◎ 萬(wàn) 欣，周 勇，盧宗梅，邴狄祥，郭世堂，葉 震，何 珣，陳可泉

（1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211816；2.中糧生物科技股份有限公司，安徽 蚌埠 233000）

植物乳桿菌常被加工成益生菌劑，預(yù)防和治療胃腸道疾病，如腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎和腹瀉病[1]。在益生菌劑的制備過(guò)程中，植物乳桿菌通常通過(guò)冷凍干燥被干燥成粉末，而冷凍干燥會(huì)花費(fèi)大量的時(shí)間和精力。與冷凍干燥相比，噴霧干燥時(shí)間更短、能耗更低、成本更低，更適合工業(yè)化生產(chǎn)[2]。益生菌劑在噴霧干燥過(guò)程中，高溫干燥脫水會(huì)降低益生菌的活力。高溫會(huì)破壞蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，破壞單體單元之間的連接，最終導(dǎo)致單體單元的破壞。干脫水會(huì)改變細(xì)胞質(zhì)膜的流動(dòng)性和物理狀態(tài)，導(dǎo)致代謝活動(dòng)降低[3-4]。不利的環(huán)境條件，如酸、熱、壓力和氧氣，也將導(dǎo)致益生菌的細(xì)胞活力顯著下降[5]。保護(hù)劑在保護(hù)益生菌免受不利條件影響，以及干燥后長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存方面起著至關(guān)重要的作用[5]。乳清蛋白（WP）是奶酪生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)品，占乳蛋白總量的20%，具有出色的膠凝和成膜特性[6]。植物乳桿菌用乳清蛋白和支鏈淀粉包埋，噴霧干燥獲得的活菌數(shù)可以達(dá)到7.24 log CFU·g-1[7]。本文以海藻酸鹽、分離乳清蛋白、海藻糖為保護(hù)劑，提高噴霧干燥后植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的活菌數(shù)，優(yōu)化保護(hù)劑配比和噴霧干燥參數(shù)。此外，在儲(chǔ)存過(guò)程中評(píng)估了菌劑的最佳儲(chǔ)存溫度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013，由中糧生物科技股份有限公司提供；分離乳清蛋白，購(gòu)自南京通盈生物科技有限公司；其他化學(xué)品，均為國(guó)藥分析級(jí)試劑。

1.2 植物乳桿菌懸浮液的制備

植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)18 h；通過(guò)在3 000 r·min-1條件下離心10 min、4 ℃收集細(xì)胞并用無(wú)菌氯化鈉溶液0.85%（w/v）洗滌兩次。通過(guò)將細(xì)胞重懸在氯化鈉溶液中并在4 ℃下儲(chǔ)存，獲得細(xì)胞懸浮液。

1.3 保護(hù)劑的制備及噴霧干燥工藝

將海藻酸鹽、分離乳清蛋白、海藻糖用蒸餾水溶解制備保護(hù)劑溶液，并優(yōu)化配比。在室溫下將保護(hù)劑與Lactobacillus plantarumCGMCC 15013懸浮液混合?；旌先芤和ㄟ^(guò)噴霧干燥器（SD-1500，Triowin，上海，中國(guó)）進(jìn)行噴霧干燥。優(yōu)化了Lactobacillus plantarumCGMCC 15013與保護(hù)劑的比例、進(jìn)氣溫度和進(jìn)料流速。最后，收集干燥的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013發(fā)酵劑。

1.4 保護(hù)劑配比優(yōu)化

1.4.1 單因素測(cè)試

進(jìn)行單因素檢驗(yàn)主要是為了評(píng)估海藻酸鹽、分離乳清蛋白、海藻糖對(duì)Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活菌數(shù)的影響，并確定它們適用于響應(yīng)面法（RSM）的范圍。在此過(guò)程中，Lactobacillus plantarumCGMCC 15013與保護(hù)劑的比例為1∶1（v∶v），進(jìn)料流速為300 mL·h-1，進(jìn)風(fēng)溫度為120 ℃。

1.4.2 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

海藻酸鹽（A）、分離乳清蛋白（B）、海藻糖（C）、蔗糖（D）的最佳范圍是基于單因素測(cè)試確定的。基于3個(gè)水平的4個(gè)主要因素的Box-Behnken設(shè)計(jì)用于探索保護(hù)劑的最佳比例以及這些變量的相互作用。整個(gè)設(shè)計(jì)包括29個(gè)實(shí)驗(yàn)，3個(gè)重復(fù)。因子及水平見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、圖形構(gòu)建和結(jié)果分析由Design of Expert（DOE Version 8.5, StatEase. Inc, Minneapolis,MN. USA）進(jìn)行。計(jì)算回歸方程，分析等高線圖和3D曲面圖，得到各變量的最優(yōu)值。

