張 旭, 董妙雪, 徐 銀, 王利娟*, 喬曉強(qiáng)

(1. 河北省藥物質(zhì)量分析控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河北大學(xué)生命科學(xué)與綠色發(fā)展研究院, 河北大學(xué)藥學(xué)院, 河北 保定 071002; 2. 天津阿爾塔科技有限公司, 天津 300457)

昔萘酸沙美特羅(salmeterol xinafoate, SalX)是一種藥效持久的β2-腎上腺受體興奮劑,藥理活性好,是目前臨床上治療哮喘病的理想藥物之一[1]。如圖1所示,昔萘酸沙美特羅的分子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)手性碳原子,有(R)-SalX和(S)-SalX兩個(gè)對(duì)映體。相關(guān)研究[2]發(fā)現(xiàn),它們的藥理活性差異很大,后者對(duì)β2-腎上腺受體的選擇性比前者高4倍,且表現(xiàn)出較少的副作用。隨著世界各國(guó)對(duì)于手性藥物生產(chǎn)和管理的規(guī)范化,對(duì)于沙美特羅替卡松粉吸入劑這種世界上最暢銷(xiāo)的藥物之一,建立昔萘酸沙美特羅對(duì)映體的手性分離分析方法,有助于進(jìn)一步開(kāi)展其單一對(duì)映體的相關(guān)研究,保證臨床用藥的安全有效。

圖 1 昔萘酸沙美特羅的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structural formula of salmeterol xinafoate (SalX)

目前,昔萘酸沙美特羅的手性分離方法主要有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)[3,4]和超臨界流體色譜法(supercritical fluid chromatography, SFC)[5],但是兩種方法的運(yùn)行成本都比較高。毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis, CE)具有操作簡(jiǎn)單、分離效率高、藥品和試劑用量少、可供選擇模式多等優(yōu)點(diǎn)[6],因此在手性藥物分離領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[7,8]。非水毛細(xì)管電泳(nonaqueous capillary electrophoresis, NACE)是CE的一個(gè)重要分支,能夠分離水溶性差或在水相介質(zhì)中分離效果較差的分析物,有利于提高手性選擇劑的識(shí)別能力[9,10]。NACE中常用的手性選擇劑有環(huán)糊精(cyclodextrin, CD)及其衍生物、大環(huán)抗生素、蛋白質(zhì)和多糖等[11]。手性多羥基化合物-硼酸絡(luò)合酸是一類(lèi)新型離子對(duì)手性選擇劑,制備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉,在微乳液毛細(xì)管電動(dòng)色譜(microemulsion electrokinetic chromatography, MEEKC)[12-14]和NACE[15-18]中已成功實(shí)現(xiàn)了多種手性藥物的良好分離。本文以L(fǎng)(+)-酒石酸-硼酸絡(luò)合酸作為手性選擇劑,采用NACE法對(duì)昔萘酸沙美特羅對(duì)映體進(jìn)行分離,并開(kāi)展方法學(xué)研究(包括線(xiàn)性與范圍、檢出限、定量限、精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性等),結(jié)果表明該方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可用于沙美特羅替卡松粉吸入劑中昔萘酸沙美特羅對(duì)映體含量的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CL101A型高效毛細(xì)管電泳儀(北京華陽(yáng)利民儀器公司),所有數(shù)據(jù)采集均在CXTH-3000色譜工作站上完成;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司); BT25S型電子分析天平(北京賽多利斯科儀器公司); PHS-3C型pH計(jì)(上海理達(dá)儀器廠(chǎng))。

L(+)-酒石酸(分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);硼酸(分析純,天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠(chǎng));三乙胺和冰乙酸(分析純,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);甲醇(色譜純,北京百靈威科技有限公司);昔萘酸沙美特羅對(duì)照品(批號(hào)100567-201502,純度為99.9%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;沙美特羅替卡松粉吸入劑(含昔萘酸沙美特羅50.0 μg/泡,批號(hào)為5L7P)由英國(guó)葛蘭素史克公司生產(chǎn)。

1.2 溶液配制

背景緩沖溶液:取適量L(+)-酒石酸和硼酸,精密稱(chēng)定,置于25.0 mL量瓶中,加少量甲醇超聲溶解并定容至刻度,混合均勻,0.22 μm微孔濾膜(有機(jī)系)過(guò)濾,超聲脫氣15.0 min。

