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        抗組蛋白H2 A抗體間接ELISA法的建立和臨床初步應(yīng)用*

        2021-11-24 02:54:28王海永徐敏李曉軍南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科南京1000東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)科南京1000
        臨床檢驗(yàn)雜志 2021年10期
        關(guān)鍵詞:血清檢測(cè)

        王海永,徐敏,李曉軍(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,南京1000;.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)科,南京1000)

        類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性的、炎癥性的自身免疫性疾?。?],病因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制尚不清楚。目前,多項(xiàng)研究證實(shí)RA患者體內(nèi)存在針對(duì)瓜氨酸化組蛋白的自身抗體[2-3]以及針對(duì)天然組蛋白的自身抗體[4-5],提示組蛋白可能與RA的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。本課題組前期利用質(zhì)譜和生物信息學(xué)分析技術(shù),對(duì)RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和分析發(fā)現(xiàn)組蛋白H2A在RA患者滑膜組織中有差異性表達(dá)[6]。為進(jìn)一步驗(yàn)證質(zhì)譜鑒定的結(jié)果,本研究通過(guò)在大腸埃希菌中原核表達(dá)并純化組蛋白H2A,以H2A作為靶抗原,建立檢測(cè)血清中抗H2A抗體的間接ELISA技術(shù),比較分析RA患者和健康人對(duì)照血清中的抗H2A抗體水平。

        1 材料與方法

        1.1 研究對(duì)象 收集自2016年2月至2017年1月東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院的門(mén)診和住院RA患者共50例,其中男性13例,女性37例,年齡(47.4±16.8)歲,納入條件符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)學(xué)會(huì)/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(ACR/EULAR)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7],排除合并嚴(yán)重內(nèi)外科疾病以及其他自身免疫病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥以及干燥綜合征的病例。健康人對(duì)照50例,來(lái)自本院體檢健康者,男性13例,女性37例,年齡(38.6±12.3)歲,排除有明顯自身免疫傾向的健康者。抽取研究對(duì)象早晨空腹靜脈血3~5 mL,3 500 r/min離心5 min分離血清,血清貯存于-70℃凍存?zhèn)溆茫瑹o(wú)脂血、溶血等情況。

        1.2 菌株、載體、主要試劑和儀器 表達(dá)宿主菌BL21(DE3)(北京TransGen生物技術(shù)公司),表達(dá)載體pET28a(東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存),PCR引物(美國(guó)Invitrogen公司),限制性?xún)?nèi)切酶Eco RⅠ、NdeⅠ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、PCR反應(yīng)緩沖液和核酸標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量(大連TakaRa公司),質(zhì)粒抽提純化試劑盒及DNA凝膠電泳回收試劑盒(美國(guó)Axygen公司),異丙基硫代半乳糖苷(IPTG,德國(guó)Merck公司),Ni-resin(德國(guó)Novagen公司),BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(上海碧云天公司),抗H2A抗體陽(yáng)性血清、HRP-抗人IgG(美國(guó)Sigma公司),PTC-200 PCR基因擴(kuò)增儀(美國(guó)MJResearch公司),酶聯(lián)儀、蛋白質(zhì)電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司),超聲粉碎儀(美國(guó)Sonics公司)。

        1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)H2A基因cds序列和pET28a表達(dá)載體的MCS位點(diǎn),設(shè)計(jì)特異性PCR引物,用于擴(kuò)增H2A基因,H2A-F1:5′-TTCCATATGTC TGGACGTGGCAAGCAGGGA-3′,H2A-R1:5′-CCGG AATTCTTACTTGCCCTTCGCCTTGTGGT-3′;其 中H2A-F1中含有NdeⅠ酶切位點(diǎn);H2A-R1中含有Eco RⅠ酶切位點(diǎn)。

        1.4 H2A/pET28a重組質(zhì)粒的構(gòu)建 RT-PCR擴(kuò)增H2A基因,利用限制性?xún)?nèi)切酶Eco RⅠ/NdeⅠ同時(shí)雙酶切PCR產(chǎn)物和pET28a表達(dá)載體,目的片段經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,挑取單菌落,抽提質(zhì)粒,測(cè)序驗(yàn)證,驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為H2A/pET28a。

        1.5 組蛋白H2A的原核表達(dá)及純化 利用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá),完畢后收集菌體,超聲波破碎,離心并分別收集上清液和沉淀,SDS-PAGE鑒定蛋白質(zhì)表達(dá)情況。確定蛋白質(zhì)正確表達(dá)后,純化H2A重組蛋白。SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)純度,BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

