黎爽，彭洪△，龔磊，唐軍偉，吳洪，黃梅

1 南充市中心醫(yī)院肛腸外科 四川南充 637000

2 南充市中心醫(yī)院胃腸外科 四川南充 637000

3 南充市中心醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科 四川南充 637000

結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，近年來結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，尤其是在亞洲國家[1]。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，結(jié)直腸癌的治療手段越來越多，但是結(jié)直腸癌患者的總體預(yù)后依然有待改善，尤其是出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。因此，需要進(jìn)一步探究結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的潛在作用機(jī)制，以期為結(jié)直腸癌患者治療方案的制定提供新的思路[2]。

MicroRNA（miRNA）是一類非編碼RNA，廣泛存在于多細(xì)胞生物和真核生物中，參與細(xì)胞的多種生理過程，包括基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miRNA可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，包括增殖、遷移和凋亡[3]。miRNA的異常表達(dá)影響著結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，提示miRNA有可能作為結(jié)直腸癌新的治療靶點(diǎn)[4]。

miR-31-5p由miR-31的5’端臂轉(zhuǎn)錄加工而成，在多種細(xì)胞和組織中表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化及維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮重要作用[5]。既往研究表明miR-31-5p在多種惡性腫瘤中高表達(dá)[6-8]，我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)miR-31-5p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常結(jié)直腸黏膜組織[9]，然而miR-31-5p在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚不明確。通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)miR-31-5p可與VPS53靶向結(jié)合，進(jìn)一步通過GEPIA數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)VPS53與自噬相關(guān)基因Beclin1的表達(dá)呈正相關(guān)。自噬是指細(xì)胞通過降解自身結(jié)構(gòu)物質(zhì)使細(xì)胞存活的自我保護(hù)機(jī)制，在腫瘤中自噬可發(fā)揮抑癌作用[10]。Beclin1基因（編碼Beclin1蛋白）是自噬通路的關(guān)鍵調(diào)控基因[11]，但miR-31-5p是否通過調(diào)控自噬通路及Beclin1的表達(dá)參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展尚不清楚。為此，本研究探討miR-31-5p通過VPS53介導(dǎo)的自噬對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞（FHC）與結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29、HCT116、SW480、LoVo均購自美國種質(zhì)保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HT29、HCT116、SW480、LoVo細(xì)胞在含10%胎牛血清、1%青霉素（100 μg/mL）和1%鏈霉素（100 μg/mL）的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞置于37℃、含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）實(shí)驗(yàn)

用 Trizol試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA）從FHC細(xì)胞及結(jié)直腸癌HT29、HCT116、SW480、LoVo細(xì)胞株中提取總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Taka?ra，Japan）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBR Green PCR試劑盒（Invitrogen，USA）在ABI stepone plus型PCR儀（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA）上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95℃2 min，然后94℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，72℃5 min。再用Stepone plus Real-Time PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，CA）進(jìn)行檢測(cè)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

（1）miR-31-5p的表達(dá)水平。miR-31-5p引物如下：上游5’-ACACTCCAGCTGGGAGGCAAGAT?GCTGGCATA-3’，下游 5’-CTCAACTGGTGTCGTG?GAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGCTATG-3’。U6引物如下：上游 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果及查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料[12]，本研究選擇LoVo細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

（2）VPS53的表達(dá)水平。分別轉(zhuǎn)染miR-31-5p模擬物（mimics）、miR-31-5p陰性對(duì)照（NC）和不作任何處理，分為miR-31-5p過表達(dá)組、miR-31-5p陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。VPS53引物序列如下：上游5’-TGTTCCCAACCGAGCAATCTC-3’，下游5’-ACGTTCGTCTGACCTCTTACA-3’。GAPDH 引物如下：上游5’-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3’，下游5’-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3’。

（3）Beclin1的表達(dá)水平。分別轉(zhuǎn)染miR-31-5p模擬物（mimics）、miR-31-5p陰性對(duì)照（NC）、miR-31-5p mimics+pcDNA-VPS53和不作任何處理，分為miR-31-5p過表達(dá)組、miR-31-5p陰性對(duì)照組、miR-31-5p/VPS53過表達(dá)組和空白對(duì)照組。Beclin1引物序列如下：上游5’-AGGTTGAGA?AAGGCGAGACA-3’， 下 游 5’-GTCCACTGCTCCT?CAGAGTT-3’。GAPDH引物如下：上游5’-GGGCT?GCCTTCTCTTGTGAC-3’，下游5’-CCCGTTGATGAC?CAGCTTCC-3’。

