羅小娟,曹科,陳詩(shī)楊,付笑迎,毛曉寧,張艷,李長(zhǎng)鋼,陳運(yùn)生(深圳市兒童醫(yī)院,.檢驗(yàn)科,.血液腫瘤科,廣東深圳518038)
非肌性肌球蛋白重鏈9基因相關(guān)疾?。╪onmuscle myosin heavy chain 9 related diseases,
MYH9-RD)是一種罕見(jiàn)的常染色體顯性遺傳病,是由定位于人類染色體22q12.3的編碼非肌性肌球蛋白重鏈ⅡA(nonmuscle myosin heavy chainⅡA,NMMHC-ⅡA)的MYH9基因突變導(dǎo)致的一類疾病。NMMHC-ⅡA及其亞型在血細(xì)胞、腎臟、晶狀體和耳蝸等中廣泛存在,參與構(gòu)成非肌細(xì)胞骨架。而在粒細(xì)胞、血小板和巨核細(xì)胞中僅特異表達(dá)NMMHC-ⅡA[1]。MYH9-RD典型血液系統(tǒng)表現(xiàn)為血小板數(shù)量減少、巨大血小板和粒細(xì)胞異常包涵體“三聯(lián)征”和不同程度的出血癥狀,可伴發(fā)腎炎、耳聾、白內(nèi)障和肝功能異常等血液系統(tǒng)外表現(xiàn),其臨床表型異質(zhì)性明顯。既往認(rèn)為獨(dú)立的4種不同綜合征,包括Fechtner綜合征(FTNS:MIM 153640)、Sebastian綜合征(SBS:MIM 605249)、Epstein綜合征(EPTS:MIM 153650)、May-Hegglin異常(MHA:MIM 155100),現(xiàn)已被證實(shí)均是MYH9基因突變導(dǎo)致的具有連續(xù)臨床譜系的不同亞型,統(tǒng)稱MYH9相關(guān)疾?。∕YH9-RD:MIM 160775)[2]。研 究 表明MYH9基因發(fā)生突變的位點(diǎn)多樣且頻率不一,MYH9-RD臨床癥狀表現(xiàn)復(fù)雜,基因突變和臨床表型之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系和病理生理機(jī)制尚不明確[3]。經(jīng)文獻(xiàn)檢索,國(guó)內(nèi)自2001年徐敏等[4]診斷并報(bào)道了第一個(gè)家系,截至2021年2月已累計(jì)報(bào)道42例家系。本研究對(duì)深圳市兒童醫(yī)院發(fā)現(xiàn)的1個(gè)MYH9-RD家系的致病突變基因和臨床特征進(jìn)行鑒定分析,發(fā)現(xiàn)該家系存在MYH9基因c.5765+2T>A(p.R1922Rfs*43)剪接突變,導(dǎo)致Fechtner綜合征,為國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)。
1.1 對(duì)象 先證者(Ⅲ1,圖1),女,4歲2個(gè)月,因“消化不良”于本院消化內(nèi)科門診就診,既往有“鼻衄”病史,血常規(guī)結(jié)果:WBC 6.26×109/L,RBC 4.31×1012/L,Hb 130 g/L,PLT 68×109/L,尿常規(guī)潛血2+,尿蛋白±,尿沉渣鏡檢RBC 7~10/HP,尿異形紅細(xì)胞占比35%,提示腎源性血尿。血涂片鏡檢見(jiàn)巨大血小板、血小板減少和粒細(xì)胞異常包涵體“三聯(lián)征”,高度提示MYH9-RD。經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào):2021011)和患兒家屬知情同意后,進(jìn)一步調(diào)查家系成員病史資料、臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo),并分析MYH9基因變異情況。
1.2 主要儀器與試劑 XN-L350血細(xì)胞分析儀及其配套試劑(日本希森美康公司),BX43顯微鏡(日本奧林巴斯公司),Combi Scan 500全自動(dòng)尿液分析儀及其配套試劑(德國(guó)愛(ài)諾公司),C16000全自動(dòng)生化分析儀及其配套試劑(美國(guó)雅培公司),STA-R Evolution全自動(dòng)血凝分析儀及其配套試劑(法國(guó)STAGO公司),CantoⅡ流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)BD公司),LEPU-8800血栓彈力圖儀(樂(lè)普公司),Illumina Nextseq500高通量測(cè)序儀器(美國(guó)Illumina公司)。CD41-PC5、CD42b-FITC、CD62p-PE試劑(貝克曼庫(kù)爾特公司)等。
1.3 標(biāo)本采集與處理 采集研究對(duì)象空腹靜脈血2 mL,EDTA-K2抗凝,制作血涂片2張。采集研究對(duì)象空腹靜脈血5 mL于干燥管,靜置2 h后3 000 r/min離心5 min取血清,8 h內(nèi)完成腎功能、肝功能檢測(cè)。采集研究對(duì)象空腹靜脈血3 mL,枸櫞酸鈉(濃度3.2%)抗凝,2 h內(nèi)完成血栓彈力圖和凝血分析。收集二次晨尿,2 h內(nèi)完成尿液常規(guī)分析和尿沉渣紅細(xì)胞形態(tài)檢查。鏡檢由2位有3年以上工作經(jīng)驗(yàn)的主管技師共同完成。
