張文華, 洪 燈, 雷美康, 胡曉莉, 侯建波, 謝 文, 徐敦明, 伊雄海, 李 優(yōu)

(1. 杭州海關技術中心, 浙江 杭州 310016; 2. 浙江省檢驗檢疫科學技術研究院, 浙江 杭州 310016; 3. 廈門海關技術中心, 福建 廈門 361026; 4. 上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心, 上海 200135)

克倫特羅(clenbuterol),化學名為1-(4-氨基-3,5-二氯苯基)-2-(叔丁基-D9-氨基)乙醇,是一種選擇性β2-腎上腺素受體激動劑,臨床上主要作為支氣管解痙藥物,對支氣管哮喘和伴有可逆性氣道阻塞的慢性支氣管炎均有良好效果[1]。臨床上使用的β2腎上腺受體類激動劑藥物為克倫特羅的外消旋體[2],其分子中含有1個手性碳原子[3],存在一對對映體,包括(+)-克倫特羅對映體和(-)-克倫特羅對映體(見圖1)。據(jù)文獻[4,5]報道,不同結構對映體將會產(chǎn)生不同的藥理活性。研究發(fā)現(xiàn),克倫特羅外消旋體中不同結構對映體之間的生物活性差異較大,其中(-)-克倫特羅在臨床上有療效,而(+)-克倫特羅則無療效,故對克倫特羅的手性分離具有重要意義[6,7]。為了進一步研究克倫特羅對映體之間的生物活性差異,迫切需要建立一種克倫特羅對映體的高效分離方法。

圖 1 克倫特羅兩種對映體的結構式Fig. 1 Chemical structures of two clenbuterol enantiomers

目前克倫特羅對映體的檢測方法主要為高效液相色譜法(HPLC)[8,9]、毛細管電泳法[2,10]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[11-14]等。其中HPLC分離度好,但有機試劑消耗量大;毛細管電泳法峰形良好,但分析時間長;液相色譜-串聯(lián)質譜法準確性高,但是儀器昂貴、成本高。近年來超高效合相色譜技術(UPC2)受到了廣泛關注,該技術以超臨界二氧化碳為流動相主體,依靠流動相的溶劑化能力來進行分離、分析,并通過精確調節(jié)流動相比例、色譜柱溫度和系統(tǒng)背壓來精準調控待測物手性化合物的保留時間和分離度[15]。超臨界流體為流動相使得UPC2的分離分析能力克服了氣相色譜法(GC)和HPLC的不足之處,既能分析不適用于GC的高沸點、低揮發(fā)、遇熱不穩(wěn)定的樣品,又能提高HPLC的分析速度和柱效。研究表明,UPC2技術更適合于分析傳統(tǒng)液相色譜難以處理的結構類似物和同分異構體,已被成功應用于三唑類農藥[16]、酚酸類化合物[17]、色素[18]、酚類精油[19]等化合物的拆分和測定。目前,UPC2技術應用于克倫特羅對映體的拆分及含量測定未見有報道。

本研究建立了超高效合相色譜法拆分和測定克倫特羅對映體的方法。實驗考察了兩種克倫特羅對映體標準品的穩(wěn)定性,優(yōu)化了克倫特羅對映體的色譜分離條件,對所采購的克倫特羅外消旋體標準品進行了拆分及測定。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

Acquity超高效合相色譜儀(美國Waters公司,帶有二極管陣列(PDA)檢測器); AE260電子天平(瑞士Mettler公司); R215旋轉蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司); ELGA CLXXXUVM2超純水凈化系統(tǒng)(英國Elga公司); MS2渦旋混勻器(上海醫(yī)大儀器廠); N-EVAPTM111氮吹儀(日本東京理化公司)。

乙腈、甲醇、甲酸、乙醇、異丙醇、正庚烷(色譜純,西班牙Scharlau公司);醋酸銨、氨水(優(yōu)級純);超純水;高純二氧化碳(99.999%);其他實驗所用試劑除特殊說明外均為分析純。

克倫特羅外消旋體標準品(CAS號:129138-58-5,純度≥98.0%, BePure公司)。兩種克倫特羅對映體標準品:(+)-克倫特羅、(-)-克倫特羅由上海勤路生物技術有限公司從克倫特羅外消旋體標準品(BePure公司)中分離純化獲得,純度均大于98.0%。

