王海，李麗（東南大學附屬中大醫(yī)院檢驗科，南京210009）

自身免疫性甲狀腺疾?。╝utoimmune thyroid disease，AITD）是一組器官特異性自身免疫性疾病，可引起甲狀腺功能亢進或減退。臨床上以彌漫性毒性甲狀腺腫伴甲亢（Graves′disease，GD）和橋本甲狀腺炎（Hashimoto′s thyroiditis，HT）為2種主要疾病類型。針對甲狀腺來源抗原的自身抗體是區(qū)分AITD與其他甲狀腺疾病最重要的生物標志物，如甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulin antibody，TgAb）、甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）以及促甲狀腺激素受體（thyrotropin receptor，TSHR）自身抗體（TSHR autoantibodies，TRAb）等。特別是TRAb在自身免疫性甲狀腺功能亢進和功能減退的疾病發(fā)展中發(fā)揮獨特的作用，直接參與了GD和HT的病理生理過程。GD是甲狀腺機能亢進的主要原因之一，影響約0.5%的普通人群，尤其是年輕女性。美國（2016）和歐洲（2018）甲狀腺協(xié)會發(fā)布的《甲狀腺功能亢進診斷和管理指南》以及中國（2019）《甲狀腺功能亢進癥基層診療指南》均推薦檢測血清TRAb用于GD的診斷和鑒別診斷［1-2］。在許多病例中，由于沒有甲狀腺相關眼病和甲狀腺功能變化等特征性臨床表現(xiàn)，GD的病因診斷并不明確且不容易與其他能夠導致甲狀腺功能亢進的疾病進行區(qū)分。與甲狀腺放射性核素掃描、超聲等其他檢查相比，TRAb的檢測更具體、經(jīng)濟，顯示了該抗體作為疾病可靠的生物標志物的臨床效用和實用性［3］。本文主要介紹TRAb檢測方法學的最新進展，并評價不同檢測方法的優(yōu)劣。

1 TSHR及TRAb非首次出現(xiàn)

TSHR是調(diào)節(jié)甲狀腺生長和分化的主要開關，含有1個7－跨膜結構域的G蛋白偶聯(lián)受體，存在于甲狀腺細胞和其他多種細胞（纖維細胞、脂肪細胞和成骨細胞等）的質膜表面［4］。TSHR分子由α亞基（胞外結構域）和β亞基（跨膜錨定結構域和胞質結構域）組成，這2個亞基由同一個基因編碼。由于其結構的復雜性，點突變或者自身抗體誘導的結構變化使TSHR表現(xiàn)出不穩(wěn)定的分子完整性以及激活或抑制的生物功能特點［5］。在GD發(fā)生的自身免疫病理過程中，甲狀腺細胞和其他組織細胞上的TSHR分子是機體自身抗原的主要來源。有研究發(fā)現(xiàn)TSHR分子中能夠進入血循環(huán)的可溶性α亞基也是自身抗原的重要來源［6］。究竟是完整的TSHR分子還是游離的可溶性α亞基作為主要抗原誘導自身抗體的產(chǎn)生，目前仍沒有定論。

