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        海藻酸鹽/分離乳清蛋白/海藻糖復(fù)合保護(hù)劑提高益生菌活力探究

        2021-11-24 09:47:52盧宗梅邴狄祥郭世堂陳可泉
        現(xiàn)代食品 2021年19期
        關(guān)鍵詞:保護(hù)劑酸鹽乳清

        ◎ 萬(wàn) 欣,周 勇,盧宗梅,邴狄祥,郭世堂,葉 震,何 珣,陳可泉

        (1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 211816;2.中糧生物科技股份有限公司,安徽 蚌埠 233000)

        植物乳桿菌常被加工成益生菌劑,預(yù)防和治療胃腸道疾病,如腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎和腹瀉病[1]。在益生菌劑的制備過(guò)程中,植物乳桿菌通常通過(guò)冷凍干燥被干燥成粉末,而冷凍干燥會(huì)花費(fèi)大量的時(shí)間和精力。與冷凍干燥相比,噴霧干燥時(shí)間更短、能耗更低、成本更低,更適合工業(yè)化生產(chǎn)[2]。益生菌劑在噴霧干燥過(guò)程中,高溫干燥脫水會(huì)降低益生菌的活力。高溫會(huì)破壞蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu),破壞單體單元之間的連接,最終導(dǎo)致單體單元的破壞。干脫水會(huì)改變細(xì)胞質(zhì)膜的流動(dòng)性和物理狀態(tài),導(dǎo)致代謝活動(dòng)降低[3-4]。不利的環(huán)境條件,如酸、熱、壓力和氧氣,也將導(dǎo)致益生菌的細(xì)胞活力顯著下降[5]。保護(hù)劑在保護(hù)益生菌免受不利條件影響,以及干燥后長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存方面起著至關(guān)重要的作用[5]。乳清蛋白(WP)是奶酪生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)品,占乳蛋白總量的20%,具有出色的膠凝和成膜特性[6]。植物乳桿菌用乳清蛋白和支鏈淀粉包埋,噴霧干燥獲得的活菌數(shù)可以達(dá)到7.24 log CFU·g-1[7]。本文以海藻酸鹽、分離乳清蛋白、海藻糖為保護(hù)劑,提高噴霧干燥后植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的活菌數(shù),優(yōu)化保護(hù)劑配比和噴霧干燥參數(shù)。此外,在儲(chǔ)存過(guò)程中評(píng)估了菌劑的最佳儲(chǔ)存溫度。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013,由中糧生物科技股份有限公司提供;分離乳清蛋白,購(gòu)自南京通盈生物科技有限公司;其他化學(xué)品,均為國(guó)藥分析級(jí)試劑。

        1.2 植物乳桿菌懸浮液的制備

        植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013接種于MRS培養(yǎng)基中,37 ℃條件下培養(yǎng)18 h;通過(guò)在3 000 r·min-1條件下離心10 min、4 ℃收集細(xì)胞并用無(wú)菌氯化鈉溶液0.85%(w/v)洗滌兩次。通過(guò)將細(xì)胞重懸在氯化鈉溶液中并在4 ℃下儲(chǔ)存,獲得細(xì)胞懸浮液。

        1.3 保護(hù)劑的制備及噴霧干燥工藝

        將海藻酸鹽、分離乳清蛋白、海藻糖用蒸餾水溶解制備保護(hù)劑溶液,并優(yōu)化配比。在室溫下將保護(hù)劑與Lactobacillus plantarumCGMCC 15013懸浮液混合?;旌先芤和ㄟ^(guò)噴霧干燥器(SD-1500,Triowin,上海,中國(guó))進(jìn)行噴霧干燥。優(yōu)化了Lactobacillus plantarumCGMCC 15013與保護(hù)劑的比例、進(jìn)氣溫度和進(jìn)料流速。最后,收集干燥的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013發(fā)酵劑。

        1.4 保護(hù)劑配比優(yōu)化

        1.4.1 單因素測(cè)試

        進(jìn)行單因素檢驗(yàn)主要是為了評(píng)估海藻酸鹽、分離乳清蛋白、海藻糖對(duì)Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活菌數(shù)的影響,并確定它們適用于響應(yīng)面法(RSM)的范圍。在此過(guò)程中,Lactobacillus plantarumCGMCC 15013與保護(hù)劑的比例為1∶1(v∶v),進(jìn)料流速為300 mL·h-1,進(jìn)風(fēng)溫度為120 ℃。

        1.4.2 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

        海藻酸鹽(A)、分離乳清蛋白(B)、海藻糖(C)、蔗糖(D)的最佳范圍是基于單因素測(cè)試確定的。基于3個(gè)水平的4個(gè)主要因素的Box-Behnken設(shè)計(jì)用于探索保護(hù)劑的最佳比例以及這些變量的相互作用。整個(gè)設(shè)計(jì)包括29個(gè)實(shí)驗(yàn),3個(gè)重復(fù)。因子及水平見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、圖形構(gòu)建和結(jié)果分析由Design of Expert(DOE Version 8.5, StatEase. Inc, Minneapolis,MN. USA)進(jìn)行。計(jì)算回歸方程,分析等高線圖和3D曲面圖,得到各變量的最優(yōu)值。