1.2 標準儲備液及工作液的配制

1.2.1外消旋體標準儲備液

準確稱取0.01 g(精確至0.1 mg)克倫特羅外消旋體標準品,用甲醇溶解并定容至10 mL,配成1.0 g/L的外消旋體標準儲備液。

克倫特羅外消旋體的標準中間溶液:準確吸取一定量的外消旋體標準儲備液,用乙腈稀釋至10.0 mg/L的標準中間溶液。

1.2.2對映體標準儲備液

分別準確稱取0.01 g(精確至0.1 mg)(+)-克倫特羅和(-)-克倫特羅標準品,用甲醇溶解并定容至10 mL,配成1.0 g/L的對映體標準儲備液。

兩種克倫特羅對映體的混合標準工作溶液:分別準確吸取一定量的(+)-克倫特羅和(-)-克倫特羅對映體標準儲備液,用乙腈逐級稀釋至1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 mg/L的混合標準工作溶液。

1.3 分析條件

色譜柱:Acquity Trefoil AMY1 (150 mm×3.0 mm, 2.5 μm);流動相:A為CO2, B為含0.5%(v/v) 10 mol/L醋酸銨的甲醇溶液;梯度洗脫程序:0～2.0 min, 7%B; 2.0～2.1 min, 7%B～18%B; 2.1～4.25 min, 18%B; 4.25～4.3 min, 18%B～7%B; 4.3～6.3 min, 7%B。系統(tǒng)背壓:13.8 MPa;流速:2.0 mL/min;進樣量:10 μL;柱溫:40 ℃;檢測波長:241 nm。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

通過PDA檢測器掃描后,從色譜圖上提取克倫特羅對映體標準溶液的紫外光譜圖。如圖2所示,在209、241、296 nm處均有明顯的吸收峰,其中209 nm處的吸收最強,靈敏度相對較高,但在該波長下克倫特羅對映體出峰處雜質干擾峰較多;241 nm處吸收較強,克倫特羅對映體出峰處干擾峰較少。綜合考慮,對克倫特羅藥品檢測而言,用吸光度較高且雜質較少的241 nm波長檢測更具有優(yōu)勢,故本實驗選擇241 nm作為檢測波長。

圖 2 克侖特羅對映體標準溶液的光譜圖Fig. 2 Spectra of the standard solution of clenbuterol enantiomers

2.2 色譜柱的優(yōu)化

基于直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)與纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的手性固定相是應用最為廣泛的兩類固定相,具有良好的手性識別能力和拆分能力,在手性識別能力方面互為補充[20]。本實驗選擇美國Waters公司的Acquity Trefoil CEL2 (150 mm×3.0 mm, 2.5 μm,填料為纖維素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯))、Acquity Trefoil AMY1(150 mm×3.0 mm, 2.5 μm,填料為直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯))、Acquity Trefoil CEL1(150 mm×3.0 mm, 2.5 μm,纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯))和大賽璐藥物手性技術(上海)有限公司的多糖衍生物耐溶劑型手性色譜柱CHIRALPAK IA-3(100 mm×4.6 mm, 3 μm,硅膠表面共價鍵合有直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯))、纖維素衍生物正相手性柱CHIRALPAK OJ-H(100 mm×4.6 mm, 5 μm,表面涂敷了手性多聚物(直鏈淀粉或纖維衍生物)的球形硅膠)共5種手性分離色譜柱對兩種克倫特羅對映體的拆分效果進行考察。結果表明,采用OJ-H和CEL1手性色譜柱分離時,兩種克倫特羅對映體未能實現(xiàn)完全分離;采用CEL2和IA-3手性色譜柱分離時,分離度良好,但色譜峰形展寬明顯;而采用AMY1手性色譜柱分離時,分離度良好,且色譜峰形尖銳(見圖3),其拆分機理為克倫特羅對映體的官能團與固定相上的手性空腔相互作用,通過“三點作用”方式[21]進行手性識別,兩個對映體與固定相的作用力有差異,使得保留時間不同。AMY1手性固定相分子中的位阻基團與(+)-克倫特羅對映體分子中的直鏈氨基烷基之間形成了強烈的位阻作用,導致兩者手性識別所需的分子間作用力被阻礙,其在手性固定相上的有效吸附也相應被減弱,故(+)-克倫特羅對映體分子被流動相優(yōu)先洗脫而先出峰;而(-)-克倫特羅對映體分子具有適宜的空間構型,如圖1結構式所示,羥基無明顯的位阻效應,能容易與固定相的酯基形成氫鍵作用力,有利于產(chǎn)生“三點作用”,保留時間延長,因而可被拆分。OJ-H、CEL1和AMY1的固定相填料不同,在超臨界CO2-0.5%(v/v) 10 mol/L醋酸銨甲醇溶液流動相體系中,兩個克倫特羅對映體在OJ-H和CEL1柱上未達到基線分離;AMY1和IA-3的固定相相同,但AMY1固定相的內徑和填料粒徑比IA-3小,故色譜峰形更尖銳。因此本實驗選擇AMY1手性色譜柱對克倫特羅對映體進行分離。

