺動(dòng)脈高壓患者。

3 檢測(cè)方法

3.1 主要試劑與儀器 彩色多普勒超聲心動(dòng)圖儀；肺功能儀（德國(guó)耶格）；RT-6000酶標(biāo)儀（雷杜）；JW3021HR離心機(jī)（安徽嘉文）；DNP-9052BS-Ⅲ電熱恒溫箱（上海三發(fā)）；漩渦混合器；ROCK1 ELISA試劑盒（北京安迪華泰生物）。

3.2 肺功能檢查 采用我院現(xiàn)有德國(guó)耶格肺功能儀測(cè)定靜息狀態(tài)下吸入支氣管擴(kuò)張劑沙丁胺醇后一秒用力呼氣容積占用力肺活量的比值（FEV1/FVC%）。

3.3 PASP測(cè)定 所有45例入組者均經(jīng)我院心臟超聲測(cè)定其三尖瓣最大返流速度（V）。將經(jīng)檢測(cè)所得三尖瓣最大返流速度（V）代入簡(jiǎn)化的柏努利方程，即P=4V2，PASP=4V2＋右房壓。右房壓力值一般為5～10mmHg之間，最終計(jì)算得到估算的PASP值。目前臨床和相關(guān)研究證據(jù)均表明，心臟彩超估測(cè)肺高壓與右心導(dǎo)管檢測(cè)方式相比，不僅無創(chuàng)、檢測(cè)方便且檢查結(jié)果準(zhǔn)確性高[7]。

3.4 血清標(biāo)本的采集 收集45例入組對(duì)象空腹靜脈血，將其經(jīng)過3000r/min離心20min。抽取離心后的上清液1mL用于ROCK1的測(cè)定。

3.5 血清ROCK1的測(cè)定 ①標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，先在第1、2孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μL，再向其中加稀釋液50μL混勻；然后從第1、2孔中各取100μL加入第3、4孔，再在第3、4孔分別加稀釋液50μL混勻；然后從3、4孔中各取100μL，其中50μL棄之，剩余50μL分別加到第5、6孔中，再在第5、6六孔中加稀釋液50μL混勻；后孔依法同前，最終各孔稀釋后加樣量均為50μL，濃度分別為 180 pmol/L，120 pmol/L，60 pmol/L，30 pmol/L，15 pmol/L。②加樣：在酶標(biāo)包被板上分設(shè)待測(cè)樣品孔和空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）。先將10μL待測(cè)樣品加入待測(cè)樣品孔中，然后加入稀釋液，稀釋度為5倍，再將稀釋樣品加于酶標(biāo)板孔底部混勻。溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30min。配液：將濃縮洗滌液稀釋30倍后備用。洗滌：溫育后每孔棄去液體，甩干，用洗滌液再反復(fù)的洗板5次，拍干。加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外。再次溫育、洗滌。③顯色和終止：充分洗滌后，每孔加入TMB混合均勻后避光顯色15min，當(dāng)其變成藍(lán)色后向每孔加終止液，顏色由藍(lán)變黃表示反應(yīng)終止。

④測(cè)定和計(jì)算：加入終止液后立即以酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度（OD值），15min內(nèi)完成所有孔的測(cè)定，最后將各OD值代入方程式，計(jì)算得出數(shù)值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。3組性別構(gòu)成比采用卡方檢驗(yàn)。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。各指標(biāo)均進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布和方差齊性一致情況下，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，兩個(gè)隨機(jī)變量的相關(guān)關(guān)系采用Pearson直線相關(guān)分析。

結(jié) 果

1 3組研究對(duì)象血清ROCK1表達(dá)水平的比較

各組研究對(duì)象之間的年齡和性別組成無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），COPD 組肺動(dòng)脈收縮壓與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。COPD 并發(fā) PH組分別與另兩組相比，肺動(dòng)脈收縮壓顯著升高且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。COPD 組血清ROCK1與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），COPD 并發(fā)PH 組分別與另兩組相比，血清ROCK1顯著升高且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。見表1。

