王海永，徐敏，李曉軍（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京1000；.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)科，南京1000）

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性的、炎癥性的自身免疫性疾?。?］，病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不清楚。目前，多項(xiàng)研究證實(shí)RA患者體內(nèi)存在針對(duì)瓜氨酸化組蛋白的自身抗體［2-3］以及針對(duì)天然組蛋白的自身抗體［4-5］，提示組蛋白可能與RA的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。本課題組前期利用質(zhì)譜和生物信息學(xué)分析技術(shù)，對(duì)RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和分析發(fā)現(xiàn)組蛋白H2A在RA患者滑膜組織中有差異性表達(dá)［6］。為進(jìn)一步驗(yàn)證質(zhì)譜鑒定的結(jié)果，本研究通過(guò)在大腸埃希菌中原核表達(dá)并純化組蛋白H2A，以H2A作為靶抗原，建立檢測(cè)血清中抗H2A抗體的間接ELISA技術(shù)，比較分析RA患者和健康人對(duì)照血清中的抗H2A抗體水平。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集自2016年2月至2017年1月東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院的門(mén)診和住院RA患者共50例，其中男性13例，女性37例，年齡（47.4±16.8）歲，納入條件符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)學(xué)會(huì)／歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（ACR／EULAR）的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，排除合并嚴(yán)重內(nèi)外科疾病以及其他自身免疫病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥以及干燥綜合征的病例。健康人對(duì)照50例，來(lái)自本院體檢健康者，男性13例，女性37例，年齡（38.6±12.3）歲，排除有明顯自身免疫傾向的健康者。抽取研究對(duì)象早晨空腹靜脈血3～5 mL，3 500 r／min離心5 min分離血清，血清貯存于－70℃凍存?zhèn)溆茫瑹o(wú)脂血、溶血等情況。

1.2 菌株、載體、主要試劑和儀器 表達(dá)宿主菌BL21（DE3）（北京TransGen生物技術(shù)公司），表達(dá)載體pET28a（東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存），PCR引物（美國(guó)Invitrogen公司），限制性?xún)?nèi)切酶Eco RⅠ、NdeⅠ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、PCR反應(yīng)緩沖液和核酸標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量（大連TakaRa公司），質(zhì)粒抽提純化試劑盒及DNA凝膠電泳回收試劑盒（美國(guó)Axygen公司），異丙基硫代半乳糖苷（IPTG，德國(guó)Merck公司），Ni-resin（德國(guó)Novagen公司），BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（上海碧云天公司），抗H2A抗體陽(yáng)性血清、HRP－抗人IgG（美國(guó)Sigma公司），PTC-200 PCR基因擴(kuò)增儀（美國(guó)MJResearch公司），酶聯(lián)儀、蛋白質(zhì)電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司），超聲粉碎儀（美國(guó)Sonics公司）。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)H2A基因cds序列和pET28a表達(dá)載體的MCS位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性PCR引物，用于擴(kuò)增H2A基因，H2A-F1：5′-TTCCATATGTC TGGACGTGGCAAGCAGGGA-3′，H2A-R1：5′-CCGG AATTCTTACTTGCCCTTCGCCTTGTGGT-3′；其 中H2A-F1中含有NdeⅠ酶切位點(diǎn)；H2A-R1中含有Eco RⅠ酶切位點(diǎn)。

1.4 H2A／pET28a重組質(zhì)粒的構(gòu)建 RT-PCR擴(kuò)增H2A基因，利用限制性?xún)?nèi)切酶Eco RⅠ／NdeⅠ同時(shí)雙酶切PCR產(chǎn)物和pET28a表達(dá)載體，目的片段經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，抽提質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為H2A／pET28a。

