鄒 攀, 段圣省, 胡西洲, 鄭 丹, 夏珍珍, 夏 虹, 彭西甜

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所, 農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)品質(zhì)與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 武漢 430064)

米酵菌酸(bongkrekic acid, BA)是一種脂溶性細(xì)菌毒素,是由食品中常見的致病菌椰毒假單胞菌產(chǎn)生的,谷物、發(fā)酵的米面制品、銀耳和木耳等食品最易受到該病菌的污染[1]。研究表明,米酵菌酸對(duì)線粒體腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)移酶(adenine nucleotide translocase, ANT)的活性產(chǎn)生抑制,從而破壞線粒體中三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)的合成,導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[2,3]。因此,人體攝入經(jīng)米酵菌酸污染的食品后,可能會(huì)損傷肝、腎、心、腦等重要器官的細(xì)胞,很容易導(dǎo)致食物中毒[4]。2020年黑龍江雞西市的“酸湯子”、2015年莫桑比克的椰子制品、2014年云南文山湯圓等食物中毒事件都導(dǎo)致了嚴(yán)重的死亡事件,經(jīng)查這些食物中毒都是由米酵菌酸引起的[1]。銀耳和木耳是我國傳統(tǒng)的食用菌,其營養(yǎng)價(jià)值豐富,深受我國消費(fèi)者的喜愛。然而,銀耳和木耳在儲(chǔ)藏和泡發(fā)過程中易受米酵菌酸的污染,給食品安全造成了極大的威脅[5,6]。因此,建立銀耳和木耳中米酵菌酸快速、高效的分析方法具有重要的意義。

圖 1 米酵菌酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structure of bongkrekic acid

米酵菌酸是一種共軛的不飽和脂肪酸(見圖1),常見的檢測(cè)方法有高效液相色譜-紫外檢測(cè)法[7,8]和高效液相色譜-質(zhì)譜法[1,4,6,9,10]。與傳統(tǒng)的紫外檢測(cè)器相比,超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)檢測(cè)靈敏度高和準(zhǔn)確度更好,其在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下可以通過目標(biāo)物的保留時(shí)間、母離子質(zhì)荷比以及碎裂反應(yīng)對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行定性,分析方法具有更好的特異性,可以大大減少基質(zhì)的干擾,降低假陽性分析結(jié)果的出現(xiàn)[11]。此外,米酵菌酸在樣品中的濃度很低,銀耳和木耳基質(zhì)復(fù)雜,采取適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚砑夹g(shù)對(duì)其進(jìn)行提取凈化非常有必要。目前,應(yīng)用最廣泛的米酵菌酸前處理方法是固相萃取(SPE),其主要采用混合模式陰離子交換固相萃取柱,通過混合模式的反相和陰離子交換作用實(shí)現(xiàn)米酵菌酸的萃取富集[1,4,7,8]。SPE方法的結(jié)果穩(wěn)定,回收率較高,然而SPE的上樣、清洗、解吸等步驟較為繁瑣,耗時(shí)較長,SPE柱的成本也較高。QuEChERS方法由美國農(nóng)業(yè)部2003年首次提出,其具有快速、簡單、便宜、有效和安全的特點(diǎn),在食品農(nóng)藥殘留分析中展現(xiàn)了極大的應(yīng)用前景[12-14]。近年來,QuEChERS方法在食品中真菌毒素如黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素等的分析中同樣取得了很好的效果[15-17]。到目前為止,尚未檢索到QuEChERS方法用于銀耳和木耳中米酵菌酸的檢測(cè)。

因此,本文采用改良的QuEChERS前處理方法,對(duì)提取溶劑、提取方式、凈化材料等進(jìn)行了詳細(xì)的優(yōu)化,結(jié)合UHPLC-MS/MS的分離檢測(cè),建立了銀耳和木耳中米酵菌酸的快速分析方法,旨在為食品中米酵菌酸的監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)防控提供一種有效的檢測(cè)技術(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑及材料