表1 3組研究對(duì)象一般資料及血清ROCK1表達(dá)水平比較

2 3組研究對(duì)象血清ROCK1表達(dá)與PASP的相關(guān)性分析

3組研究對(duì)象中血清ROCK1水平與肺動(dòng)脈收縮壓呈正相關(guān)（r=0.637，P<0.05），見圖 1。

圖1 血清ROCK1水平與PASP的相關(guān)性分析

討 論

隨著慢性阻塞性肺疾病的進(jìn)行性進(jìn)展，缺氧等因素使肺循環(huán)血管阻力不斷增高，右心室負(fù)荷不斷增加，進(jìn)而導(dǎo)致肺源性心臟病。肺心病已成為COPD患者三大并發(fā)癥之一，是COPD患者住院和病死的主要原因。

Rho/Rho 激酶信號(hào)通路廣泛存在于人體肺組織中，參與了肺部多種疾病的發(fā)生與發(fā)展，屬于多種肺部疾病如肺動(dòng)脈高壓、哮喘等疾病的重要研究對(duì)象。Rho蛋白又被稱為Rho GTP酶，其具有GTP酶活性，有 RhoA，RhoB，RhoC 三種異構(gòu)體，為信號(hào)通路上游的主要分子。Rho蛋白在上游通過與GTP或GDP之間結(jié)合的相互轉(zhuǎn)換來激活或失活信號(hào)通路中的下游分子Rho 激酶，進(jìn)而引起下游底物產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)。Rho激酶（Rho-associated kinase）又稱ROCK，屬蘇氨酸／絲氨酸蛋白激酶家族一員，其有ROCK1（ROKβ，p160-ROCK）和ROCK2 （ROKα）兩個(gè)亞型[8]。ROCK1和ROCK2亞型在體內(nèi)有不同的器官分布與表達(dá)，ROCK1主要在肺臟、肝臟及骨骼肌中分布表達(dá)，而ROCK2在腦、與肌肉中表達(dá)更高[9]。ROCK分子質(zhì)量大約160 kD，其氨基酸序列由 N端的催化結(jié)構(gòu)域、盤旋螺旋域，PH結(jié)構(gòu)域成，其中盤旋螺旋域中含Rho結(jié)合域[10]。

目前已經(jīng)知道肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP）、肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）決定著肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化的水平，而肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化水平的高低又是決定肺血管收縮的關(guān)鍵因素，與肺動(dòng)脈高壓的產(chǎn)生密切相關(guān)[11]。Rho/Rho 激酶信號(hào)通路通過活化的Rho激酶，進(jìn)而通過其鈣敏感性調(diào)節(jié)這一途徑調(diào)節(jié)MLC磷酸化水平?；罨腞ho激酶既可直接使MLC上兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化；同時(shí)Rho激酶與其在肌球蛋白輕鏈磷酸酶的靶亞基 1 （MYPT1）上的Thr850相結(jié)合，使其磷酸化，導(dǎo)致 MLCP失活，失活的MLCP不能使磷酸化的MLC脫磷酸化，間接提升了細(xì)胞漿內(nèi)MLC磷酸化水平，增加肌動(dòng)－肌球蛋白交聯(lián)而促進(jìn)肌絲收縮。

本研究分別選取經(jīng)心臟超聲測(cè)定的肺動(dòng)脈收縮壓和人血清Rho激酶作為觀察指標(biāo)，PASP值的大小可直接反映著肺血管壓力的高低，后者其值高低反映Rho/Rho 激酶信號(hào)通路的激活。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明慢阻肺并發(fā)肺高血壓患者血清Rho激酶表達(dá)較單純慢阻肺患者及正常人明顯升高，且PASP值與其ROCK1水平呈正相關(guān)性。慢阻肺患者肺高血壓的發(fā)生發(fā)展可能與Rho/Rho 激酶信號(hào)通路激活密切相關(guān)。但本臨床實(shí)驗(yàn)入組總樣本量偏少，且未檢測(cè)Rho激酶信號(hào)通路中上下游信號(hào)分子，今后在臨床上能否通過檢測(cè)慢阻肺患者血清ROCK1來評(píng)估肺動(dòng)脈高壓的嚴(yán)重程度仍需大樣本、多中心研究數(shù)據(jù)提供更多證據(jù)。