1.5 組蛋白H2A的原核表達(dá)及純化 利用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)，完畢后收集菌體，超聲波破碎，離心并分別收集上清液和沉淀，SDS-PAGE鑒定蛋白質(zhì)表達(dá)情況。確定蛋白質(zhì)正確表達(dá)后，純化H2A重組蛋白。SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)純度，BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.6 重組蛋白的western blot鑒定 將純化的重組蛋白H2A經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)PVDF膜，50 g／L脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜，用抗核抗體檢查中抗組蛋白抗體陽(yáng)性血清及HRP－抗人IgG分別作為第一抗體、第二抗體進(jìn)行溫育，加入化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.7 間接ELISA法的建立 以純化的H2A蛋白為包被抗原，HRP－抗人IgG為二抗，建立檢測(cè)抗H2A抗體的間接ELISA方法。用棋盤(pán)滴定法確定間接ELISA的最佳包被濃度（10、5、2.5、1μg／mL），最佳血清稀釋度（1∶100、1∶200、1∶400、1∶800），最佳二抗稀釋度（1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000）。（1）包被：將H2A用包被緩沖液稀釋至5μg／mL，包被聚乙烯ELISA板，每孔100μL，置4℃過(guò)夜，用PBST洗板3次，每次3 min，拍干；（2）封閉：每孔加100μL用PBST稀釋的50 g／L脫脂奶粉封閉，置于4℃過(guò)夜，用PBST洗板3次，每次3 min，拍干；（3）加血清樣本：將RA組、健康人對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照血清按1∶400稀釋?zhuān)總€(gè)樣本重復(fù)3孔，每孔加入100μL，置37℃反應(yīng)1 h，洗板3次，每次3 min，拍干；（4）加二抗：將HRP－抗人IgG按1∶20 000稀釋?zhuān)靠准尤?00μL，置37℃反應(yīng)1 h，洗板5次，每次3 min，拍干；（5）顯色與終止：加顯色液A和顯色液B，室溫避光反應(yīng)10 min，加終止液終止反應(yīng)；（6）讀板：酶聯(lián)儀檢測(cè)A450nm值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。RA患者與健康人對(duì)照組數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。率的比較用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪制ROC曲線，用ROC曲線下面積（AUCROC）評(píng)估抗H2A抗體作為診斷指標(biāo)的潛力。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒H2A／pET28a的鑒定 經(jīng)PCR擴(kuò)增、限制性酶切、DNA連接、轉(zhuǎn)化、克隆鑒定等步驟，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒H2A／pET28a，圖1為重組質(zhì)粒 H2A／pET28a的DNA測(cè)序結(jié)果。

圖1 重組質(zhì)粒H2 A／pET28a的DNA測(cè)序結(jié)果

2.2 重組蛋白的原核表達(dá)與純化 原核表達(dá)質(zhì)粒H2A／pET28a體外誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)分析，結(jié)果顯示，在相對(duì)分子量15 000處有預(yù)期大小的蛋白質(zhì)條帶，且該條帶在上清液和沉淀中都有表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖2（1～5）。進(jìn)一步利用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒對(duì)H2A重組蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE結(jié)果顯示，在相對(duì)分子量15 000處有單一條帶，灰度分析顯示蛋白質(zhì)純度大于90%，結(jié)果見(jiàn)圖2（6～8泳道）。

圖2 重組H2A蛋白的表達(dá)與純化

2.3 重組蛋白的western blot鑒定 用抗組蛋白抗體陽(yáng)性血清鑒定純化的重組H2A蛋白，western blot結(jié)果顯示，在相對(duì)分子量15 000處有一條清晰的條帶，見(jiàn)圖3。

圖3 重組H 2A蛋白的western blot鑒定

2.4 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化 用棋盤(pán)滴定法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。選擇強(qiáng)陽(yáng)性血清的A值在1.0左右、陰性血清的A值小于0.1的條件作為最適條件，結(jié)果顯示，H2A蛋白最佳包被濃度為5μg／mL，待測(cè)血清最佳稀釋度為1∶400，HRP－抗人IgG最佳稀釋度為1∶20 000。

2.5 特異性考察 方法特異性考察采用抗體阻斷試驗(yàn)。選擇抗H2A抗體強(qiáng)陽(yáng)性的血清作1∶400稀釋?zhuān)⒓尤際2A抗原至終濃度分別為0、0.5、1、2μg／mL，37℃溫育1 h后，12 000 r／min離心10 min，取上清液進(jìn)行抗H2A抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示，經(jīng)H2A吸收過(guò)的強(qiáng)陽(yáng)性血清，其A值隨加入的H2A量的增加而降低，當(dāng)H2A的終濃度達(dá)到2μg／mL時(shí)，A值從1.207降低至0.405，阻斷率為66.4%，見(jiàn)圖4。