1.4 方法
1.4.1 調(diào)查收集家系成員病史資料并完善實(shí)驗(yàn)室檢查 按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第3版)》,采用手工法計(jì)數(shù)血小板數(shù)量;血涂片經(jīng)瑞氏染色后顯微鏡觀察血小板形態(tài)和粒細(xì)胞異常包涵體,顯微鏡觀察尿沉渣中紅細(xì)胞形態(tài)。按照儀器和試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè),腎功能指標(biāo):半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(CysC)、肌酐(Cr)、尿酸(UA);肝功能指標(biāo):丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、γ谷氨?;D(zhuǎn)移酶(r-GGT);凝血四項(xiàng):凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)、纖維蛋白原(Fib);檢測(cè)血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa(CD41/61)、GPⅠb(CD42b)和CD62p表達(dá),用血栓彈力圖凝血綜合指數(shù)CI評(píng)估患者凝血全貌。
1.4.2 MYH9基因突變位點(diǎn)分析 采用芯片捕獲高通量測(cè)序方法,以患者外周靜脈血提取基因組DNA,先將DNA打斷并制備文庫(kù),然后通過(guò)芯片對(duì)MYH9基因編碼區(qū)及臨近剪切區(qū)的DNA進(jìn)行捕獲和富集,目標(biāo)區(qū)捕獲高通量測(cè)序參數(shù):目標(biāo)區(qū)長(zhǎng)度(bp)5 883,目標(biāo)區(qū)覆蓋度100.00%,目標(biāo)區(qū)平均深度(X)146.33,目標(biāo)區(qū)平均深度>30X位點(diǎn)所占比例100.00%。最后使用高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行突變檢測(cè)。數(shù)據(jù)解讀規(guī)則參考美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)相關(guān)指南,變異命名參照HGVS建議規(guī)則(http://www.hgvs.org/mutnomen/)。確定突變位點(diǎn)后,對(duì)先證者和家系成員進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。MYH9基因突變位點(diǎn)分析由深圳華大公司臨床檢驗(yàn)中心完成。
2.1 臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果 該家系三代共有4人患病,家系圖見(jiàn)圖1。非近親結(jié)婚,第一、二、三代均有患者,符合常染色體顯性遺傳規(guī)律。患病成員均有“鼻衄、瘀斑紫癜、外傷血腫或月經(jīng)量增多”病史,血小板數(shù)量均降低,血涂片鏡檢均發(fā)現(xiàn)巨大血小板和粒細(xì)胞異常包涵體(圖2),存在典型“三聯(lián)征”。臨床表現(xiàn)為鏡下血尿和蛋白尿,尿沉渣紅細(xì)胞形態(tài)分析,可見(jiàn)環(huán)形、出芽狀、炸面包圈樣和小紅細(xì)胞等異常紅細(xì)胞占比增加,提示腎源性血尿。肝腎功能、聽(tīng)力和眼科檢查正常。PT、APTT、TT、Fib和血小板膜糖蛋白表達(dá)正常。血栓彈力圖凝血綜合指數(shù)CI值減低。該家系成員臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果見(jiàn)表1。
圖1 MYH9-RD患者家系圖
圖2 血涂片細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征
表1 MYH9-RD家系成員臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果
2.2 MYH9基因突變位點(diǎn)分析 家系中所有患者M(jìn)YH9基因第40內(nèi)含子供體剪接位點(diǎn)均發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義突變c.5765+2T>A(p.R1922Rfs*43),見(jiàn)圖3。且該基因突變與疾病表型共分離,是該家系MYH9-RD的致病突變。
