羅小娟，曹科，陳詩(shī)楊，付笑迎，毛曉寧，張艷，李長(zhǎng)鋼，陳運(yùn)生（深圳市兒童醫(yī)院，.檢驗(yàn)科，.血液腫瘤科，廣東深圳518038）

非肌性肌球蛋白重鏈9基因相關(guān)疾?。╪onmuscle myosin heavy chain 9 related diseases，

MYH9-RD）是一種罕見(jiàn)的常染色體顯性遺傳病，是由定位于人類染色體22q12.3的編碼非肌性肌球蛋白重鏈ⅡA（nonmuscle myosin heavy chainⅡA，NMMHC-ⅡA）的MYH9基因突變導(dǎo)致的一類疾病。NMMHC-ⅡA及其亞型在血細(xì)胞、腎臟、晶狀體和耳蝸等中廣泛存在，參與構(gòu)成非肌細(xì)胞骨架。而在粒細(xì)胞、血小板和巨核細(xì)胞中僅特異表達(dá)NMMHC-ⅡA［1］。MYH9-RD典型血液系統(tǒng)表現(xiàn)為血小板數(shù)量減少、巨大血小板和粒細(xì)胞異常包涵體“三聯(lián)征”和不同程度的出血癥狀，可伴發(fā)腎炎、耳聾、白內(nèi)障和肝功能異常等血液系統(tǒng)外表現(xiàn)，其臨床表型異質(zhì)性明顯。既往認(rèn)為獨(dú)立的4種不同綜合征，包括Fechtner綜合征（FTNS：MIM 153640）、Sebastian綜合征（SBS：MIM 605249）、Epstein綜合征（EPTS：MIM 153650）、May-Hegglin異常（MHA：MIM 155100），現(xiàn)已被證實(shí)均是MYH9基因突變導(dǎo)致的具有連續(xù)臨床譜系的不同亞型，統(tǒng)稱MYH9相關(guān)疾?。∕YH9-RD：MIM 160775）［2］。研 究 表明MYH9基因發(fā)生突變的位點(diǎn)多樣且頻率不一，MYH9-RD臨床癥狀表現(xiàn)復(fù)雜，基因突變和臨床表型之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系和病理生理機(jī)制尚不明確［3］。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，國(guó)內(nèi)自2001年徐敏等［4］診斷并報(bào)道了第一個(gè)家系，截至2021年2月已累計(jì)報(bào)道42例家系。本研究對(duì)深圳市兒童醫(yī)院發(fā)現(xiàn)的1個(gè)MYH9-RD家系的致病突變基因和臨床特征進(jìn)行鑒定分析，發(fā)現(xiàn)該家系存在MYH9基因c.5765＋2T＞A（p.R1922Rfs*43）剪接突變，導(dǎo)致Fechtner綜合征，為國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 先證者（Ⅲ1，圖1），女，4歲2個(gè)月，因“消化不良”于本院消化內(nèi)科門診就診，既往有“鼻衄”病史，血常規(guī)結(jié)果：WBC 6.26×109／L，RBC 4.31×1012／L，Hb 130 g／L，PLT 68×109／L，尿常規(guī)潛血2＋，尿蛋白±，尿沉渣鏡檢RBC 7～10／HP，尿異形紅細(xì)胞占比35%，提示腎源性血尿。血涂片鏡檢見(jiàn)巨大血小板、血小板減少和粒細(xì)胞異常包涵體“三聯(lián)征”，高度提示MYH9-RD。經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：2021011）和患兒家屬知情同意后，進(jìn)一步調(diào)查家系成員病史資料、臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)，并分析MYH9基因變異情況。

1.2 主要儀器與試劑 XN-L350血細(xì)胞分析儀及其配套試劑（日本希森美康公司），BX43顯微鏡（日本奧林巴斯公司），Combi Scan 500全自動(dòng)尿液分析儀及其配套試劑（德國(guó)愛(ài)諾公司），C16000全自動(dòng)生化分析儀及其配套試劑（美國(guó)雅培公司），STA-R Evolution全自動(dòng)血凝分析儀及其配套試劑（法國(guó)STAGO公司），CantoⅡ流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)BD公司），LEPU-8800血栓彈力圖儀（樂(lè)普公司），Illumina Nextseq500高通量測(cè)序儀器（美國(guó)Illumina公司）。CD41-PC5、CD42b-FITC、CD62p-PE試劑（貝克曼庫(kù)爾特公司）等。