圖 3 不同色譜柱對(+)-克倫特羅和(-)-克倫特羅分離效果的影響Fig. 3 Effect of different chromatographic columns on the separation of (+)-clenbuterol and (-)-clenbuterol

2.3 流動相中助溶劑的選擇

超高效合相色譜的有機溶劑消耗量少,采用超臨界CO2為主要流動相,通常使用少量有機溶劑作為助溶劑,以加強對目標產(chǎn)物的洗脫能力和選擇性。本實驗考察了0.5%(v/v)甲酸甲醇溶液、0.5%(v/v) 10 mol/L醋酸銨甲醇溶液、0.5%(v/v)氨水甲醇溶液等不同助溶劑對兩種克倫特羅對映體分離的影響。結果顯示,當使用0.5%(v/v)甲酸甲醇溶液作為助溶劑時,兩種克倫特羅對映體未能出峰;當使用0.5%(v/v) 10 mol/L醋酸銨甲醇溶液和0.5%(v/v)氨水甲醇溶液作為助溶劑時,兩種克倫特羅對映體的色譜峰均在4.0 min內實現(xiàn)了完全分離,但0.5%(v/v)氨水甲醇溶液助溶劑時,兩個對映體色譜峰的信噪比(S/N)分別為28和20, 0.5%(v/v) 10 mol/L醋酸銨甲醇溶液作為助溶劑時,兩個對映體色譜峰的信噪比(S/N)分別為35和26(見圖4)。因此,本實驗室選擇0.5%(v/v) 10 mol/L醋酸銨甲醇溶液作為助溶劑。

圖 4 不同助溶劑對(+)-克倫特羅和(-)-克倫特羅分離效果的影響Fig. 4 Effect of different organic solvent mobile phases on separation of (+)-clenbuterol and (-)-clenbuterol

2.4 系統(tǒng)背壓的選擇

UPC2采用超臨界狀態(tài)CO2作為流動相,通過調整系統(tǒng)背壓和溫度可有效改變CO2的密度,從而改變其對物質的溶解能力、洗脫能力和選擇性。由于CO2的溫度超過31 ℃且壓力超過7.38 MPa以上,CO2才會進入超臨界狀態(tài)。因此本實驗以0.5%(v/v) 10 mol/L醋酸銨甲醇溶液作為助溶劑,在柱溫40 ℃條件下考察系統(tǒng)背壓在10.3～20.7 MPa范圍內對兩種克倫特羅對映體分離的影響。結果顯示,隨著系統(tǒng)背壓的升高,分析物的保留時間提前(見圖5)。4種條件下,兩種克倫特羅對映體的分離度分別為1.7、1.8、1.6、1.5，在系統(tǒng)背壓為13.8 MPa時的色譜峰分離度達到最佳，故本研究選擇背壓為13.8 MPa。

圖 5 不同系統(tǒng)背壓對(+)-克倫特羅和(-)-克倫特羅對映體分離效果的影響Fig. 5 Effect of different system backpressure on the separation of (+)-clenbuterol and (-)-clenbuterol

2.5 色譜柱溫度的選擇

在UPC2系統(tǒng)中,色譜柱溫度主要通過影響流動相密度,從而影響對目標物的分離效果。隨著色譜柱溫度升高,CO2超臨界流體的黏度降低,密度減小,對目標產(chǎn)物的洗脫能力也隨之減小,保留時間延長。考慮到Acquity Trefoil AMY1手性色譜柱的最高推薦運行溫度為40 ℃, CO2的溫度超過31 ℃且壓力超過7.38 MPa以上,CO2才會進入超臨界狀態(tài)。因此本實驗考察了色譜柱溫在31～40 ℃范圍內對克倫特羅對映體分離的影響。結果表明,隨著柱溫升高,目標物的保留時間逐漸延長(見圖6)。3種柱溫條件下,兩種克倫特羅對映體的分離度分別為1.3、1.5、1.7，在柱溫為40 ℃時的色譜峰分離度達到最佳,4.0 min內實現(xiàn)良好的基線分離,分析速度快。因此,選擇最佳色譜柱溫度為40 ℃。

圖 6 不同色譜柱溫度對(+)-克倫特羅和(-)-克倫特羅分離效果的影響Fig. 6 Effect of different column temperatures on the separation of (+)-clenbuterol and (-)-clenbuterol

2.6 定容試劑的選擇

使用5種定容試劑:甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、正庚烷對10 mg/L的克倫特羅對映體進行拆分,結果如圖7所示,當用甲醇作為定容試劑時,目標峰中包含雜質峰;當用乙醇作為定容試劑時,目標物峰形較差;當用乙腈、異丙醇和正庚烷作為定容試劑時,兩種克倫特羅對映體的色譜峰均在4.0 min內實現(xiàn)了完全分離,但相比異丙醇和正庚烷兩種定容試劑,乙腈作為定容試劑時,目標物的色譜峰分離度更好,峰形更尖銳。因此,最后確定乙腈為本實驗定容試劑。