表1 Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參數(shù)表（單位：g·L-1）

1.5 噴霧干燥參數(shù)優(yōu)化

1.5.1 單因素測(cè)試

進(jìn)行單因素試驗(yàn)主要是為了評(píng)估細(xì)菌與保護(hù)劑的比例、進(jìn)料流量，以及植物乳桿菌活菌數(shù)的入口空氣溫度，并確定其適合正交試驗(yàn)的范圍。保護(hù)劑由25.3 g·L-1海藻酸鹽、87.8 g·L-1分離乳清蛋白、15.9 g·L-1海藻糖和150.3 g·L-1蔗糖組成。

1.5.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定了細(xì)菌與保護(hù)劑的比例（A）、進(jìn)料流速（B）和溫度（C）的最佳范圍。形成4因素3水平正交試驗(yàn)以?xún)?yōu)化噴霧干燥參數(shù)。表2顯示了正交試驗(yàn)參數(shù)。每個(gè)處理一式3份進(jìn)行。

表2 正交試驗(yàn)中的因素和水平表

1.6 發(fā)酵劑中植物乳桿菌的存活率

噴霧干燥前后植物乳桿菌的活菌數(shù)通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法一式3份測(cè)定。將1.0 gLactobacillus plantarumCGMCC 15013溶解在9 mL檸檬酸三鈉溶液（3%，w/v）中，將懸浮液用0.85%鹽水溶液連續(xù)稀釋10倍，并涂在MRS瓊脂上。計(jì)數(shù)前將平板在37 ℃孵育48 h。

1.7 儲(chǔ)存期間植物乳桿菌在發(fā)酵劑中的生存力

植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在-20 ℃、4 ℃和25 ℃下可保存120 d，計(jì)算植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的活菌數(shù)。所有實(shí)驗(yàn)一式3份進(jìn)行，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用SPSS 16.0（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）來(lái)分析統(tǒng)計(jì)顯著性。當(dāng)p＜0.05時(shí)，假設(shè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 保護(hù)劑配比優(yōu)化

保護(hù)劑比例采用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行分析。在這項(xiàng)研究中，海藻酸鹽（A）、分離乳清蛋白（B）、海藻糖（C）、蔗糖（D）的不同組合進(jìn)行了29次，每個(gè)實(shí)驗(yàn)一式3份進(jìn)行，結(jié)果如表3所示。通過(guò)軟件分析得到基于實(shí)驗(yàn)因素的回歸方程如下：

表3 保護(hù)劑的方差分析表（ANOVA）

模型的F值為31.70，p＜0.000 1，表明模型穩(wěn)定且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同樣地，報(bào)告了A、B、C、D、AB、AC、AD、BC、BD、CD、A2、B2、C2和D2。修正系數(shù)R2計(jì)算為0.938 8，通過(guò)實(shí)驗(yàn)參數(shù)及其相互作用來(lái)解釋響應(yīng)值的變異性，暗示該模型可以解釋93.88%的變異。本實(shí)驗(yàn)得到的調(diào)整系數(shù)R2與相關(guān)系數(shù)R2的差異在邏輯上是可以接受的。因此，該模型適用于分析和預(yù)測(cè)保護(hù)劑的最佳配比。

2.2 響應(yīng)曲面和等高線圖

在研究中，使用海藻酸鹽、分離乳清蛋白、海藻糖和蔗糖作為植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的噴霧干燥保護(hù)劑，并通過(guò)RSM優(yōu)化它們的比例，見(jiàn)圖1。

圖1 響應(yīng)曲面和等高線圖

響應(yīng)曲面圖的曲線特性顯示了變量和響應(yīng)值之間的相互作用[8]。圖1（a）中的橢圓形顯示了海藻酸鹽、分離乳清蛋白對(duì)提高植物乳桿菌細(xì)胞活力的顯著影響。在低濃度下，活菌數(shù)隨著海藻酸鹽、分離乳清蛋白的加入而增加；圖1（b）顯示了海藻酸鹽、海藻糖之間的顯著相互作用；圖1（c）中的橢圓形狀顯示了分離乳清蛋白和蔗糖在響應(yīng)值方面的顯著相互作用。隨著分離乳清蛋白和蔗糖濃度的增加，植物乳桿菌的活菌數(shù)增加，還發(fā)現(xiàn)海藻糖和蔗糖之間的相互作用提高了菌活力，如圖1（d）所示。分離乳清蛋白與海藻糖、海藻酸鹽與蔗糖之間的相互作用分別如圖1中（e）、（f）所示。

海藻糖具有穩(wěn)定的功效和優(yōu)異的加工性能，可在干燥過(guò)程中用作賦形劑以穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。海藻糖具有高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，可以通過(guò)形成玻璃結(jié)構(gòu)來(lái)限制分子間的相互作用[8]。此外，海藻糖可以被作為益生元來(lái)提高微生物細(xì)胞對(duì)不利環(huán)境條件的適應(yīng)性，提高微生物細(xì)胞存活率[9]。研究表明，海藻糖是一種極好的噴霧干燥保護(hù)劑。在噴霧干燥過(guò)程中，水分的流失會(huì)導(dǎo)致植物乳桿菌的活菌數(shù)顯著減少。此外，研究表明蔗糖還可以防止環(huán)境對(duì)微生物細(xì)胞膜的不可逆損傷[10]。