圖3 MYH9基因突變位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果
MYH9基因編碼的NMMHC-ⅡA蛋白結(jié)構(gòu)組成包含N端球部具有ATP酶活性和動(dòng)力功能的頭部(第2~19外顯子)、頸部連接區(qū)(第20外顯子)及C端環(huán)狀螺旋桿狀尾部(第21~41外顯子)。目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道MYH9-RD高達(dá)137種致病突變,其中大多數(shù)為單核苷酸替代錯(cuò)義突變,以D1424N、R702C、R1933X和E1841K四種錯(cuò)義突變最常見(jiàn),少部分為重復(fù)或缺失導(dǎo)致的移碼突變[5-6]。國(guó)內(nèi)已報(bào)道的MYH9-RD涉及42個(gè)家系16種基因突變類型(見(jiàn) 表2),其 中R702H、D1424N、E1841K、R1933X四種突變合計(jì)27個(gè)家系(占64%),與國(guó)外報(bào)道基本相似,提示MYH9基因存在熱點(diǎn)突變,且不同人種和不同地域之間差異不大。本家系MYH9基因第40內(nèi)含子供體剪接位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義突變c.5765+2T>A,該基因突變與疾病表型共分離,為該MYH9-RD家系的致病突變,為國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn),國(guó)際第2例報(bào)道[3]。
表2 國(guó)內(nèi)已報(bào)道的MYH9-RD家系的基因突變類型(42個(gè)家系)
MYH9-RD在pubmed被描述為“伴有或不伴有腎炎或感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失的巨血小板減少癥和粒細(xì)胞包涵體”,臨床表型具有高度異質(zhì)性。本家系患者具有典型血液系統(tǒng)“三聯(lián)征”,伴發(fā)血尿、蛋白尿等慢性腎炎癥狀,亞型分類為Fechtner綜合征。研究表明,突變位于NMMHC-ⅡA頭部ATP酶活性和動(dòng)力區(qū),可影響ATP分解及肌動(dòng)蛋白牽動(dòng)能力,血液系統(tǒng)表現(xiàn)為數(shù)量更低的血小板和較重的出血傾向,伴發(fā)腎炎、耳聾等非血液系統(tǒng)癥狀風(fēng)險(xiǎn)更高且進(jìn)展更快[27-28]。然而,新近報(bào)道的一些位于桿尾區(qū)的突變可表現(xiàn)為早發(fā)且快進(jìn)型腎衰竭等嚴(yán)重表型[11]。不同家系的相同位點(diǎn)突變或者相同位點(diǎn)不同氨基酸替代導(dǎo)致不同表型[29-30],同一家系相同突變基因型亦可有較大的表型差異[31]。MYH9-RD表型異質(zhì)性可能與年齡相關(guān)的不同病理進(jìn)展階段有關(guān),也可能存在環(huán)境或者表觀遺傳學(xué)等其他遺傳因素影響。本家系突變位點(diǎn)在第40號(hào)內(nèi)含子c.5765+2T>A,位于表型較輕的NMMHC-ⅡA尾部區(qū)域,但臨床表型為典型“三聯(lián)征”伴發(fā)腎炎,可能與該突變位點(diǎn)引起c.5765+51位置的隱蔽剪接供體位點(diǎn)GT的暴露,導(dǎo)致mRNA從內(nèi)含子40位置插入了50個(gè)核苷酸,并在第41外顯子提前出現(xiàn)終止密碼子,導(dǎo)致了移碼并預(yù)測(cè)異常蛋白p.R1922Rfs*43[3]而非單一氨基酸改變有關(guān)?;仡櫛静±呐R床特征、實(shí)驗(yàn)室檢查和基因診斷過(guò)程,血涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)“三聯(lián)征”是關(guān)鍵重要環(huán)節(jié)。巨大血小板可在低倍鏡下迅速被發(fā)現(xiàn),MYH9-RD血小板顆粒無(wú)異常,可見(jiàn)粒細(xì)胞異常包涵體,與血小板顆粒減少或缺失的灰色血小板綜合征(GPS)和巨大血小板綜合征(BSS)等遺傳性巨大血小板減少癥相鑒別?!堆?xì)胞分析報(bào)告規(guī)范化指南》[32]明確指出:粒細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)異常包涵體合并巨血小板性血小板減少,高度提示MYH9相關(guān)綜合征,應(yīng)建議進(jìn)一步行MYH9基因檢查。通過(guò)規(guī)范血細(xì)胞分析報(bào)告和重視形態(tài)學(xué)檢查,有望提高M(jìn)YH9-RD的檢出率。