1.3 標(biāo)本采集與處理 采集研究對(duì)象空腹靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，制作血涂片2張。采集研究對(duì)象空腹靜脈血5 mL于干燥管，靜置2 h后3 000 r／min離心5 min取血清，8 h內(nèi)完成腎功能、肝功能檢測(cè)。采集研究對(duì)象空腹靜脈血3 mL，枸櫞酸鈉（濃度3.2%）抗凝，2 h內(nèi)完成血栓彈力圖和凝血分析。收集二次晨尿，2 h內(nèi)完成尿液常規(guī)分析和尿沉渣紅細(xì)胞形態(tài)檢查。鏡檢由2位有3年以上工作經(jīng)驗(yàn)的主管技師共同完成。

1.4 方法

1.4.1 調(diào)查收集家系成員病史資料并完善實(shí)驗(yàn)室檢查 按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程（第3版）》，采用手工法計(jì)數(shù)血小板數(shù)量；血涂片經(jīng)瑞氏染色后顯微鏡觀察血小板形態(tài)和粒細(xì)胞異常包涵體，顯微鏡觀察尿沉渣中紅細(xì)胞形態(tài)。按照儀器和試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)，腎功能指標(biāo)：半胱氨酸蛋白酶抑制劑C（CysC）、肌酐（Cr）、尿酸（UA）；肝功能指標(biāo)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、γ谷氨?；D(zhuǎn)移酶（r-GGT）；凝血四項(xiàng)：凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血酶時(shí)間（TT）、纖維蛋白原（Fib）；檢測(cè)血小板膜糖蛋白（GP）Ⅱb／Ⅲa（CD41／61）、GPⅠb（CD42b）和CD62p表達(dá)，用血栓彈力圖凝血綜合指數(shù)CI評(píng)估患者凝血全貌。

1.4.2 MYH9基因突變位點(diǎn)分析 采用芯片捕獲高通量測(cè)序方法，以患者外周靜脈血提取基因組DNA，先將DNA打斷并制備文庫(kù)，然后通過(guò)芯片對(duì)MYH9基因編碼區(qū)及臨近剪切區(qū)的DNA進(jìn)行捕獲和富集，目標(biāo)區(qū)捕獲高通量測(cè)序參數(shù)：目標(biāo)區(qū)長(zhǎng)度（bp）5 883，目標(biāo)區(qū)覆蓋度100.00%，目標(biāo)區(qū)平均深度（X）146.33，目標(biāo)區(qū)平均深度＞30X位點(diǎn)所占比例100.00%。最后使用高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行突變檢測(cè)。數(shù)據(jù)解讀規(guī)則參考美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)院（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）相關(guān)指南，變異命名參照HGVS建議規(guī)則（http：／／www.hgvs.org／mutnomen／）。確定突變位點(diǎn)后，對(duì)先證者和家系成員進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。MYH9基因突變位點(diǎn)分析由深圳華大公司臨床檢驗(yàn)中心完成。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果 該家系三代共有4人患病，家系圖見(jiàn)圖1。非近親結(jié)婚，第一、二、三代均有患者，符合常染色體顯性遺傳規(guī)律。患病成員均有“鼻衄、瘀斑紫癜、外傷血腫或月經(jīng)量增多”病史，血小板數(shù)量均降低，血涂片鏡檢均發(fā)現(xiàn)巨大血小板和粒細(xì)胞異常包涵體（圖2），存在典型“三聯(lián)征”。臨床表現(xiàn)為鏡下血尿和蛋白尿，尿沉渣紅細(xì)胞形態(tài)分析，可見(jiàn)環(huán)形、出芽狀、炸面包圈樣和小紅細(xì)胞等異常紅細(xì)胞占比增加，提示腎源性血尿。肝腎功能、聽(tīng)力和眼科檢查正常。PT、APTT、TT、Fib和血小板膜糖蛋白表達(dá)正常。血栓彈力圖凝血綜合指數(shù)CI值減低。該家系成員臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 MYH9-RD患者家系圖

圖2 血涂片細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征

表1 MYH9-RD家系成員臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

2.2 MYH9基因突變位點(diǎn)分析 家系中所有患者M(jìn)YH9基因第40內(nèi)含子供體剪接位點(diǎn)均發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義突變c.5765＋2T＞A（p.R1922Rfs*43），見(jiàn)圖3。且該基因突變與疾病表型共分離，是該家系MYH9-RD的致病突變。

