羅 芳, 郭澤華, 曹成喜, 樊柳蔭, 張 薇*

(1. 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200240; 2. 上海交通大學(xué)電子信息與電氣工程學(xué)院, 上海 200240; 3. 上海交通大學(xué)學(xué)生創(chuàng)新中心, 上海 200240)

近年來(lái),生物化學(xué)工程的迅速發(fā)展使得大量化合物成為潛在候選藥物,了解這些化合物理化性質(zhì)的需求也日益增長(zhǎng)。這也對(duì)如絕對(duì)淌度(m0, m2/(V·s))和解離常數(shù)(pKa)等理化參數(shù)的測(cè)定方法提出了更高要求。其中,m0指化合物在離子強(qiáng)度趨于零的條件下的淌度,而pKa是水溶液中具有一定解離度的溶質(zhì)的極性參數(shù)。

洛伐他汀是膽固醇合成通路中重要酶羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶)的抑制劑,可減少血膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的含量,預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等[1]。洛伐他汀的最大吸收波長(zhǎng)λmax為238 nm,可溶于堿性溶液。洛伐他汀包括內(nèi)酯型和酸型(見圖1),而內(nèi)酯型洛伐他汀的親脂性較強(qiáng),口服吸收率低,須在肝臟中水解成酸型后才能發(fā)揮藥理作用。當(dāng)環(huán)境pH值高于7.7時(shí),內(nèi)酯型洛伐他汀轉(zhuǎn)化為酸型洛伐他汀[2]。因而有必要對(duì)洛伐他汀的重要理化參數(shù)進(jìn)行測(cè)定,了解其理化特性,從而為更深入的研究提供基本數(shù)據(jù)和信息。但是,目前大多數(shù)對(duì)洛伐他汀藥物的研究工作主要聚焦于含量測(cè)定、作用機(jī)理和功能方面,關(guān)于測(cè)定洛伐他汀m0和pKa值的研究則較少[1-3]。

圖 1 內(nèi)酯洛伐他汀和酸性洛伐他汀的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structures of lactone lovastatin and acid lovastatin

當(dāng)前已經(jīng)有許多關(guān)于其他化合物pKa值的測(cè)定方法,其中最經(jīng)典的方法是電位計(jì)滴定法和光譜法[4-8]。但這些方法相對(duì)來(lái)說(shuō)需要耗費(fèi)大量樣品,并且對(duì)于純度低的化合物測(cè)定結(jié)果不夠準(zhǔn)確[9,10]。自20世紀(jì)70年代以來(lái),高效液相色譜法(HPLC)也已應(yīng)用于化合物pKa的測(cè)定中[11-15]。Bartolini等[16]使用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測(cè)定乙酰胺的pKa,但液相色譜方法流動(dòng)相溶液消耗較多,而且單個(gè)樣品分析時(shí)間至少10 min以上,比較耗時(shí)。包括毛細(xì)管等速電泳法(ITP)和毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(CZE)等在內(nèi)的毛細(xì)管電泳法(CE)也廣泛應(yīng)用于水溶性化合物pKa值的測(cè)定中[17-25]。

本研究基于CZE和離子淌度的經(jīng)驗(yàn)方程[26-28],建立了一種精確測(cè)定洛伐他汀m0和pKa的新方法。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)方程,可以由測(cè)得的實(shí)際淌度(mact, m2/(V·s))計(jì)算m0,再通過m0進(jìn)一步計(jì)算得到pKa。在方法驗(yàn)證部分,使用該方法測(cè)定了巴比妥酸、苯甲酸、芐胺、苯酚、間甲酚等有機(jī)酸堿的m0和pKa。對(duì)pH值低于6的緩沖體系,加入陽(yáng)離子表面活性劑,采用反向毛細(xì)管電泳技術(shù)，測(cè)定其pKa值。將測(cè)定值和理論參考值進(jìn)行比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者一致性較高,說(shuō)明該方法具有較高的可靠性。最后應(yīng)用該方法測(cè)定洛伐他汀的m0和pKa。

1 理論推導(dǎo)

1.1 m0的計(jì)算方法

在CZE中,有效淌度的計(jì)算方法如下[29]:

(1)

其中,meff和mapp分別表示分析物的有效淌度和表觀淌度(m2/(V·s)),mEOF表示其電滲流淌度(m2/(V·s)),Ltot和Leff分別為毛細(xì)管的總長(zhǎng)度和有效長(zhǎng)度(m),V表示所施加的電壓(V),tobs是觀察到的分析物遷移時(shí)間(s),tEOF是電滲流下觀察到的中性標(biāo)記物遷移時(shí)間(s)。

對(duì)于一價(jià)弱酸來(lái)說(shuō),mact與meff之間的關(guān)系為[30]:

meff=mactα

(2)