1.4 CCK- 8法檢測(cè)細(xì)胞活力

將LoVo細(xì)胞（1×104/孔）接種在96孔板中培養(yǎng)24 h（37 ℃，5% CO2）。

（1）當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染miR-31-5p模擬物（mimics）、miR-31-5p陰性對(duì)照（NC）和不作任何處理，分為miR-31-5p過表達(dá)組、miR-31-5p陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。

（2）構(gòu)建VPS53過表達(dá)載體，用PrimerSTAR Max DNA聚合酶復(fù)合物（Takara，Japan）擴(kuò)增全長(zhǎng)VPS53基因，并將其克隆到pcDNA3.1+載體（Invitro?gen）。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染pcDNAVPS53、pcDNA-VPS53陰性對(duì)照（NC）和不作任何處理，分為VPS53過表達(dá)組、VPS53陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。

（3）當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染miR-31-5p模擬物（mimics）、miR-31-5p陰性對(duì)照（NC）、miR-31-5p mimics+pcDNA-VPS53和不作任何處理，分為miR-31-5p過表達(dá)組、miR-31-5p陰性對(duì)照組、miR-31-5p/VPS53過表達(dá)組和空白對(duì)照組。

（4）當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染pcDNAVPS53、pcDNA-VPS53陰性對(duì)照（NC）、pcDNAVPS53+3-MA和不作任何處理，其中3-MA為自噬抑制劑，分為VPS53過表達(dá)組、VPS53陰性對(duì)照組、VPS53過表達(dá)聯(lián)合自噬抑制劑組和空白對(duì)照組。

每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，分別轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后，每孔加入15 μL CCK-8試劑，孵育3 h后在450 nm處用酶標(biāo)儀（Thermo Fisher）測(cè)量OD值。

1.5 生物信息學(xué)分析

（1）利用數(shù)據(jù)庫 Targetscan（http://www.tar?getscan.org/vert_71/）進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選與miR-31-5p靶向結(jié)合的靶基因，并通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

（2）利用數(shù)據(jù)庫GEPIA（http://gepia.cancerpku.cn/detail.php）分析VPS53和Beclin1（自噬通路關(guān)鍵基因）表達(dá)的相關(guān)性。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pcDNA-VPS53-野生型（WT）或pcDNA-VPS53-突變型（MUT，突變位點(diǎn)為UCUUGCC）由Generay（上海）設(shè)計(jì)和構(gòu)建。使用Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑在LoVo細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，并共轉(zhuǎn)染miR-31-5p模擬物（mimics）或miR-31-5p陰性對(duì)照（NC）。用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.7 透射電子顯微鏡實(shí)驗(yàn)

將LoVo細(xì)胞（1×107/孔）接種在6孔板中培養(yǎng)24 h（37℃，5% CO2），細(xì)胞鋪滿70%左右時(shí)，分別轉(zhuǎn)染pcDNA-VPS53、pcDNA-VPS53陰性對(duì)照（NC）和不做任何處理，分為VPS53過表達(dá)組、VPS53陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集LoVo細(xì)胞并進(jìn)行離心（500 g，5 min）。在細(xì)胞沉淀中加入4℃條件下預(yù)冷的5%戊二醛溶液混合5 min。懸浮并離心細(xì)胞，將沉淀用5%戊二醛和10%牛血清白蛋白（BSA）在冰上處理4 h。洗滌細(xì)胞后用8%焦磷酸鉀和1%氧化四氧化鋨固定細(xì)胞。細(xì)胞用丙酮脫水，再用環(huán)氧樹脂浸泡2 d。使用徠卡超薄切片機(jī)（EM UC7）進(jìn)行切片，用2%醋酸鈾酰染色后使用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.8 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot）

將LoVo細(xì)胞（1×107/孔）接種在6孔板中培養(yǎng)24 h（37℃，5% CO2），細(xì)胞鋪滿70%左右時(shí)，分別轉(zhuǎn)染pcDNA-VPS53、pcDNA-VPS53陰性對(duì)照（NC）和不做任何處理，分為VPS53過表達(dá)組、VPS53陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去6孔板中的培養(yǎng)基，將6孔板置于冰上，用1 mL PBS重懸細(xì)胞，4℃13 000 rpm離心5 min后棄去上清，以除去樣本中血清。加入500 μL RIPA裂解液（Beyo?time）置冰上裂解10 min并振蕩3次，4℃13 000 rpm離心10 min后將上清轉(zhuǎn)移至離心管中。用SDS-PAGE分離蛋白，蛋白上樣量為30 μg，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Bio-Rad）。用5%脫脂牛奶封閉1 h，洗膜，加入一抗在4℃條件下孵育過夜。洗膜，加入二抗（Santa Cruz）孵育40 min，洗膜，取適量發(fā)光液置于暗盒中孵育5 min，用凝膠成像系統(tǒng)曝光并拍照。實(shí)驗(yàn)中用到的一抗有：anti-GAPDH抗體（Abcam，ab9485，1:3 000）、anti-Beclin1抗體（Abcam，ab62557，1:500）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并繪圖，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-31-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中高表達(dá)