LC-30AD液相色譜儀(日本Shimadzu公司),Qtrap 4500三重四極桿質(zhì)譜儀(AB SCIEX公司);數(shù)據(jù)采集由Analyst@工作站完成,數(shù)據(jù)處理由MultiQuant分析軟件完成。TDL-6C臺(tái)式大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);MS 3型渦旋儀(德國IKA公司);T25型勻漿攪拌器(德國IKA公司);KQ-500B型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);氮吹儀(美國Organomation公司);Milli-Q超純水處理儀(美國Millipore公司);ME203E型電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于99%,上海宏葉生物科技有限公司);色譜純甲醇、乙腈(德國默克公司),色譜純甲酸(Fisher Scientific公司),色譜純乙酸(美國JT. Baker公司)。石墨化炭黑GCB(120～400目)、C18(50 μm)和PSA(40～60 μm)購自天津博納艾杰爾科技有限公司。尼龍針頭過濾器(0.22 μm)購自天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。所有的銀耳和木耳樣品購自湖北省菜市場和超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:將0.1 mg的米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)品溶于10 mL甲醇中得到10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置于-20 ℃冰箱保存。再吸取10 mg/L米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容至10 mL,得到1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)溶液:使用銀耳和木耳樣品提取凈化后的溶液和50%(v/v)甲醇水溶液分別配制1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0和200.0 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理

稱取2.0 g干燥粉碎的銀耳樣品于50 mL離心管中,加入10 mL水和10 mL 5%(v/v)乙酸乙腈,渦旋提取1 min,加入6.0 g無水硫酸鎂和1.5 g醋酸鈉,渦旋1 min, 4 000 r/min離心5 min,取8 mL上清液加入到裝有200 mg C18和900 mg無水硫酸鎂的10 mL離心管中,渦旋凈化1 min后離心,收集5 mL上清液,氮?dú)獯蹈?用1 mL 50%(v/v)甲醇水溶液復(fù)溶,經(jīng)0.22 μm的尼龍濾膜過濾后,UHPLC-MS/MS分離檢測(cè)。

1.4 分析條件

色譜條件 色譜柱:Waters ACQUITY UPLC@HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)(Waters,愛爾蘭);流動(dòng)相:A為含0.01%(v/v)甲酸和0.05%(v/v)氨水的水溶液,B為甲醇。色譜線性梯度程序:0～3 min, 40%B～90%B; 3～3.5 min, 90%B; 3.51～5.50 min, 40%B。流速:0.3 mL/min;柱溫:40 ℃;樣品室溫度:15 ℃;進(jìn)樣體積:5 μL。

質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧(ESI);掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)負(fù)離子掃描模式;離子化電壓(IS): -4 500 V;離子源溫度:550 ℃;氣簾氣(CUR): 172.4 kPa(25 psi);噴霧氣(GS1): 379.2 kPa(55 psi);輔助加熱氣(GS2): 379.2 kPa(55 psi);碰撞氣:Medium。定量離子對(duì)m/z485.3>441.0,碰撞電壓為-14.6 V;定性離子對(duì)m/z485.3>397.1,碰撞電壓為-23.6 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

米酵菌酸是長鏈的不飽和三元羧酸,在電噴霧質(zhì)譜的負(fù)離子模式下具有較高的靈敏度。首先對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化,在Q1全掃模式下對(duì)母離子進(jìn)行了掃描,發(fā)現(xiàn)[M-H]-(m/z, 485.3)的響應(yīng)值最高。隨后,在子離子掃描模式下對(duì)定性和定量離子進(jìn)行了掃描,發(fā)現(xiàn)母離子會(huì)連續(xù)產(chǎn)生兩個(gè)[CO2]的中性丟失,產(chǎn)生m/z為441.0和397.1的子離子,與文獻(xiàn)[9]的報(bào)道一致。進(jìn)一步對(duì)定性和定量離子對(duì)的碰撞電壓進(jìn)行了優(yōu)化,選擇靈敏度更高的m/z485.3>441.0為定量離子對(duì),碰撞電壓為-14.6 V;m/z485.3>397.1為定性離子對(duì),碰撞電壓為-23.6 V。

對(duì)液相色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化,當(dāng)水相采用純水時(shí),米酵菌酸的峰形很差,流動(dòng)相中加入0.01%甲酸和0.05%氨水可以有效地改善米酵菌酸的峰形。同時(shí),對(duì)有機(jī)相的起始比例從10%到50%進(jìn)行了考察,發(fā)現(xiàn)40%的甲醇作為起始比例,3 min內(nèi)升到90%,米酵菌酸的保留時(shí)間為2.5 min,保留時(shí)間較短,同時(shí)樣品基質(zhì)對(duì)分離沒有干擾。最后,對(duì)進(jìn)樣體積和柱溫等條件進(jìn)行了優(yōu)化,優(yōu)化好的色譜條件如1.4節(jié)所述,米酵菌酸的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見圖2。