        表1 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參數(shù)表(單位:g·L-1)

        1.5 噴霧干燥參數(shù)優(yōu)化

        1.5.1 單因素測(cè)試

        進(jìn)行單因素試驗(yàn)主要是為了評(píng)估細(xì)菌與保護(hù)劑的比例、進(jìn)料流量,以及植物乳桿菌活菌數(shù)的入口空氣溫度,并確定其適合正交試驗(yàn)的范圍。保護(hù)劑由25.3 g·L-1海藻酸鹽、87.8 g·L-1分離乳清蛋白、15.9 g·L-1海藻糖和150.3 g·L-1蔗糖組成。

        1.5.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,確定了細(xì)菌與保護(hù)劑的比例(A)、進(jìn)料流速(B)和溫度(C)的最佳范圍。形成4因素3水平正交試驗(yàn)以?xún)?yōu)化噴霧干燥參數(shù)。表2顯示了正交試驗(yàn)參數(shù)。每個(gè)處理一式3份進(jìn)行。

        表2 正交試驗(yàn)中的因素和水平表

        1.6 發(fā)酵劑中植物乳桿菌的存活率

        噴霧干燥前后植物乳桿菌的活菌數(shù)通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法一式3份測(cè)定。將1.0 gLactobacillus plantarumCGMCC 15013溶解在9 mL檸檬酸三鈉溶液(3%,w/v)中,將懸浮液用0.85%鹽水溶液連續(xù)稀釋10倍,并涂在MRS瓊脂上。計(jì)數(shù)前將平板在37 ℃孵育48 h。

        1.7 儲(chǔ)存期間植物乳桿菌在發(fā)酵劑中的生存力

        植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在-20 ℃、4 ℃和25 ℃下可保存120 d,計(jì)算植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的活菌數(shù)。所有實(shí)驗(yàn)一式3份進(jìn)行,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用SPSS 16.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)來(lái)分析統(tǒng)計(jì)顯著性。當(dāng)p<0.05時(shí),假設(shè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 保護(hù)劑配比優(yōu)化

        保護(hù)劑比例采用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行分析。在這項(xiàng)研究中,海藻酸鹽(A)、分離乳清蛋白(B)、海藻糖(C)、蔗糖(D)的不同組合進(jìn)行了29次,每個(gè)實(shí)驗(yàn)一式3份進(jìn)行,結(jié)果如表3所示。通過(guò)軟件分析得到基于實(shí)驗(yàn)因素的回歸方程如下:

        表3 保護(hù)劑的方差分析表(ANOVA)

        模型的F值為31.70,p<0.000 1,表明模型穩(wěn)定且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣地,報(bào)告了A、B、C、D、AB、AC、AD、BC、BD、CD、A2、B2、C2和D2。修正系數(shù)R2計(jì)算為0.938 8,通過(guò)實(shí)驗(yàn)參數(shù)及其相互作用來(lái)解釋響應(yīng)值的變異性,暗示該模型可以解釋93.88%的變異。本實(shí)驗(yàn)得到的調(diào)整系數(shù)R2與相關(guān)系數(shù)R2的差異在邏輯上是可以接受的。因此,該模型適用于分析和預(yù)測(cè)保護(hù)劑的最佳配比。

        2.2 響應(yīng)曲面和等高線圖

        在研究中,使用海藻酸鹽、分離乳清蛋白、海藻糖和蔗糖作為植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的噴霧干燥保護(hù)劑,并通過(guò)RSM優(yōu)化它們的比例,見(jiàn)圖1。

        圖1 響應(yīng)曲面和等高線圖

        響應(yīng)曲面圖的曲線特性顯示了變量和響應(yīng)值之間的相互作用[8]。圖1(a)中的橢圓形顯示了海藻酸鹽、分離乳清蛋白對(duì)提高植物乳桿菌細(xì)胞活力的顯著影響。在低濃度下,活菌數(shù)隨著海藻酸鹽、分離乳清蛋白的加入而增加;圖1(b)顯示了海藻酸鹽、海藻糖之間的顯著相互作用;圖1(c)中的橢圓形狀顯示了分離乳清蛋白和蔗糖在響應(yīng)值方面的顯著相互作用。隨著分離乳清蛋白和蔗糖濃度的增加,植物乳桿菌的活菌數(shù)增加,還發(fā)現(xiàn)海藻糖和蔗糖之間的相互作用提高了菌活力,如圖1(d)所示。分離乳清蛋白與海藻糖、海藻酸鹽與蔗糖之間的相互作用分別如圖1中(e)、(f)所示。