        1.6 重組蛋白的western blot鑒定 將純化的重組蛋白H2A經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)PVDF膜,50 g/L脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜,用抗核抗體檢查中抗組蛋白抗體陽(yáng)性血清及HRP-抗人IgG分別作為第一抗體、第二抗體進(jìn)行溫育,加入化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)。

        1.7 間接ELISA法的建立 以純化的H2A蛋白為包被抗原,HRP-抗人IgG為二抗,建立檢測(cè)抗H2A抗體的間接ELISA方法。用棋盤(pán)滴定法確定間接ELISA的最佳包被濃度(10、5、2.5、1μg/mL),最佳血清稀釋度(1∶100、1∶200、1∶400、1∶800),最佳二抗稀釋度(1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000)。(1)包被:將H2A用包被緩沖液稀釋至5μg/mL,包被聚乙烯ELISA板,每孔100μL,置4℃過(guò)夜,用PBST洗板3次,每次3 min,拍干;(2)封閉:每孔加100μL用PBST稀釋的50 g/L脫脂奶粉封閉,置于4℃過(guò)夜,用PBST洗板3次,每次3 min,拍干;(3)加血清樣本:將RA組、健康人對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照血清按1∶400稀釋?zhuān)總€(gè)樣本重復(fù)3孔,每孔加入100μL,置37℃反應(yīng)1 h,洗板3次,每次3 min,拍干;(4)加二抗:將HRP-抗人IgG按1∶20 000稀釋?zhuān)靠准尤?00μL,置37℃反應(yīng)1 h,洗板5次,每次3 min,拍干;(5)顯色與終止:加顯色液A和顯色液B,室溫避光反應(yīng)10 min,加終止液終止反應(yīng);(6)讀板:酶聯(lián)儀檢測(cè)A450nm值。

        1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。RA患者與健康人對(duì)照組數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。率的比較用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪制ROC曲線,用ROC曲線下面積(AUCROC)評(píng)估抗H2A抗體作為診斷指標(biāo)的潛力。

        2 結(jié)果

        2.1 重組質(zhì)粒H2A/pET28a的鑒定 經(jīng)PCR擴(kuò)增、限制性酶切、DNA連接、轉(zhuǎn)化、克隆鑒定等步驟,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒H2A/pET28a,圖1為重組質(zhì)粒 H2A/pET28a的DNA測(cè)序結(jié)果。

        圖1 重組質(zhì)粒H2 A/pET28a的DNA測(cè)序結(jié)果

        2.2 重組蛋白的原核表達(dá)與純化 原核表達(dá)質(zhì)粒H2A/pET28a體外誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)分析,結(jié)果顯示,在相對(duì)分子量15 000處有預(yù)期大小的蛋白質(zhì)條帶,且該條帶在上清液和沉淀中都有表達(dá),結(jié)果見(jiàn)圖2(1~5)。進(jìn)一步利用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒對(duì)H2A重組蛋白進(jìn)行純化,SDS-PAGE結(jié)果顯示,在相對(duì)分子量15 000處有單一條帶,灰度分析顯示蛋白質(zhì)純度大于90%,結(jié)果見(jiàn)圖2(6~8泳道)。

        圖2 重組H2A蛋白的表達(dá)與純化

        2.3 重組蛋白的western blot鑒定 用抗組蛋白抗體陽(yáng)性血清鑒定純化的重組H2A蛋白,western blot結(jié)果顯示,在相對(duì)分子量15 000處有一條清晰的條帶,見(jiàn)圖3。

        圖3 重組H 2A蛋白的western blot鑒定

        2.4 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化 用棋盤(pán)滴定法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。選擇強(qiáng)陽(yáng)性血清的A值在1.0左右、陰性血清的A值小于0.1的條件作為最適條件,結(jié)果顯示,H2A蛋白最佳包被濃度為5μg/mL,待測(cè)血清最佳稀釋度為1∶400,HRP-抗人IgG最佳稀釋度為1∶20 000。

        2.5 特異性考察 方法特異性考察采用抗體阻斷試驗(yàn)。選擇抗H2A抗體強(qiáng)陽(yáng)性的血清作1∶400稀釋?zhuān)⒓尤際2A抗原至終濃度分別為0、0.5、1、2μg/mL,37℃溫育1 h后,12 000 r/min離心10 min,取上清液進(jìn)行抗H2A抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示,經(jīng)H2A吸收過(guò)的強(qiáng)陽(yáng)性血清,其A值隨加入的H2A量的增加而降低,當(dāng)H2A的終濃度達(dá)到2μg/mL時(shí),A值從1.207降低至0.405,阻斷率為66.4%,見(jiàn)圖4。