其中,mact是實(shí)際淌度,即在給定的離子強(qiáng)度下完全質(zhì)子化或去質(zhì)子化離子的淌度(m2/(V·s))。α是解離度。對(duì)于一價(jià)酸HA,離解度可定義為:

(3)

式中,CHA是反應(yīng)開始時(shí)一元酸的濃度(mol/L), [HA]、[A-]和[H+]分別是反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)溶液中一元酸HA、A-和H+的濃度。當(dāng)分析物100%電離時(shí),其解離度α趨于1,此時(shí)式(2)可寫為:

meff=mact

(4)

一價(jià)離子m0的經(jīng)驗(yàn)公式[26-28,30-32]可以寫成:

(5)

其中,η為常數(shù),當(dāng)電荷數(shù)z為1時(shí)(即一元酸或堿),η為0.503 0;當(dāng)z大于等于2時(shí),η為0.662 9。I為離子強(qiáng)度,根據(jù)以下公式來(lái)計(jì)算:

(6)

式中,ci和zi代表組分i的濃度(mol/L)和電荷數(shù)。將式(4)代入式(5)可得m0為:

(7)

需要注意,等式(5)和(7)僅適用于I≤0.1 mol/L和25 ℃條件下。

綜上,當(dāng)分析物處于完全解離狀態(tài)時(shí),全部以離子形式存在,溶液中無(wú)分析物的分子形態(tài)。因此可以根據(jù)分析物的pKa理論參考值,選擇合適pH值的緩沖液以確保分析物能完全解離。在固定的pH下,可以得到分析物在特定離子強(qiáng)度下的mact,并根據(jù)公式(7)計(jì)算分析物在不同離子強(qiáng)度下的m0。

1.2 pKa的計(jì)算方法

對(duì)于一元酸HA來(lái)說(shuō),解離平衡常數(shù)為:

(8)

將式(3)代入式(8),得:

(9)

由式(9)進(jìn)一步可得:

(10)

根據(jù)式(10),如果溶液的pH值比酸性(或堿性)分析物的pKa值大(或小)3,即log (α/(1-α))的值為3時(shí),經(jīng)計(jì)算α為0.999,則分析物處于完全解離狀態(tài),此時(shí)滿足1.1節(jié)中m0的測(cè)定條件。結(jié)合公式(2)和(9),可得:

(11)

由式(11)可知,1/meff與[H+]成正比,可通過計(jì)算pH值得到。當(dāng)離子強(qiáng)度一定時(shí),在不同的pH值下可以得到一系列meff值。以氫離子濃度為自變量(x), 1/meff為因變量(y)，得到一條線性回歸直線。該直線的斜率1/(mactKa)。由斜率和公式(5)中計(jì)算得到的mact,可以求得分析物的Ka,從而進(jìn)一步求得其pKa。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

高效毛細(xì)管電泳儀(1229型,北京新技術(shù)儀器有限公司)；未涂覆熔融石英毛細(xì)管(總長(zhǎng)50 cm(有效長(zhǎng)度為25 cm和40 cm)、內(nèi)徑75 μm,中國(guó)河北永年光纖廠)；超純水系統(tǒng)(德國(guó)SG Water公司)用以生產(chǎn)電導(dǎo)率低至0.055 μS/cm的超純水；pH計(jì)(瑞士Mettler Toledo公司)。

氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸三鈉、磷酸二氫鈉、二甲基亞砜(DMSO)、乙酸、醋酸鈉、丙酮、巴比妥酸、苯甲酸、苯酚、間甲酚等試劑均購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑公司;芐胺(純度>99%)購(gòu)自美國(guó)Fluka公司;十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)(純度>99%)購(gòu)自中美生物科技有限公司;洛伐他汀片(20 mg/片)購(gòu)自浙江海正股份有限公司。

2.2 背景電解質(zhì)溶液的制備

對(duì)于m0的測(cè)定,制備表1所示的一系列pH值相同而離子強(qiáng)度不同的磷酸鹽緩沖液,每種緩沖液均制備5種離子強(qiáng)度(0.01、0.04、0.05、0.09和0.1 mol/L)。

表 1 測(cè)定m0所用緩沖液

對(duì)于pKa的測(cè)定,制備表2所示的一系列離子強(qiáng)度相同(0.05 mol/L)而pH值不同的磷酸鹽和醋酸鹽緩沖液。所有緩沖液用0.45 μm過濾器過濾并保證在兩周內(nèi)使用。