圖 7 不同定溶試劑對(+)-克倫特羅和(-)-克倫特羅分離效果的影響Fig. 7 Effect of different constant volume reagents on the separation of (+)-clenbuterol and (-)-clenbuterol

2.7 方法學考察

2.7.1線性范圍和靈敏度

將(+)-克倫特羅和(-)-克倫特羅的系列混合標準溶液按上述色譜條件進行測定。以標準品的峰面積(Y)為縱坐標,對應質量濃度(X)為橫坐標,繪制標準曲線,求得回歸方程和相關系數(shù)。結果表明,兩種克倫特羅對映體在1.0～20.0 mg/L質量濃度范圍內呈良好的線性關系,相關系數(shù)大于0.999 7。當信噪比為3(S/N=3)時,兩種克倫特羅對映體的儀器檢出限(LOD)分析結果見表1。

表 1 克倫特羅對映體的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)和檢出限

2.7.2精密度

取10.0 mg/L混合標準工作溶液,重復進樣6次,按1.3節(jié)色譜條件進行測定,計算結果表明(+)、(-)-克倫特羅對映體峰面積的相對標準偏差(RSD,n=6)分別為0.65%和0.76%,該測定方法的精密度符合GB/T 32465-2015[22]的要求,能夠滿足克倫特羅對映體的拆分和測定要求。

2.8 克倫特羅對映體標準溶液穩(wěn)定性的考察

分別準確移取1.0 mL的10 mg/L克倫特羅對映體的混合標準工作溶液于7個帶劃痕的1.5 mL UPC2專用進樣小瓶中,上機進行測定,檢測后再轉移至7個帶鋁蓋密封的進樣小瓶中,并用封口膜封好后于-18 ℃下保存放置。將新配制的質量濃度為10.0 mg/L的兩種克倫特羅對映體標準溶液,與分別儲存1、3、5、7、14、30、60天后的10.0 mg/L克倫特羅對映體的測定結果作圖比較,以新配制標準溶液作為100%,克倫特羅對映體標準溶液變化小于10%作為基準。結果顯示,兩種克倫特羅對映體測定結果都是呈逐漸降低趨勢(見圖8),其中兩種克倫特羅對映體于-18 ℃下放置60天時含量降低了20%以上,放置30天時含量變化小于10%,而放置7天時含量變化小于5%,表明兩種克倫特羅對映體在30天內比較穩(wěn)定。

圖 8 (+)-克倫特羅和(-)-克倫特羅標準溶液60天內的 穩(wěn)定性考察(乙腈溶液)Fig. 8 Stability test for (+)-clenbuterol and (-)- clenbuterol in acetonitrile during 60 d

圖 9 克倫特羅外消旋體的拆分Fig. 9 Separation of standard clenbuterol racemate

2.9 方法的應用

采用本文建立的方法對所采購的克倫特羅外消旋體標準品進行拆分及測定。如圖9所示,兩種克倫特羅對映體的分離效果良好,在4.0 min內實現(xiàn)了有效拆分,分離度為1.7,符合R≥1.5完全分離的要求[23]。按照色譜峰的保留時間順序,依次為(+)-克倫特羅、(-)-克倫特羅。根據(jù)上述所繪制的標準曲線,采用外標定量法計算1.2.1節(jié)中克倫特羅外消旋體標準中間溶液10.0 mg/L的兩種克倫特羅對映體含量,其中(+)-克倫特羅的含量為5.6 mg/L, (-)-克倫特羅的含量為5.5 mg/L。計算結果與文獻[12]報道的工業(yè)品克倫特羅外消旋體中(+)-克倫特羅與(-)-克倫特羅的比例為1.02∶1.00基本相符。

3 結論

本文采用超高效合相色譜技術對克倫特羅對映體進行分離,考察了手性色譜柱、助溶劑、系統(tǒng)背壓、柱溫、定容試劑對克倫特羅對映體分離的影響,最終確定分離條件為:手性色譜柱為Acquity Trefoil AMY1 (150 mm×3.0 mm, 2.5 μm),助溶劑為0.5%(v/v) 10 mol/L醋酸銨甲醇溶液,流速為2.0 mL/min,檢測波長241 nm,柱溫40 ℃,系統(tǒng)背壓為13.8 MPa。最佳實驗條件下的運行時間僅為4.0 min,能夠實現(xiàn)對克倫特羅對映體的基線分離,為其他手性化合物的拆分、藥效精細分析和產(chǎn)品質量評定提供了可靠的技術支持。