        海藻糖具有穩(wěn)定的功效和優(yōu)異的加工性能,可在干燥過(guò)程中用作賦形劑以穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。海藻糖具有高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度,可以通過(guò)形成玻璃結(jié)構(gòu)來(lái)限制分子間的相互作用[8]。此外,海藻糖可以被作為益生元來(lái)提高微生物細(xì)胞對(duì)不利環(huán)境條件的適應(yīng)性,提高微生物細(xì)胞存活率[9]。研究表明,海藻糖是一種極好的噴霧干燥保護(hù)劑。在噴霧干燥過(guò)程中,水分的流失會(huì)導(dǎo)致植物乳桿菌的活菌數(shù)顯著減少。此外,研究表明蔗糖還可以防止環(huán)境對(duì)微生物細(xì)胞膜的不可逆損傷[10]。

        2.3 最佳條件的確定和驗(yàn)證

        根據(jù)RSM,海藻酸鹽、分離乳清蛋白、海藻糖和 蔗 糖 分別為39.09 g·L-1、88.56 g·L-1、14.01 g·L-1和127.70 g·L-1,作為最佳噴霧干燥保護(hù)劑的最理想濃度,在這些預(yù)測(cè)條件下,植物乳桿菌的活菌率為75.68%。為了驗(yàn)證優(yōu)化的工藝參數(shù),基于建議的模型進(jìn)行了3個(gè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),植物乳桿菌的活菌率為75.11%。3個(gè)試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)平均值與預(yù)測(cè)值非常吻合,它們的差異在可接受的范圍內(nèi)。本文較高的活菌率表明植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013受到海藻酸鹽、分離乳清蛋白、海藻糖和蔗糖作為保護(hù)劑的有效保護(hù)。

        2.4 噴霧干燥參數(shù)優(yōu)化

        設(shè)計(jì)微生物細(xì)胞與保護(hù)劑比例分別為2∶1、3∶1和4∶1(v∶v),進(jìn)料流速分別為210 mL·h-1、240 mL·h-1和300 mL·h-1,進(jìn)風(fēng)溫度分別為110 ℃、115 ℃和120 ℃,進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)用于優(yōu)化噴霧干燥參數(shù)。通過(guò)正交L9(34)測(cè)試設(shè)計(jì)評(píng)估了3個(gè)因素,如表4所示。結(jié)果表明,這些因素對(duì)植物乳桿菌活菌數(shù)的影響程度依次為:溫度(C)>微生物細(xì)胞與保護(hù)劑的比例(A)>進(jìn)料流速(B)。由均值分析可知,理論最佳噴霧干燥植物乳桿菌活菌數(shù)的參數(shù)是細(xì)菌與保護(hù)劑的比例3∶1(v∶v),進(jìn)料流速240 mL·h-1,進(jìn)氣溫度115 ℃(A2B2C2)。植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活 菌 數(shù) 為9.24 log CFU·g-1(活 菌 率78.12%),含水量為4.33%?;罹鷶?shù)小于正交試驗(yàn)最佳參數(shù)A2B1C2的9.38 log CFU·g-1(活菌率79.28%),因此確定實(shí)際最佳噴霧干燥參數(shù)為細(xì)菌與保護(hù)劑的比例3∶1(v∶v),進(jìn)料流量 200 mL·h-1,進(jìn)風(fēng)溫度115 ℃。本研究中使用的保護(hù)劑比例和噴霧干燥工藝參數(shù)可以保護(hù)植物乳桿菌更好。

        表4 正交試驗(yàn)的結(jié)果和分析表

        2.5 植物乳桿菌儲(chǔ)存期間的穩(wěn)定性

        微生物菌劑的儲(chǔ)存期主要由儲(chǔ)存溫度決定。在低溫下,微生物細(xì)胞更易于保持活性。本研究中,植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在-20 ℃、4 ℃和25 ℃的貯藏條件下,活菌數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降,見(jiàn)圖2。不同的儲(chǔ)存溫度之間存在顯著差異。植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在25 ℃貯藏時(shí),生存力受到最嚴(yán)重的損害。植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在25 ℃下90 d后完全喪失生存力。在-20 ℃和4 ℃下保存120 d后,活菌數(shù)分別為8.38 log CFU·g-1和6.66 log CFU·g-1,-20 ℃為植物乳桿菌菌劑的最適保存溫度。

        圖2 植物乳桿菌Lactobacillus plantarum CGMCC 15013在儲(chǔ)存期間的活菌數(shù)量變化圖

        3 結(jié)論

        植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的最佳保護(hù)劑配比為39.09 g·L-1海藻酸鹽、88.56 g·L-1分離乳清蛋白、14.01 g·L-1海藻糖和127.70 g·L-1蔗糖。植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013菌劑的最佳噴霧干燥參數(shù)為細(xì)菌與保護(hù)劑的比例3∶1(v∶v),進(jìn)料流速200 mL·h-1,進(jìn)風(fēng)溫度115 ℃,植物乳桿菌最大活菌數(shù)9.38 log(CFU·g-1),活菌率79.28%。植物乳桿菌發(fā)酵劑在-20 ℃下儲(chǔ)存120 d后,發(fā)酵劑中植物乳桿菌的活菌數(shù)為8.38 log CFU·g-1。本研究為噴霧干燥貯藏后的植物乳桿菌提供了一種新的保護(hù)劑配方,具有很好的保護(hù)作用。該保護(hù)劑對(duì)益生菌劑生產(chǎn)具有重要意義。

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