TRAb是異質性抗體，在機體內(nèi)表現(xiàn)為不均一性。根據(jù)其對TSHR作用的功能特性差異，可以將其分為促甲狀腺激素受體刺激性抗體（thyrotropin receptor-stimulating antibody，TSAb）、促甲狀腺激素受體阻斷性抗體（thyrotropin receptor-blocking antibody，TBAb）以及中性抗體。TSAb與TSHR結合后能夠產(chǎn)生與促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）相同的功能效應，即激活環(huán)腺苷單磷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號轉導通路，進而導致異常的甲狀腺濾泡上皮細胞增生和甲狀腺激素生成。而TBAb的生物作用與之相反并介導甲狀腺功能減退。中性抗體與TSHR結合后既不激活也不阻斷受體功能活性，有研究報道中性抗體結合TSHR后能激活MAPK／PI3K信號通路，誘導甲狀腺細胞凋亡的發(fā)生［7］。目前認為TSAb對GD的診斷、預后以及療效判斷具有良好的臨床效用，而TBAb在自身免疫性甲狀腺功能減退癥中的意義尚未得到充分的論證。需要注意的是，目前大部分臨床實驗室測定的都是患者血清中總TRAb的含量，而臨床上一般亦將TRAb視為TSAb用于GD患者診斷。研究發(fā)現(xiàn)這2種抗體能夠同時出現(xiàn)在同一個患者體內(nèi)，并可能存在相互轉換，這可能與GD患者的臨床表現(xiàn)可以從甲狀腺功能亢進轉變?yōu)楣δ軠p退有關［8］。早期關于TSHR胞外結構域上TSAb和TBAb識別抗原表位的研究表明，TSAb主要識別的抗原表位在TSHR胞外結構域的N端8—165氨基酸殘基，而TBAb主要識別的抗原表位在TSHR胞外結構域的C端270—395氨基酸殘基［9］。事實上，TRAb并不是單一的抗體群，TSH、TSAb及TBAb識別的TSHR表位空間上相近且存在一定的重疊現(xiàn)象［10］。

TRAb的檢測方法目前主要有免疫學方法和生物學方法。在過去的幾十年里，隨著單克隆抗體技術的發(fā)展以及檢測方法的改良革新，TRAb的免疫學分析法已經(jīng)廣泛運用于臨床，實現(xiàn)了自動化檢測并具有很好的檢測靈敏度和特異性。然而，不同于生物學方法能夠很好地區(qū)分樣本中TRAb的功能活性，TRAb免疫學分析法檢測的是樣本中TRAb與TSHR的結合總量，包括TSAb、TBAb以及中性抗體。2015年Frank等［11］利用橋聯(lián)法建立了一種新的檢測方法，能夠只檢測血清中TSAb。該方法已實現(xiàn)化學發(fā)光自動化檢測，并于2019年在中國國家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）注冊使用。

2 TRAb測定的免疫學分析法

TSH和TRAb識別并結合相同的TSHR結構域是早期利用競爭抑制法檢測TRAb含量的方法學前提。1974年，研究者首次利用I125標記的牛TSH與血清中TRAb競爭性結合從GD患者甲狀腺組織中提取的甲狀腺細胞膜TSHR來測定TRAb，由于患者樣本中血清免疫球蛋白介導的非特異性干擾明顯，該檢測方法的診斷敏感性較低［12］。該方法測定的是患者血清TRAb對I125標記TSH與TSHR結合的抑制率，故也稱為TSH結合抑制免疫球蛋白法（TSH binding inhibiting immunoglobulin assay，TBII法）。隨著技術的革新與突破，TRAb的免疫學分析方法經(jīng)過不斷改良，其檢測性能得到了很好的提升（見表1）。

表1 TRAb測定的免疫學分析法和生物學方法

2.1 第一代TBII法 第一代TBII法是利用液相法檢測TRAb，利用去垢劑（聚乙二醇，PEG）溶解的豬TSHR和I125標記的牛TSH開啟了液相檢測TRAb的時代。PEG能夠有效沉淀分離TSHR-TSH復合物，將游離I125標記的牛TSH分離出來，因此能夠較為準確地計算樣本血清TRAb對TSH與TSHR結合的抑制活性。該方法中健康人血清及免疫球蛋白對TSH與TSHR的相互作用影響不大，而且可以直接使用血清樣本，不需要單獨分離濃縮樣本中免疫球蛋白［13-14］。由于PEG能夠將少量游離的I125標記的TSH沉淀下來，該方法的檢測敏感性和特異性不高。TRAb具有種屬特異性，后期利用人重組TSHR替代豬TSHR能夠提高檢測的敏感性和特異性［15］。