圖 2 20 μg/L米酵菌酸的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig. 2 MRM chromatograms of bongkrekic acid at 20 μg/L

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

為了獲得較高的回收率,我們優(yōu)化了一系列可能影響萃取效率的條件:凈化材料的用量、提取方式、提取溶劑乙酸含量等。我們以空白加標(biāo)的銀耳樣品(20 μg/L)對(duì)改進(jìn)的QuECHERs方法進(jìn)行了優(yōu)化,每個(gè)條件平行處理3次。

2.2.1樣品與水比例的優(yōu)化

對(duì)于水含量很低的樣品,為了提高目標(biāo)物的提取效率,通常會(huì)往樣品中加入一定量的水[18]。銀耳和木耳曬干后含水量很低,泡發(fā)不充分會(huì)影響樣品的提取效果,本實(shí)驗(yàn)考察了水加入量對(duì)米酵菌酸提取的影響,在2.0 g銀耳中分別加入了4、5、6、8和10 mL水,結(jié)果顯示,當(dāng)水加至10 mL時(shí)能夠使銀耳充分泡發(fā)。因此我們選擇加入10 mL的水。

2.2.2提取方式的優(yōu)化

由于銀耳基質(zhì)復(fù)雜,且加水泡發(fā)后體積膨大,需要一個(gè)合適的提取方式來提取目標(biāo)物。我們分別采用不同的提取方式:超聲、渦旋和勻漿提取2 min,考察了3種方法對(duì)樣品中米酵菌酸提取效率的影響。結(jié)果表明,渦旋提取的回收率為89.5%,勻漿提取的為74.1%,但超聲提取的回收率較前兩者低,為46.5%?？紤]到勻漿提取攪拌頭每次勻漿后需清洗,加大了工作量和時(shí)長,因此我們選擇渦旋提取。

2.2.3提取溶劑的優(yōu)化

乙腈有很好的細(xì)胞穿透性,是最常用的QuEChERS提取溶劑,而本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)物米酵菌酸有3個(gè)羧酸,加入適量的乙酸能破壞銀耳基質(zhì)中金屬離子與米酵菌酸之間的絡(luò)合作用,同時(shí)會(huì)使得米酵菌酸的羧基質(zhì)子化,極性變?nèi)?增大了米酵菌酸在乙腈中的溶解度。我們考察了不同乙酸含量的乙腈,如圖3所示,當(dāng)提取液為純乙腈時(shí),米酵菌酸回收率不到10%,隨著乙酸的體積分?jǐn)?shù)從0%增加到5%,回收率快速增加,5%的乙酸提取時(shí)回收率可以達(dá)到90%以上;當(dāng)乙酸的體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加至10%,回收率降低,過高的酸性可能會(huì)影響米酵菌酸的穩(wěn)定性。因此我們選擇的提取溶劑是含5%乙酸的乙腈。

圖 3 乙酸的體積分?jǐn)?shù)對(duì)銀耳中米酵菌酸回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effects of volume percentage of acetic acid on the recovery of bongkrekic acid in tremella (n=3)

2.2.4吸附劑的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)選取了3種常用的QuEChERS吸附劑:PSA、C18和GCB,考察了吸附劑種類和用量對(duì)米酵菌酸萃取效率的影響。在實(shí)驗(yàn)過程中,我們發(fā)現(xiàn)雖然GCB有去除銀耳提取液中色素等干擾物的能力,但同時(shí)它會(huì)吸附疏水的米酵菌酸,從而減少回收率;而PSA是堿性的,會(huì)與酸性的米酵菌酸相互作用而降低回收率。C18極性較弱,可以除去一部分的脂類干擾物,因此本實(shí)驗(yàn)中我們比較了不同用量的C18吸附劑,當(dāng)吸附劑含量由100 mg增至200 mg時(shí),回收率逐漸增加,由61.1%升至70.1%;當(dāng)吸附劑繼續(xù)增至250 mg,回收率緩慢降為66.3%。因此我們選擇200 mg的C18凈化銀耳提取液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1基質(zhì)效應(yīng)

在HPLC-MS分析中,樣品中的基質(zhì)可能會(huì)增強(qiáng)或抑制分析物的離子化效率,進(jìn)而影響其在儀器上的響應(yīng)信號(hào),引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差,因此需要對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)評(píng)估。本研究采用以下公式[19]評(píng)價(jià)方法的基質(zhì)效應(yīng):