圖3 MYH9基因突變位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

MYH9基因編碼的NMMHC-ⅡA蛋白結(jié)構(gòu)組成包含N端球部具有ATP酶活性和動(dòng)力功能的頭部（第2～19外顯子）、頸部連接區(qū)（第20外顯子）及C端環(huán)狀螺旋桿狀尾部（第21～41外顯子）。目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道MYH9-RD高達(dá)137種致病突變，其中大多數(shù)為單核苷酸替代錯(cuò)義突變，以D1424N、R702C、R1933X和E1841K四種錯(cuò)義突變最常見(jiàn)，少部分為重復(fù)或缺失導(dǎo)致的移碼突變［5-6］。國(guó)內(nèi)已報(bào)道的MYH9-RD涉及42個(gè)家系16種基因突變類型（見(jiàn) 表2），其 中R702H、D1424N、E1841K、R1933X四種突變合計(jì)27個(gè)家系（占64%），與國(guó)外報(bào)道基本相似，提示MYH9基因存在熱點(diǎn)突變，且不同人種和不同地域之間差異不大。本家系MYH9基因第40內(nèi)含子供體剪接位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)錯(cuò)義突變c.5765＋2T＞A，該基因突變與疾病表型共分離，為該MYH9-RD家系的致病突變，為國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)，國(guó)際第2例報(bào)道［3］。

表2 國(guó)內(nèi)已報(bào)道的MYH9-RD家系的基因突變類型（42個(gè)家系）

MYH9-RD在pubmed被描述為“伴有或不伴有腎炎或感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失的巨血小板減少癥和粒細(xì)胞包涵體”，臨床表型具有高度異質(zhì)性。本家系患者具有典型血液系統(tǒng)“三聯(lián)征”，伴發(fā)血尿、蛋白尿等慢性腎炎癥狀，亞型分類為Fechtner綜合征。研究表明，突變位于NMMHC-ⅡA頭部ATP酶活性和動(dòng)力區(qū)，可影響ATP分解及肌動(dòng)蛋白牽動(dòng)能力，血液系統(tǒng)表現(xiàn)為數(shù)量更低的血小板和較重的出血傾向，伴發(fā)腎炎、耳聾等非血液系統(tǒng)癥狀風(fēng)險(xiǎn)更高且進(jìn)展更快［27-28］。然而，新近報(bào)道的一些位于桿尾區(qū)的突變可表現(xiàn)為早發(fā)且快進(jìn)型腎衰竭等嚴(yán)重表型［11］。不同家系的相同位點(diǎn)突變或者相同位點(diǎn)不同氨基酸替代導(dǎo)致不同表型［29-30］，同一家系相同突變基因型亦可有較大的表型差異［31］。MYH9-RD表型異質(zhì)性可能與年齡相關(guān)的不同病理進(jìn)展階段有關(guān)，也可能存在環(huán)境或者表觀遺傳學(xué)等其他遺傳因素影響。本家系突變位點(diǎn)在第40號(hào)內(nèi)含子c.5765＋2T＞A，位于表型較輕的NMMHC-ⅡA尾部區(qū)域，但臨床表型為典型“三聯(lián)征”伴發(fā)腎炎，可能與該突變位點(diǎn)引起c.5765＋51位置的隱蔽剪接供體位點(diǎn)GT的暴露，導(dǎo)致mRNA從內(nèi)含子40位置插入了50個(gè)核苷酸，并在第41外顯子提前出現(xiàn)終止密碼子，導(dǎo)致了移碼并預(yù)測(cè)異常蛋白p.R1922Rfs*43［3］而非單一氨基酸改變有關(guān)?；仡櫛静±呐R床特征、實(shí)驗(yàn)室檢查和基因診斷過(guò)程，血涂片鏡檢發(fā)現(xiàn)“三聯(lián)征”是關(guān)鍵重要環(huán)節(jié)。巨大血小板可在低倍鏡下迅速被發(fā)現(xiàn)，MYH9-RD血小板顆粒無(wú)異常，可見(jiàn)粒細(xì)胞異常包涵體，與血小板顆粒減少或缺失的灰色血小板綜合征（GPS）和巨大血小板綜合征（BSS）等遺傳性巨大血小板減少癥相鑒別?！堆?xì)胞分析報(bào)告規(guī)范化指南》［32］明確指出：粒細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)異常包涵體合并巨血小板性血小板減少，高度提示MYH9相關(guān)綜合征，應(yīng)建議進(jìn)一步行MYH9基因檢查。通過(guò)規(guī)范血細(xì)胞分析報(bào)告和重視形態(tài)學(xué)檢查，有望提高M(jìn)YH9-RD的檢出率。