2.2 第二代TBII法 20世紀90年代末，TSHR單克隆抗體的出現(xiàn)以及固相包被技術的應用使得在不改變功能性TSHR構象的情況下將豬或人重組TSHR固定在固相載體上，經(jīng)過樣本添加－溫育－洗滌－添加標記的TSH－洗滌－檢測等多個步驟，通過檢測同位素放射信號強度等來測定血清樣本中TRAb對TSH和TSHR的結合抑制活性?；诖?，新一代TRAb免疫分析方法被運用到臨床實踐中［16］。其他非同位素TRAb檢測方法也逐漸被開發(fā)出來，如用吖啶酯替代I125標記TSH的化學發(fā)光檢測方法以及基于過氧化物酶標記的ELISA法等［17］。與第一代TBII法比較，第二代TBII法操作得到簡化，檢測敏感性更高，并可實行大樣本檢測，為自動化檢測奠定了基礎。

2.3 第三代TBII法 第一代和第二代TBII法均采用標記的牛TSH作為示蹤劑與患者血清中的TRAb競爭結合TSHR。2003年，研究者從GD患者的淋巴細胞中獲得一種TSHR刺激性單克隆抗體M22［18］，M22及其Fab片段與TSHR具有高度親和力，能夠替代牛TSH在TRAb檢測中的作用，與患者血清中的TRAb競爭性結合固相載體上的TSHR。隨后又分離出2種具有TSHR阻斷活性的人單克隆自身抗體（K1-70和5C9）和另一種刺激性單克隆抗體K1-18［19］?；贛22的第三代TBII法同樣不局限于放射性同位素法，還包括化學發(fā)光法、ELISA法等免疫分析方法［20-21］。Tozzoli等［22］分別采用第三代和第二代TBII法測定GD患者以及非GD患者血清中TRAb含量，發(fā)現(xiàn)基于M22的自動免疫分析顯示了對GD的高診斷敏感性和特異性，比第二代TBII法更靈敏，且檢測時間短。

需要注意的是，通過比較賽默飛BRAHMS TRAK Kryptor和羅氏cobas e601 2種TRAb免疫分析檢測系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，對于同一樣本，雖然兩者之間得到的TRAb測定值具有良好的一致性，但當cobas e601檢測的TRAb值＞20 IU／L時，Kryptor檢測系統(tǒng)得到的TRAb的測定值與之相比具有很大的偏移差異［23］。在一項比較第二代TBII法與2種第三代TBII法對GD的診斷性能評價研究中，盡管使用了相同的參考標準進行校準，在未治療的GD患者中，3種方法測定的TRAb結果存在較大的差異［24］。此外，使用5種不同公司的第三代TRAb檢測試劑盒檢測同一份樣本，得到的TRAb測定值之間同樣存在一定差異［21］。這種差異可能源自于TRAb識別TSHR的不同表位以及與固相載體上抗原結合能力的差異。以上結果表明，在基于M22的第三代TBII法中不同檢測系統(tǒng)得到的TRAb測定值有較大的方法學間差異，不同廠家的TBII檢測系統(tǒng)具有不同的臨床相關截斷值。因此，臨床上在解釋TRAb結果的時候，需要關注所使用的檢測方法和檢測系統(tǒng)。

在判斷新生兒甲狀腺功能以及GD診斷中，用第三代TBII法分別測定肝素鋰血漿和血清樣本中的TRAb，結果間存在較大差異，且在肝素鋰血漿中TRAb的測定值經(jīng)常出現(xiàn)假陽性，這在甲狀腺功能正常的母親、活動性GD患者以及健康志愿者的嬰兒中均存在，對于導致這種差異的原因尚不清楚。由于來自臍帶血的肝素鋰血漿廣泛運用于分娩時的實驗室檢測，臨床測定新生兒血液中TRAb時，尤其需要關注所檢測的樣本類型［25］。