與FHC細(xì)胞相比，HCT116細(xì)胞、LoVo細(xì)胞、HT29細(xì)胞、SW480細(xì)胞的miR-31-5p表達(dá)水平均升高（均P＜0.001），見圖1。我們選擇LoVo細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 miR-31-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中高表達(dá)

2.2 過表達(dá)miR-31-5p促進(jìn)細(xì)胞增殖

轉(zhuǎn)染24 h，miR-31-5p過表達(dá)組細(xì)胞活力分別與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。轉(zhuǎn)染48 h、72 h，miR-31-5p過表達(dá)組細(xì)胞活力高于其余兩組（均P＜0.05）。見圖2。

圖2 過表達(dá)miR-31-5p促進(jìn)細(xì)胞增殖

2.3 miR-31-5p與VPS53靶向結(jié)合

通過Targetscan數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)miR-31-5p含有VPS53的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-31-5p與VPS53靶向結(jié)合（圖3、圖4）。

圖3 miR-31-5p與VPS53靶向結(jié)合

圖4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.4 過表達(dá)miR-31-5p下調(diào)VPS53的RNA表達(dá)水平

與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組相比，miR-31-5p過表達(dá)組VPS53的RNA表達(dá)水平均降低（均P＜0.001）。見圖5。

圖5 過表達(dá)miR-31-5p下調(diào)VPS53的RNA表達(dá)水平

2.5 過表達(dá)VPS53抑制細(xì)胞增殖

轉(zhuǎn)染24 h，VPS53過表達(dá)組細(xì)胞活力分別與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。轉(zhuǎn)染48 h、72 h，VPS53過表達(dá)組細(xì)胞活力低于其余兩組（均P＜0.05）。見圖6。

圖6 過表達(dá)VPS53抑制細(xì)胞增殖

2.6 VPS53逆轉(zhuǎn)miR-31-5p對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用

轉(zhuǎn)染24 h，miR-31-5p過表達(dá)組細(xì)胞活力分別與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、miR-31-5p/VPS53過表達(dá)組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。轉(zhuǎn)染48 h、72 h，miR-31-5p過表達(dá)組細(xì)胞活力高于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組，miR-31-5p/VPS53過表達(dá)組細(xì)胞活力低于miR-31-5p過表達(dá)組（均P＜0.05）。見圖7。

圖7 VPS53逆轉(zhuǎn)miR-31-5p對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用

2.7 過表達(dá)VPS53促進(jìn)自噬小體的形成

空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、VPS53過表達(dá)組各取3張片，每張片隨機(jī)取一個(gè)圖進(jìn)行觀察（如圖8）。與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比，VPS53過表達(dá)組自噬小體數(shù)量增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖9。

圖8 透射電子顯微鏡下自噬小體圖（×40 000）

圖9 過表達(dá)VPS53促進(jìn)自噬小體的形成

2.8 VPS53和Beclin 1的表達(dá)呈正相關(guān)

通過GEPIA數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中的VPS53和自噬相關(guān)基因Beclin1的表達(dá)呈正相關(guān)（圖10）。

圖10 VPS53和Beclin 1的表達(dá)呈正相關(guān)

2.9 VPS53上調(diào)Beclin 1蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果見圖11?；叶确治霾捎肐mage J，與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比，VPS53過表達(dá)組Be?clin1蛋白表達(dá)水平均升高（均P＜0.001），見圖12。

圖11 Western blot結(jié)果

圖12 VPS53上調(diào)Beclin 1蛋白的表達(dá)

2.10 自噬抑制劑逆轉(zhuǎn)VPS53對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用

轉(zhuǎn)染24 h，VPS53過表達(dá)組細(xì)胞活力分別與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、VPS53過表達(dá)聯(lián)合自噬抑制劑組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。轉(zhuǎn)染48 h、72 h，VPS53過表達(dá)組細(xì)胞活力低于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組，VPS53過表達(dá)聯(lián)合自噬抑制劑組細(xì)胞活力高于VPS53過表達(dá)組（均P＜0.05）。見圖13。