圖4 特異性阻斷抑制試驗(yàn)

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：使用同一批次純化的H2A蛋白包被酶聯(lián)板，對(duì)10份高、中、低3個(gè)濃度的抗H2A抗體樣本進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本重復(fù)3孔。批間重復(fù)性試驗(yàn)：使用3個(gè)批次純化的H2A蛋白包被酶聯(lián)板，檢測(cè)同樣的10份血清樣本。計(jì)算批內(nèi)和批間變異系數(shù)。結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)分別為5.1%、7.5%和6.6%，批間變異系數(shù)分別為7.7%，9.5%和8.4%，均小于10%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.7 抗H2A抗體用于RA診斷的效果 按照優(yōu)化的反應(yīng)條件對(duì)50份RA組和50份健康人對(duì)照組血清進(jìn)行測(cè)定，以不同的A值制作ROC曲線，計(jì)算ROC曲線下面積（AUCROC）?？笻2A抗體診斷RA的AUCROC為0.884，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.030，P＜0.01，95%可信區(qū)間為0.819～0.948。當(dāng)A＝0.494時(shí)，敏感性為84%，特異性為80%，敏感性、特異性最高，故以0.494為cut-off值。

2.8 臨床樣本檢測(cè) 用建立的間接ELISA方法測(cè)定50份RA組和50份健康人對(duì)照組血清，結(jié)果顯示，50例RA患者血清的A值為0.930±0.546，50例健康人對(duì)照組血清的A值為0.367±0.203，RA患者血清抗H2A抗體水平明顯高于健康人對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝6.834，P＜0.01）。該法測(cè)得RA患者血清抗H2A抗體的陽(yáng)性率為84%（42／50），明顯高于健康人對(duì)照組20%（10／50），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝41.026，P＜0.01）。

3 討論

2010年ACR／EULAR將類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）和抗瓜氨酸化肽抗體（ACPA）納入RA的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)中，但是RF的特異性較差，還可見(jiàn)于其他的風(fēng)濕性疾病、慢性炎癥患者以及老年人中［8］；ACPA對(duì)RA診斷具有較高的特異性，但是仍有約20%的漏診率。因此，對(duì)RA相關(guān)生物標(biāo)志物的研究仍很需要。本研究基于質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)，挑選差異蛋白H2A進(jìn)行驗(yàn)證，探索抗H2A抗體與RA的關(guān)系。

本研究構(gòu)建了含有His標(biāo)簽的H2A／pET28a原核表達(dá)載體，以便對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，純化的H2A蛋白經(jīng)western blot鑒定具有良好的反應(yīng)原性。因此，本實(shí)驗(yàn)利用純化的H2A蛋白作為包被抗原，通過(guò)對(duì)抗原濃度、血清及酶標(biāo)二抗稀釋度等條件進(jìn)行優(yōu)化，建立檢測(cè)抗H2A抗體的間接ELISA方法。方法學(xué)特性驗(yàn)證結(jié)果顯示，該方法的特異性和重復(fù)性均滿足臨床實(shí)驗(yàn)室的要求；對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，RA患者血清抗H2A的敏感性為84%（42／50），特異性為80%（40／50），RA組血清抗H2A抗體的陽(yáng)性率明顯高于健康人對(duì)照組，表明可以用間接ELISA檢測(cè)RA患者血清中抗H2A抗體的水平。由于每次復(fù)性的重組蛋白在重復(fù)性和穩(wěn)定性上可能略有差異，以及市場(chǎng)上沒(méi)有商品化的診斷試劑盒可供參考，這可能會(huì)導(dǎo)致建立的ELISA方法存在一定局限性，所以后續(xù)仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，完善優(yōu)化部分指標(biāo)，以期獲得更為可靠的應(yīng)用數(shù)據(jù)。

綜上，本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)了重組H2A蛋白，并且建立了檢測(cè)血清抗H2A抗體的間接ELISA方法，并在臨床樣本中作初步驗(yàn)證，為后續(xù)相關(guān)研究提供了依據(jù)。