競爭性抗TSHR自身抗體檢測方法存在一個共同弊端，其檢測的都是與TSHR結合的抗體總量，并不能區(qū)分TSAb、TBAb和中性抗體。因此，在臨床上檢測TRAb用于GD的診斷中，有可能因為存在TBAb而導致“假陽性”的結果。第三代TBII法的發(fā)展使臨床TRAb檢測靈敏度顯著提高，并且實現(xiàn)了自動化檢測，提高了工作效率，是目前使用最為廣泛的檢測技術。

2.4 甲狀腺刺激性免疫球蛋白（thyroid stimulating immunoglobulin，TSI）檢測系統(tǒng) 上述測定TRAb的競爭免疫分析方法不能區(qū)分TSAb和TBAb。2015年，F(xiàn)rank等建立了一種只檢測患者血清TSAb的檢測系統(tǒng)（Immulite TSI免疫分析系統(tǒng)）。該方法基于抗體的2個抗原結合位點在2個不同的重組TSHR分子之間形成橋梁，該重組TSHR去除了與TBAb結合的主要位點。在檢測過程中，一條抗體臂與固定在微孔板上的捕獲受體結合，捕獲受體的密度使其間距只允許抗體分子的單臂與捕獲受體相互作用，一旦抗體分子與捕獲受體結合，一個嵌合分泌性堿性磷酸酶的信號受體將與抗體的另一單臂結合，檢測信號強度取決于樣本中TSAb的含量［11］。該方法對GD的診斷敏感性、特異性和診斷準確性分別達到99.8%、99.1%和0.998。一些評估橋聯(lián)試驗的研究表明，這種橋式免疫分析法在GD的診斷與鑒別診斷方面具有很高的臨床敏感性［26-28］。Kim等［29］評估了西門子Immulite TSI免疫分析法與羅氏TRAb電化學發(fā)光法（第三代TBII法）對GD的診斷效能，2種方法分別得到的TSAb值和總TRAb值之間存在顯著相關性，總符合率達93.0%，在13例結果不一致的患者中，TSI免疫分析系統(tǒng)得到的結果更符合患者的臨床診斷。

值得注意的是，F(xiàn)rank等研究發(fā)現(xiàn)，3例臨床表現(xiàn)和生化檢測均提示為甲狀腺功能減退的患者中，有1例患者血清用橋聯(lián)法檢測結果為陽性［11］。此外，一項評估橋聯(lián)法和2種功能性生物學方法對患者血清TRAb的測定結果的研究表明，橋聯(lián)免疫法和2種生物測定法對TRAb的檢測均高度敏感［30］。在35例HT患者的血清標本中，使用橋聯(lián)法和刺激性TRAb生物學方法分別檢測出2例和5例陽性結果。此外，對于2例GD患者的血清樣本，使用刺激性TRAb生物測定法檢測結果為陰性時，而橋聯(lián)法檢測結果為陽性。考慮到TRAb的異質性，可能存在罕見的TBAb和TSAb均與TSHR的N端結合，或者橋聯(lián)法不能完全區(qū)分刺激性和阻斷性TSHR抗體。另外，鑒于生物測定法檢測的是TSAb凈活性，也不能排除TSAb生物測定法造成的假陰性結果的可能［30］。對于這種差異的結果解釋存在一定的爭議。一項中國的多中心研究比較了Immulite TSI免疫分析系統(tǒng)與Cobas e601競爭免疫分析系統(tǒng)測定的TSAb和TRAb對中國人群GD的臨床診斷性能，兩者在對GD診斷敏感性（100%vs 95%，P＝0.799）和特異性（97.1%vs 97.6%，P＝0.943）方面差異無統(tǒng)計學意義，但Immulite TSI免疫分析系統(tǒng)與生物學分析法的一致性高于Cobas e601競爭免疫分析系統(tǒng)［28］。此外，在韓國的一項研究中，Immulite TSI免疫分析系統(tǒng)與TRAb免疫競爭法檢測TRAb對GD的診斷性能同樣具有較好的一致性［31］。就目前的研究數(shù)據(jù)而言，Immulite TSI免疫分析系統(tǒng)與第三代TBII法在檢測的靈敏度和特異性方面均具有很好的表現(xiàn)，鑒于前者能夠單獨測定TSAb，因此在GD診斷和病情判斷中可能具有更優(yōu)的臨床價值，但還需要更多的臨床研究來支持。