一般來說,基質(zhì)效應(yīng)在-20%～20%為弱基質(zhì)效應(yīng);在-50%～-20%和20%～50%為中等基質(zhì)效應(yīng);小于-50%或大于50%則為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明,銀耳和木耳中米酵菌酸的基質(zhì)效應(yīng)分別為-6.3%和-11.5%,由此可見,經(jīng)過QuEChERS提取凈化后,樣品的基質(zhì)效應(yīng)較弱,樣品基質(zhì)對(duì)分析物的影響較小。

2.3.2線性關(guān)系、檢出限和定量限

由于本實(shí)驗(yàn)中銀耳和木耳樣品的基質(zhì)效應(yīng)很弱,因此,我們采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)該實(shí)驗(yàn)的線性關(guān)系、檢出限、定量限以及精密度等進(jìn)行了考察,驗(yàn)證該方法在實(shí)際應(yīng)用中的可行性。

溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線是50%(v/v)甲醇水溶液配制成1～200 μg/L的一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.4節(jié)方法測(cè)定,米酵菌酸在1～200 μg/L的范圍內(nèi)的線性方程為y=2 937.6x+8 204.2(y為峰面積,x為米酵菌酸的質(zhì)量濃度(μg/L)),線性關(guān)系良好,回歸系數(shù)的平方(R2)大于0.999。以信噪比的3倍和10倍計(jì)算方法的檢出限和定量限分別為0.15 μg/kg和0.5 μg/kg。

2.3.3回收率和精密度

為了評(píng)估該方法的準(zhǔn)確性,我們分別在銀耳和木耳樣品基質(zhì)中添加了LOQ(0.5 μg/kg)、中(10 μg/kg)、高(50 μg/kg)3個(gè)濃度的目標(biāo)分析物,同時(shí)配制6組平行樣品進(jìn)行試驗(yàn),得到的檢測(cè)結(jié)果用以計(jì)算日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD);以連續(xù)6天單獨(dú)配制的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn),得到的檢測(cè)結(jié)果用以計(jì)算日間RSD。結(jié)果如表1和表2所示,銀耳方法的加標(biāo)回收率在92.4%～102.6%之間。日內(nèi)RSD在4.3%～4.9%,日間RSD的范圍在3.2%～3.5%;木耳方法的加標(biāo)回收率在89.6%～102.3%之間。日內(nèi)RSD在2.4%～9.5%,日間RSD的范圍在3.6%～4.1%。以上結(jié)果表明該方法的重現(xiàn)性較好。

2.3.4在實(shí)際樣品分析中的應(yīng)用

為了考察方法的普適性,我們將該方法應(yīng)用于武漢市場上10種銀耳和10種木耳中米酵菌酸的檢測(cè)。在這10種銀耳中未檢測(cè)到陽性樣品,而木耳中檢出一個(gè)陽性樣品,含量為21.48 μg/kg。說明方法具有普適性,可應(yīng)用于銀耳和木耳中米酵菌酸的檢測(cè)。

表 1 米酵菌酸在銀耳和木耳樣品中低、中、高水平下的加標(biāo)回收率和RSD (n=6)

2.3.5方法比較

對(duì)本文建立的方法與文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行了比較。米酵菌酸分子含有3個(gè)羧酸根,文獻(xiàn)通常采用有機(jī)溶劑提取后混合型陰離子交換柱富集凈化[6,7,20]。從樣品前處理過程來看,本文的QuEChERS方法較為簡單,避免了SPE方法繁瑣的提取、上樣、清洗和解吸過程,樣品提取凈化成本低,基質(zhì)效應(yīng)弱,結(jié)合UHPLC-MS/MS進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)一步提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和靈敏度。同時(shí),與其他檢測(cè)方法[6,7,20]相比,本方法的檢出限和定量限更低(0.15 μg/kg和0.5 μg/kg),其他方法的檢出限和定量限最低分別為0.5 μg/kg和2 μg/kg。同時(shí),本方法的回收率和精密度與其他方法相當(dāng),在實(shí)際樣品大批量分析中具有很好的應(yīng)用潛能。

3 結(jié)論

本文將QuEChERS方法結(jié)合UHPLC-MS/MS用于銀耳和木耳中米酵菌酸的檢測(cè),樣品前處理過程快速、簡單、有效,同時(shí)具有靈敏度高、準(zhǔn)確度好的優(yōu)點(diǎn),為食品中米酵菌酸的風(fēng)險(xiǎn)防控提供了一種有效的檢測(cè)技術(shù)。