        圖4 特異性阻斷抑制試驗(yàn)

        2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn):使用同一批次純化的H2A蛋白包被酶聯(lián)板,對(duì)10份高、中、低3個(gè)濃度的抗H2A抗體樣本進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)樣本重復(fù)3孔。批間重復(fù)性試驗(yàn):使用3個(gè)批次純化的H2A蛋白包被酶聯(lián)板,檢測(cè)同樣的10份血清樣本。計(jì)算批內(nèi)和批間變異系數(shù)。結(jié)果顯示,批內(nèi)變異系數(shù)分別為5.1%、7.5%和6.6%,批間變異系數(shù)分別為7.7%,9.5%和8.4%,均小于10%,表明該方法重復(fù)性較好。

        2.7 抗H2A抗體用于RA診斷的效果 按照優(yōu)化的反應(yīng)條件對(duì)50份RA組和50份健康人對(duì)照組血清進(jìn)行測(cè)定,以不同的A值制作ROC曲線,計(jì)算ROC曲線下面積(AUCROC)??笻2A抗體診斷RA的AUCROC為0.884,標(biāo)準(zhǔn)誤為0.030,P<0.01,95%可信區(qū)間為0.819~0.948。當(dāng)A=0.494時(shí),敏感性為84%,特異性為80%,敏感性、特異性最高,故以0.494為cut-off值。

        2.8 臨床樣本檢測(cè) 用建立的間接ELISA方法測(cè)定50份RA組和50份健康人對(duì)照組血清,結(jié)果顯示,50例RA患者血清的A值為0.930±0.546,50例健康人對(duì)照組血清的A值為0.367±0.203,RA患者血清抗H2A抗體水平明顯高于健康人對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.834,P<0.01)。該法測(cè)得RA患者血清抗H2A抗體的陽(yáng)性率為84%(42/50),明顯高于健康人對(duì)照組20%(10/50),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=41.026,P<0.01)。

        3 討論

        2010年ACR/EULAR將類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)和抗瓜氨酸化肽抗體(ACPA)納入RA的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)中,但是RF的特異性較差,還可見(jiàn)于其他的風(fēng)濕性疾病、慢性炎癥患者以及老年人中[8];ACPA對(duì)RA診斷具有較高的特異性,但是仍有約20%的漏診率。因此,對(duì)RA相關(guān)生物標(biāo)志物的研究仍很需要。本研究基于質(zhì)譜發(fā)現(xiàn),挑選差異蛋白H2A進(jìn)行驗(yàn)證,探索抗H2A抗體與RA的關(guān)系。

        本研究構(gòu)建了含有His標(biāo)簽的H2A/pET28a原核表達(dá)載體,以便對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化,純化的H2A蛋白經(jīng)western blot鑒定具有良好的反應(yīng)原性。因此,本實(shí)驗(yàn)利用純化的H2A蛋白作為包被抗原,通過(guò)對(duì)抗原濃度、血清及酶標(biāo)二抗稀釋度等條件進(jìn)行優(yōu)化,建立檢測(cè)抗H2A抗體的間接ELISA方法。方法學(xué)特性驗(yàn)證結(jié)果顯示,該方法的特異性和重復(fù)性均滿足臨床實(shí)驗(yàn)室的要求;對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),RA患者血清抗H2A的敏感性為84%(42/50),特異性為80%(40/50),RA組血清抗H2A抗體的陽(yáng)性率明顯高于健康人對(duì)照組,表明可以用間接ELISA檢測(cè)RA患者血清中抗H2A抗體的水平。由于每次復(fù)性的重組蛋白在重復(fù)性和穩(wěn)定性上可能略有差異,以及市場(chǎng)上沒(méi)有商品化的診斷試劑盒可供參考,這可能會(huì)導(dǎo)致建立的ELISA方法存在一定局限性,所以后續(xù)仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,完善優(yōu)化部分指標(biāo),以期獲得更為可靠的應(yīng)用數(shù)據(jù)。

        綜上,本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)了重組H2A蛋白,并且建立了檢測(cè)血清抗H2A抗體的間接ELISA方法,并在臨床樣本中作初步驗(yàn)證,為后續(xù)相關(guān)研究提供了依據(jù)。

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