臨床上甲狀腺相關自身抗體檢測目前主要有TgAb、TPOAb和TRAb 3項指標。血清中TgAb的存在會干擾Tg測定的結果，不同Tg檢測方法會引起Tg檢測結果的假性升高或降低，因此，血清TgAb的測定主要用于血清Tg測定的輔助檢查。TgAb或TPOAb陽性一般提示甲狀腺功能減退由自身免疫甲狀腺炎所致［32］。此外，2019年中國《妊娠和產(chǎn)后甲狀腺疾病診治指南》推薦根據(jù)妊娠期患者血清TPOAb陽性與否選擇不同的治療方案［33］。TRAb是GD發(fā)生發(fā)展的病理生理基礎，由于TRAb檢測的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性得到顯著提高，且對GD的診斷具有很好的敏感性和特異性，中國《甲狀腺功能亢進癥基層診療指南（2019）》將TRAb陽性列為GD的輔助診斷條件之一，并推薦臨床檢測TRAb以用于對GD患者病情活動的判斷，評價抗甲狀腺藥物的停藥時機以及預測疾病復發(fā)的風險［34］。由于TSI檢測系統(tǒng)在國內(nèi)尚未廣泛開展且在臨床應用中缺乏足夠的臨床研究數(shù)據(jù)，該指標尚未被納入甲狀腺相關疾病的診療指南中。

3 TRAb測定的生物學方法

雖然臨床上廣泛采用免疫學方法檢測TRAb，但是只有生物學分析方法才能夠區(qū)分功能性TSHR抗體的活性，且具備很好的敏感性和特異性，其不足之處在于生物學分析法需要有經(jīng)驗的實驗室人員以及細胞培養(yǎng)等設備，操作繁瑣、耗時，目前主要存在于一些專門實驗室中。

自身抗體及對靶細胞TSHR直接作用的配體是TSHR自身反應性的主要激發(fā)因素。TRAb通過模擬TSHR的天然配體功能來影響細胞的代謝分泌，但并不破壞靶細胞。TRAb測定的生物學方法是基于體外細胞基礎上的功能性測試，通過TRAb對TSHR-cAMP途徑依賴的信號通路的活化或抑制效果來測定TRAb的含量和功能活性。最初關于TRAb的初步探索是在動物體內(nèi)進行的。科研人員在GD患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種長效甲狀腺刺激素，后被鑒定為TSHR自身抗體［35-36］。在此基礎上，McKENZIE通過向小鼠注射I131，然后利用甲狀腺素抑制內(nèi)源性TSH的產(chǎn)生，通過檢測靜脈注射TSH或試驗物質后血液中I131的增加百分比來評估血液中試驗物質的功能活性［37］。隨著cAMP在受刺激的甲狀腺細胞中的生物學作用的認知不斷深入以及TSHR分子克隆技術的發(fā)展，第一代生物學分析法利用放射性cAMP終點法來檢測樣本中TRAb在甲狀腺組織切片中誘導cAMP的積累，進而評估TRAb的活性水平［38］。由于大鼠甲狀腺細胞系FRTL-5在低溫凍存復蘇后仍表現(xiàn)出良好的活性，且在GD患者的血清刺激下能夠穩(wěn)定產(chǎn)生cAMP，基于FRTL-5細胞的生物測定法逐漸興起，隨后也開發(fā)出其他細胞系如人甲狀腺細胞、甲狀腺雜交瘤細胞等［39］?；蛐揎椉毎夹g的發(fā)展使功能完整且更穩(wěn)定的野生型TSHR或嵌合TSHR的重組細胞系占據(jù)絕對優(yōu)勢，與FRTL-5等細胞相比，表達人重組TSHR細胞系具有易培養(yǎng)、周期短、受體數(shù)目多等優(yōu)點，尤其是TSH或TRAb與嵌合人TSHR結合后，細胞內(nèi)cAMP的水平顯著提升，提高了檢測的靈敏度［6］，其中以重組中國倉鼠卵巢細胞株（Chinese Hamster Ovary，CHO）-TSHR細胞系使用最為廣泛。雖然放射性同位素cAMP檢測生物學方法在底物濃度較低的情況下具有較高的敏感性，但是處理同位素廢棄物比較繁雜且對環(huán)境有害，該方法使用受限。