對(duì)照品溶液:取適量昔萘酸沙美特羅對(duì)照品,精密稱(chēng)定,溶于甲醇中,配制成2.0 g/L的儲(chǔ)備液,4 ℃冰箱保存,進(jìn)樣前用甲醇稀釋到合適濃度作為對(duì)照品溶液。

樣品溶液:取適量沙美特羅替卡松粉吸入劑泡囊內(nèi)容物,精密稱(chēng)定,用甲醇超聲溶解,4 000 r/min下離心5.0 min,取上清液,用甲醇配制成消旋體質(zhì)量濃度約為2.0 g/L的儲(chǔ)備液,4 ℃冰箱保存,進(jìn)樣前用甲醇稀釋到合適濃度作為樣品溶液。

1.3 CE的條件與方法

未涂層彈性熔融石英毛細(xì)管(內(nèi)徑50.0 μm,總長(zhǎng)度64.5 cm,有效長(zhǎng)度55.5 cm,購(gòu)自河北永年銳灃色譜器件有限公司),在使用前依次用甲醇沖洗10.0 min,超純水沖洗10.0 min, 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液沖洗20.0 min,超純水沖洗至中性,1.0 mol/L鹽酸溶液沖洗20.0 min,超純水沖洗至中性,最后用甲醇沖洗5.0 min。每次進(jìn)樣前,用背景緩沖溶液沖洗3.0 min。重力進(jìn)樣17.5 cm×10.0 s,檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm;室溫;正極進(jìn)樣,負(fù)極檢測(cè);運(yùn)行電壓20.0 kV。

2 結(jié)果與討論

2.1 手性分離條件的優(yōu)化

2.1.1L(+)-酒石酸濃度對(duì)手性分離的影響

手性選擇劑在手性分離中起著至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)在0～140.0 mmol/L范圍內(nèi),考察了L(+)-酒石酸濃度對(duì)手性分離的影響。如圖2所示,保持硼酸濃度為120.0 mmol/L不變,當(dāng)L(+)-酒石酸的濃度由0 mmol/L逐漸增加到120.0 mmol/L時(shí),昔萘酸沙美特羅兩個(gè)對(duì)映體間的分離度(resolution,Rs)總體上逐漸增大,這是由于生成手性絡(luò)合酸的反應(yīng)是可逆的,L(+)-酒石酸濃度的增加促進(jìn)反應(yīng)正向移動(dòng),有利于絡(luò)合酸手性選擇劑生成量的增加;當(dāng)L(+)-酒石酸的濃度從120.0 mmol/L逐漸增加到140.0 mmol/L時(shí),昔萘酸沙美特羅兩個(gè)對(duì)映體間的Rs開(kāi)始減小。本實(shí)驗(yàn)最終選擇120.0 mmol/L作為L(zhǎng)(+)-酒石酸的最佳濃度。

圖 2 L(+)-酒石酸濃度對(duì)手性分離的影響(n=3)Fig. 2 Effect of L(+)-tartaric acid concentration on chiral resolution (n=3)

2.1.2硼酸濃度對(duì)手性分離的影響

保持L(+)-酒石酸濃度為120.0 mmol/L不變,本實(shí)驗(yàn)在0～140.0 mmol/L范圍內(nèi),考察了硼酸濃度對(duì)手性分離的影響。如圖3所示,當(dāng)硼酸濃度由0 mmol/L逐漸增加到120.0 mmol/L時(shí),昔萘酸沙美特羅兩個(gè)對(duì)映體間的Rs總體上逐漸增大,原因與L(+)-酒石酸的影響類(lèi)似,硼酸濃度的增加促進(jìn)了絡(luò)合酸手性選擇劑生成量的增加;當(dāng)硼酸的濃度超過(guò)120.0 mmol/L時(shí),昔萘酸沙美特羅兩個(gè)對(duì)映體間的Rs減小。本實(shí)驗(yàn)最終選擇120.0 mmol/L作為硼酸的最佳濃度。

圖 3 硼酸濃度對(duì)手性分離的影響(n=3)Fig. 3 Effect of boric acid concentration on chiral resolution (n=3)