2.3 最佳條件的確定和驗(yàn)證

根據(jù)RSM，海藻酸鹽、分離乳清蛋白、海藻糖和 蔗 糖 分別為39.09 g·L-1、88.56 g·L-1、14.01 g·L-1和127.70 g·L-1，作為最佳噴霧干燥保護(hù)劑的最理想濃度，在這些預(yù)測(cè)條件下，植物乳桿菌的活菌率為75.68%。為了驗(yàn)證優(yōu)化的工藝參數(shù)，基于建議的模型進(jìn)行了3個(gè)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，植物乳桿菌的活菌率為75.11%。3個(gè)試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)平均值與預(yù)測(cè)值非常吻合，它們的差異在可接受的范圍內(nèi)。本文較高的活菌率表明植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013受到海藻酸鹽、分離乳清蛋白、海藻糖和蔗糖作為保護(hù)劑的有效保護(hù)。

2.4 噴霧干燥參數(shù)優(yōu)化

設(shè)計(jì)微生物細(xì)胞與保護(hù)劑比例分別為2∶1、3∶1和4∶1（v∶v），進(jìn)料流速分別為210 mL·h-1、240 mL·h-1和300 mL·h-1，進(jìn)風(fēng)溫度分別為110 ℃、115 ℃和120 ℃，進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)用于優(yōu)化噴霧干燥參數(shù)。通過(guò)正交L9(34)測(cè)試設(shè)計(jì)評(píng)估了3個(gè)因素，如表4所示。結(jié)果表明，這些因素對(duì)植物乳桿菌活菌數(shù)的影響程度依次為：溫度（C）＞微生物細(xì)胞與保護(hù)劑的比例（A）＞進(jìn)料流速（B）。由均值分析可知，理論最佳噴霧干燥植物乳桿菌活菌數(shù)的參數(shù)是細(xì)菌與保護(hù)劑的比例3∶1（v∶v），進(jìn)料流速240 mL·h-1，進(jìn)氣溫度115 ℃（A2B2C2）。植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活 菌 數(shù) 為9.24 log CFU·g-1（活 菌 率78.12%），含水量為4.33%?；罹鷶?shù)小于正交試驗(yàn)最佳參數(shù)A2B1C2的9.38 log CFU·g-1（活菌率79.28%），因此確定實(shí)際最佳噴霧干燥參數(shù)為細(xì)菌與保護(hù)劑的比例3∶1（v∶v），進(jìn)料流量 200 mL·h-1，進(jìn)風(fēng)溫度115 ℃。本研究中使用的保護(hù)劑比例和噴霧干燥工藝參數(shù)可以保護(hù)植物乳桿菌更好。

表4 正交試驗(yàn)的結(jié)果和分析表

2.5 植物乳桿菌儲(chǔ)存期間的穩(wěn)定性

微生物菌劑的儲(chǔ)存期主要由儲(chǔ)存溫度決定。在低溫下，微生物細(xì)胞更易于保持活性。本研究中，植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在-20 ℃、4 ℃和25 ℃的貯藏條件下，活菌數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降，見(jiàn)圖2。不同的儲(chǔ)存溫度之間存在顯著差異。植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在25 ℃貯藏時(shí)，生存力受到最嚴(yán)重的損害。植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在25 ℃下90 d后完全喪失生存力。在-20 ℃和4 ℃下保存120 d后，活菌數(shù)分別為8.38 log CFU·g-1和6.66 log CFU·g-1，-20 ℃為植物乳桿菌菌劑的最適保存溫度。

圖2 植物乳桿菌Lactobacillus plantarum CGMCC 15013在儲(chǔ)存期間的活菌數(shù)量變化圖

3 結(jié)論

植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的最佳保護(hù)劑配比為39.09 g·L-1海藻酸鹽、88.56 g·L-1分離乳清蛋白、14.01 g·L-1海藻糖和127.70 g·L-1蔗糖。植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013菌劑的最佳噴霧干燥參數(shù)為細(xì)菌與保護(hù)劑的比例3∶1（v∶v），進(jìn)料流速200 mL·h-1，進(jìn)風(fēng)溫度115 ℃，植物乳桿菌最大活菌數(shù)9.38 log（CFU·g-1），活菌率79.28%。植物乳桿菌發(fā)酵劑在-20 ℃下儲(chǔ)存120 d后，發(fā)酵劑中植物乳桿菌的活菌數(shù)為8.38 log CFU·g-1。本研究為噴霧干燥貯藏后的植物乳桿菌提供了一種新的保護(hù)劑配方，具有很好的保護(hù)作用。該保護(hù)劑對(duì)益生菌劑生產(chǎn)具有重要意義。