Himmler等［40］利用質粒構建了穩(wěn)定的含熒光素酶報告基因的CHO細胞株，該報告基因受cAMP效應元件CRE的轉錄調(diào)控，細胞內(nèi)cAMP水平能夠影響細胞內(nèi)熒光素酶轉錄表達。基于此研究發(fā)現(xiàn)，Watson及其同事構建了1株穩(wěn)定轉化熒光素酶報告基因的嵌合人TSHR的CHO細胞系，該細胞系在?；蛉薚SH刺激下顯示出劑量依賴性的熒光素酶活性增加，基于該細胞的生物學檢測結果與直接測定細胞內(nèi)cAMP水平的生物學方法具有顯著的相關性，并且在方法學上更簡便、靈敏和快速［41］。這一研究首次用熒光素酶生物學方法測定TRAb。一系列在CHO細胞系上嵌合TSHR的結構活性的研究中，將野生型人TSHR的262-368氨基酸殘基替換為黃體生成素受體的262-334氨基酸殘基所獲得的Mc4嵌合TSHR僅能識別刺激性TRAb，對阻斷性TRAb沒有反應，這種結構性改良顯著提高了生物學方法對TSAb檢測的敏感性和特異性［6］。目前經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administratia，F(xiàn)DA）批準的已商品化的Thyretain TSI試劑盒就是基于嵌合Mc4-TSHR的CHO細胞系［30］。需要注意的是，雖然阻斷性抗體在Thyretain TSI檢測中不產(chǎn)生效應，但阻斷性抗體的存在有可能會干擾試驗對刺激性抗體的測定［42］。

一些能夠實時測量活細胞內(nèi)cAMP水平的新的傳感器不斷被開發(fā)出來。Araki等［43］用含有人TSHR、環(huán)核苷酸門控鈣通道和水母發(fā)光蛋白的表達載體轉染CHO-K1細胞系，當TSAb激活TSHR時，細胞內(nèi)cAMP水平升高將導致門控鈣通道的激活，鈣離子內(nèi)流從而直接激活細胞內(nèi)發(fā)光蛋白。該方法檢測GD的陽性率為98.9%，在不滅菌條件下4 h內(nèi)就可以完成實驗。相比于其他生物學方法，極大地縮短了檢測時間。此外，基于cAMP與帶有熒光激活和淬滅基團的DNA結合蛋白結合的均相熒光分析方法被開發(fā)出來，并具有很好的檢測性能［44］。

盡管TRAb生物學測定方法法具有比免疫學分析法更高的敏感性和特異性，但目前仍缺乏國際化標準，而且檢測的是患者血清TRAb的凈活性。當血清中同時含有TSAb和TBAb時，將造成檢測結果的假性減低。

4 總結和展望

高敏感性和特異性的第三代TBII法是目前臨床主要運用的TRAb檢測方法。隨著技術的發(fā)展，TRAb的檢測技術和方法將得到進一步改良和提升，通過嵌合TSHR受體的結構研究或許能更靈敏、準確地檢測和區(qū)分TSAb和TBAb。更簡便、快速的生物學測定法可能將運用到日常臨床工作中?；跇蚵?lián)法特異性檢測TSAb的方法學的成功應用，通過免疫分析方法分別檢測樣本中TSAb和TBAb亞型，這對臨床GD的診斷和鑒別診斷、疾病活動監(jiān)測和預后判斷具有重要的臨床意義。