2.1.3表觀(guān)pH對(duì)手性分離的影響

NACE中緩沖液的酸度用表觀(guān)pH(apparent pH, pH*)來(lái)表示,它是影響手性分離的重要參數(shù)之一。不同濃度的冰乙酸和三乙胺會(huì)影響緩沖溶液的pH*,進(jìn)而影響手性藥物的解離程度和手性選擇劑的生成量,同時(shí)改變電滲流(electroosmotic flow, EOF)的大小,改善分離效果[19]。保持L(+)-酒石酸和硼酸濃度均為120.0 mmol/L不變,改變冰乙酸和三乙胺的濃度,在pH*0.53～1.02范圍內(nèi)考察昔萘酸沙美特羅遷移時(shí)間(migration time,t)和Rs的變化(見(jiàn)圖4)。隨著pH*逐漸增大,EOF減小,兩個(gè)對(duì)映體的t增加;當(dāng)pH*從0.53逐漸增加到0.93時(shí),Rs達(dá)到2.18;繼續(xù)增加三乙胺濃度來(lái)增大pH*,昔萘酸沙美特羅的兩個(gè)對(duì)映體由于t太長(zhǎng),樣品擴(kuò)散,Rs降低。本實(shí)驗(yàn)最終選擇0.93為最佳pH*。

圖 4 pH* 對(duì)手性分離的影響(n=3)Fig. 4 Effect of pH* on chiral resolution (n=3)

本實(shí)驗(yàn)確定的最佳緩沖溶液為:含120.0 mmol/L L(+)-酒石酸和120.0 mmol/L硼酸的甲醇溶液(pH*=0.93),其他電泳條件見(jiàn)1.3節(jié)。如圖5所示,在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,昔萘酸沙美特羅的兩個(gè)對(duì)映體實(shí)現(xiàn)了良好分離。

圖 5 L(+)-酒石酸-硼酸絡(luò)合酸作為手性選擇劑的NACE法分離昔萘酸沙美特羅對(duì)映體機(jī)理示意圖Fig. 5 Schematic diagram of the separation mechanism for SalX enantiomers with L(+)-tartaric acid-boric acid complex as chiral selector in NACE

2.2 手性分離機(jī)理

如圖5所示,L(+)-酒石酸是一種手性多羥基化合物,分子結(jié)構(gòu)中含有一對(duì)順-鄰二羥基,可以和硼酸在甲醇溶液中按照物質(zhì)的量之比2∶1生成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的L(+)-酒石酸-硼酸絡(luò)合酸,這種環(huán)狀結(jié)構(gòu)能夠限制單鍵的旋轉(zhuǎn),固定手性中心,使手性絡(luò)合酸與兩個(gè)對(duì)映體空間匹配方面的差別增大,從而提高其手性識(shí)別作用[15-18]。由于這個(gè)反應(yīng)是可逆的,無(wú)法獲得純凈的絡(luò)合酸產(chǎn)物。在本實(shí)驗(yàn)的緩沖體系中,L(+)-酒石酸-硼酸絡(luò)合酸解離生成絡(luò)合酸陰離子,它是NACE手性分離中真正的手性選擇劑;昔萘酸沙美特羅解離生成(R)-Sal+和(S)-Sal+兩個(gè)陽(yáng)離子,它們可以和手性絡(luò)合酸陰離子分別生成暫穩(wěn)態(tài)的離子對(duì)化合物,由于二者生成離子對(duì)化合物的平衡常數(shù)不同,在NACE中的表觀(guān)遷移速率也不同,從而實(shí)現(xiàn)手性分離。

圖 6 NACE系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖Fig. 6 Chromatograms in system suitability test by NACE Peak identifications: 1. enantiomer 1; 2. enantiomer 2; 3. fluticasone propionate.

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液和市售制劑樣品溶液,在優(yōu)化的手性分離條件下進(jìn)樣檢測(cè)。如圖6所示,昔萘酸沙美特羅兩個(gè)對(duì)映體的色譜峰峰形對(duì)稱(chēng),Rs大于2.0,且理論塔板數(shù)、拖尾因子和重復(fù)性可滿(mǎn)足分析要求,沙美特羅替卡松粉吸入劑中的丙酸氟替卡松不干擾分離。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線(xiàn)性與范圍

精密量取2.0 g/L的昔萘酸沙美特羅對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,用甲醇稀釋成55.0、100.0、200.0、400.0、800.0、1 600.0 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,在優(yōu)化的電泳條件下進(jìn)樣檢測(cè),每份溶液平行測(cè)3次,記錄每個(gè)對(duì)映體的峰面積。如表1所示,昔萘酸沙美特羅對(duì)映體1和對(duì)映體2在27.5～800.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi),與峰面積均呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.999 1和0.999 2。