表 2 測(cè)定pKa所用緩沖液

2.3 樣品的制備

巴比妥酸、苯甲酸、芐胺、苯酚、間甲酚樣品分別以1、30、10、0.8、2 mg/mL溶于純水中。用相應(yīng)緩沖液將樣品分別稀釋至終濃度為0.02、0.06、2、0.08、0.10 mg/mL后進(jìn)樣。洛伐他汀樣品以1 mg/mL溶解于75%乙醇中,用對(duì)應(yīng)緩沖液稀釋至200 μg/mL后進(jìn)樣。

2.4 毛細(xì)管預(yù)處理及電泳條件

每次進(jìn)樣前將毛細(xì)管依次用1.0 mol/L NaOH、超純水和1.0 mol/L HCl分別沖洗20、10和20 min,最后用該樣品對(duì)應(yīng)的緩沖液沖洗30 min。當(dāng)緩沖液的pH值等于或低于6.0時(shí)(本實(shí)驗(yàn)中為乙酸緩沖液),在緩沖體系中加入0.8%(v/v)陽(yáng)離子表面活性劑CTAB,并用含有CTAB的緩沖液沖洗毛細(xì)管10 min,然后進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)控制在25 ℃室溫下進(jìn)行,設(shè)置分離電壓為10～15 kV,并以1.33 kPa的壓力從毛細(xì)管陽(yáng)極端(在常規(guī)CZE下)或從毛細(xì)管陰極端(反向CZE下)注入樣品。進(jìn)樣過程持續(xù)10 s,根據(jù)分析物的性質(zhì)選擇合適的吸收波長(zhǎng)(巴比妥酸和間甲酚用214 nm,苯甲酸、芐胺和苯酚用254 nm)。使用二甲基亞砜(214 nm紫外吸收波長(zhǎng))或丙酮(254 nm紫外吸收波長(zhǎng))作為中性標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記電滲流(EOF)。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同分析物m0和pKa的測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)1.1節(jié)和1.2節(jié)推導(dǎo)的公式,計(jì)算得到不同分析物的m0和pKa實(shí)驗(yàn)測(cè)定值,同時(shí)使用通用軟件PeakMaster 5.1計(jì)算得到其對(duì)應(yīng)m0和pKa的理論參考值(見表3)。測(cè)定值與理論參考值相減得到差值,該差值與理論參考值的比值為標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。從計(jì)算結(jié)果可以看出,對(duì)于m0和pKa的測(cè)定,其SD分別不超過6.0%和6.2%。在pKa的測(cè)定中,線性回歸方程相關(guān)系數(shù)(R)的范圍為0.940～0.999,表明該線性回歸直線擬合度較好。這說(shuō)明該方法得到的m0和pKa測(cè)定值與理論參考值一致度較高,證明該測(cè)量方法是可靠的,可以用于分析物m0和pKa的測(cè)定。

表 3 m0和pKa的實(shí)測(cè)值和參考值

3.2 洛伐他汀m0和pKa的測(cè)定結(jié)果

采用DMSO作為電滲流標(biāo)記物,利用一系列經(jīng)驗(yàn)公式測(cè)定洛伐他汀的m0,利用得到的洛伐他汀m0值和線性回歸直線進(jìn)一步得到pKa值,分別為-1.70×10-8m2/(V·s)和9.00。

本工作采用一系列不同離子強(qiáng)度的Na2HPO4-NaOH緩沖液(pH 12.00)測(cè)定洛伐他汀的m0。由前文可知,當(dāng)溶液的pH值等于12.00時(shí),比分析物的pKa值大3(pKa=9.00),此時(shí)mact幾乎等于meff,故式(6)適用于m0的計(jì)算。同時(shí),如引言所述,當(dāng)pH值大于7.7時(shí),內(nèi)酯型洛伐他汀會(huì)轉(zhuǎn)化為酸型洛伐他汀,此時(shí)洛伐他汀的pKa應(yīng)大于7.7。而測(cè)得的值為9.00,與假設(shè)相符,這說(shuō)明結(jié)果具有較高的可靠性。

4 結(jié)論

本工作建立了毛細(xì)管電泳測(cè)定洛伐他汀的m0和pKa的方法。該方法基于毛細(xì)管區(qū)帶電泳和離子淌度經(jīng)驗(yàn)公式,且適用于酸性和堿性分析物pKa值的測(cè)定。同時(shí),在pH值低于6的緩沖體系中,采用具有縮短遷移時(shí)間和檢測(cè)無(wú)法到達(dá)陰極分析物的能力的反向毛細(xì)管電泳法測(cè)定pKa。通過與理論參考值對(duì)比可知,本文所建立的方法具有較高可靠度和準(zhǔn)確性,這將在藥物分析中發(fā)揮重要作用。本文所建立的方法簡(jiǎn)單快速,準(zhǔn)確率高,能滿足化合物m0和pKa的測(cè)定需要,同時(shí)也為測(cè)定化合物其他理化性質(zhì)提供了參考依據(jù)。