圖13 自噬抑制劑逆轉(zhuǎn)VPS53對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用

2.11 VPS53逆轉(zhuǎn)miR-31-5p對(duì)Beclin 1 RNA表達(dá)的抑制作用

miR-31-5p過表達(dá)組Beclin1的RNA表達(dá)水平低于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組，miR-31-5p/VPS53過表達(dá)組Beclin1的RNA表達(dá)水平高于miR-31-5p過表達(dá)組（均P＜0.05）。見圖14。

圖14 VPS53逆轉(zhuǎn)miR-31-5p對(duì)Beclin 1 RNA表達(dá)的抑制作用

3 討論

miR-31-5p位于染色體9p21.3上，由單基因座編碼。目前miR-31-5p的研究主要集中在其調(diào)控腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等方面，有研究發(fā)現(xiàn)miR-31-5p在食管癌、腎癌和子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤中的表達(dá)異常并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[13-15]。既往研究顯示miR-31-5p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，并與結(jié)直腸癌的分化程度、浸潤深度及預(yù)后有關(guān)[16]。我們本次研究也發(fā)現(xiàn)miR-31-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平較人正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞升高，并且過表達(dá)miR-31-5p可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，提示miR-31-5p可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著致癌基因的角色，未來有可能成為一個(gè)新的結(jié)直腸癌標(biāo)志物，但目前miR-31-5p在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚未明確。

miRNA主要通過與其靶基因序列特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)[17]。為探討miR-31-5p促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的潛在機(jī)制，我們利用Tar?getscan數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-31-5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-31-5p含有VPS53的結(jié)合位點(diǎn)，并通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)VPS53與miR-31-5p靶向結(jié)合。進(jìn)一步通過qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-31-5p可負(fù)調(diào)控VPS53的表達(dá)，符合miRNA與其靶基因的常規(guī)調(diào)控關(guān)系。

VPS53是高爾基相關(guān)逆向運(yùn)輸?shù)鞍祝℅olgi-asso?ciated retrograde protein，GARP）復(fù)合體的一個(gè)亞單位，參與蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)體向高爾基體的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，并加速多能干細(xì)胞的分化[18]。研究表明VPS53在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，如甲狀腺髓樣癌和前列腺癌[19-20]，并且VPS53還可誘導(dǎo)異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡[21]。有研究報(bào)道VPS53在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)[22]，我們的研究結(jié)果顯示過表達(dá)VPS53可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步通過CCK-8法研究發(fā)現(xiàn)VPS53可逆轉(zhuǎn)miR-31-5p對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，提示VPS53在結(jié)直腸癌中可能作為抑癌基因發(fā)揮作用。

自噬是一種高度保守的溶酶體依賴性降解途徑，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用[23]。自噬可以通過清除受損的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[24]，在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，并與結(jié)直腸癌的預(yù)后密切相關(guān)[25]。誘導(dǎo)自噬可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，抑制自噬可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖[26]，并且激活腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的自噬可增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的放療敏感性[27]。因此，自噬相關(guān)通路可作為結(jié)直腸癌預(yù)防和治療的思考方向。Beclin1蛋白是自噬通路的關(guān)鍵蛋白，在自噬起始階段起到關(guān)鍵作用，并在細(xì)胞的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用[28]。我們的研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)VPS53促進(jìn)自噬小體的形成，且通過對(duì)GEPIA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)VPS53和Beclin1的表達(dá)呈正相關(guān)，然而VPS53是否通過調(diào)控自噬相關(guān)通路參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展尚未清楚。我們進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)VPS53可上調(diào)Beclin1蛋白的表達(dá)，而自噬抑制劑可以逆轉(zhuǎn)VPS53對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用，這些結(jié)果提示VPS53可能通過調(diào)節(jié)自噬相關(guān)通路抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。此外，我們的研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-31-5p可下調(diào)Beclin1的RNA表達(dá)水平，同時(shí)過表達(dá)VPS53可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-31-5p對(duì)Beclin1 RNA表達(dá)的抑制作用，提示miR-31-5p可能通過下調(diào)VPS53來抑制Beclin1的表達(dá)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-31-5p是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的重要調(diào)控因子。miR-31-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中高表達(dá)，miR-31-5p可能通過下調(diào)VPS53來抑制Beclin1的表達(dá)，進(jìn)而通過抑制自噬來促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。因此，miR-31-5p可能是一個(gè)新的結(jié)直腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。