2.4.2檢出限與定量限

以信噪比為3(S/N=3)和10(S/N=10)確定檢出限和定量限。如表1所示,昔萘酸沙美特羅對(duì)映體1和對(duì)映體2的檢出限和定量限分別為7.5和25.0 mg/L。

表 1 L(+)-酒石酸-硼酸絡(luò)合物為手性選擇劑的NACE方法的驗(yàn)證結(jié)果

2.4.3精密度

取0.8 g/L的昔萘酸沙美特羅對(duì)照品甲醇溶液,在優(yōu)化的電泳條件下進(jìn)樣檢測(cè),記錄每個(gè)對(duì)映體的遷移時(shí)間和峰面積。同一日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定日內(nèi)精密度;每天進(jìn)樣3次,連續(xù)進(jìn)樣5天,測(cè)定日間精密度。如表1所示,昔萘酸沙美特羅對(duì)映體1和對(duì)映體2遷移時(shí)間和峰面積的日內(nèi)和日間精密度RSD值分別低于1.9%和4.9%,說(shuō)明該方法的精密度良好。

2.4.4樣品溶液的穩(wěn)定性

取0.8 g/L的樣品溶液,分別放置0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0和24.0 h之后,在優(yōu)化的電泳條件下進(jìn)樣檢測(cè),每份溶液平行測(cè)3次,記錄每個(gè)對(duì)映體的遷移時(shí)間和峰面積。結(jié)果表明,樣品溶液中昔萘酸沙美特羅對(duì)映體1和對(duì)映體2遷移時(shí)間的RSD分別為1.3%和1.1%,峰面積的RSD分別為3.9%和4.5%,說(shuō)明該樣品溶液在24.0 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5加標(biāo)回收率

精密量取183.5 mg/L的樣品溶液0.2 mL共9份,平均分為3組,使用微量進(jìn)樣器分別加入15.0、17.5和20.0 μL昔萘酸沙美特羅對(duì)照品儲(chǔ)備液(2.0 g/L),獲得低、中和高3組加標(biāo)樣品溶液,每組3份樣品,在優(yōu)化的電泳條件下進(jìn)樣檢測(cè),每份溶液平行測(cè)3次,記錄每個(gè)對(duì)映體的峰面積。如表2所示,昔萘酸沙美特羅對(duì)映體1和對(duì)映體2的加標(biāo)回收率分別為99.3%～100.1%和99.8%～100.4%, RSD在1.2%～1.9%之間,說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表 2 沙美特羅替卡松粉吸入劑中昔萘酸沙美特羅對(duì)映體的 加標(biāo)回收率(n=3)

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

取適量市售沙美特羅替卡松粉吸入劑6份,配制樣品溶液,對(duì)其昔萘酸沙美特羅對(duì)映體的含量進(jìn)行測(cè)定。在優(yōu)化的電泳條件下進(jìn)樣檢測(cè),每份溶液平行測(cè)定3次,記錄每個(gè)對(duì)映體的峰面積,計(jì)算含量。根據(jù)公式“標(biāo)示量百分含量=(測(cè)得量/標(biāo)示量)×100%”計(jì)算每個(gè)對(duì)映體的標(biāo)示量百分含量。本實(shí)驗(yàn)所使用的沙美特羅替卡松吸入粉劑中昔萘酸沙美特羅的標(biāo)示量為50.0 μg/泡,兩個(gè)對(duì)映體的標(biāo)示量分別按照25.0 μg/泡計(jì)算。結(jié)果顯示,對(duì)映體1和對(duì)映體2的標(biāo)示量百分含量均為98.7%, RSD分別為2.5%和2.7%,測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性良好。

3 結(jié)論

L(+)-酒石酸-硼酸絡(luò)合酸價(jià)廉易得,本文以其作為手性選擇劑建立了NACE手性分離方法,成功實(shí)現(xiàn)了昔萘酸沙美特羅對(duì)映體的基線(xiàn)分離。該方法操作簡(jiǎn)單、快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可用于市售沙美特羅替卡松粉吸入劑中昔萘酸沙美特羅對(duì)映體含量的測(cè)定。