張珍連 成林杰 艾孜買提·肉孜江 姚巧玲

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830000)

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea syndrom, OSAS)是以夜間間歇性缺氧(Intermittent hypoxia, IH)、睡眠片段化為主要病理特征的常見呼吸系統(tǒng)疾病。成人中49.7%的男性和23.4%的女性有中至重度OSAS[1]。且OSAS可顯著增加認知障礙、肥胖、心血管疾病、癌癥等發(fā)病風(fēng)險[2-8]。因此，OSAS已成為備受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。目前多數(shù)學(xué)者認為IH是OSAS引起多器官損害的主要原因。腸道菌群在維持全身穩(wěn)態(tài)方面起著至關(guān)重要的作用。腸道菌群失調(diào)與肥胖、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病密切相關(guān)[9-14]。Moreno等[15]在OSAS小鼠模型中發(fā)現(xiàn)IH可導(dǎo)致腸道微生物組內(nèi)的低氧/復(fù)氧循環(huán)事件，從而改變腸道菌群組成和生物多樣性。提示IH可能通過改變腸道菌群參與OSAS及其相關(guān)多器官病變。然而目前關(guān)于IH對腸道菌群影響的研究報道尚少，因此本研究構(gòu)建了IH大鼠模型，并首次報道大鼠在IH條件下腸道菌群結(jié)構(gòu)變化特征，旨在為研究OSAS及其多器官病變的發(fā)病機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選用16只6周齡清潔級雄性SD大鼠，體重250g左右，來自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心)作為研究對象，開始前10天及為期4周的研究期間，動物被安置在新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心由溫度和燈光控制的房間，飼養(yǎng)在標準籠子里，接受自來水和消毒的標準食品。本研究對大鼠的處置符合動物倫理要求，并得到了新疆醫(yī)科大學(xué)動物研究倫理委員會的批準。

1.2 實驗設(shè)計 16只大鼠隨機分為常氧組(NC組)及間歇性缺氧組(IH組)，每組8只。其中IH組在大鼠睡眠時相占主導(dǎo)的白天(9am-9pm)給予持續(xù)性IH刺激(小動物呼吸機：上海玉研科學(xué)儀器有限公司，上海，IOplus)，IH參數(shù)采用我們以往的實驗進行[16]，即氧分壓在6%～21%范圍內(nèi)循環(huán)，每分鐘一個循環(huán)，一小時60個循環(huán)，持續(xù)給予4周IH刺激；常氧組實驗期間維持常氧分壓(21%)。

1.3 樣品采集 在4周間歇性缺氧或常氧處理實驗結(jié)束后，分別采集每只大鼠糞便并放入提前標記好的1.5 mL 無菌離心管中，-80 ℃保存。

1.4 DNA 提取和16S rRNA 高通量測序 使用E.Z.N.A.?DNA提取試劑盒(Omega Bio-tek，USA)提取試劑盒提取大鼠糞便中總DNA，并使用NanoDrop 2000?分光光度計(Thermo Fisher Scientific,USA,NanoDrop2000)對DNA進行定量檢測。對細菌的16S rDNA 基因V3-V4 高突變片段設(shè)計通用引物，測序區(qū)域為338F-06R，引物序列為338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。PCR 反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μL 2 ×PCR Master Mix Solution、5 μM 正反引物、10 ng模板DNA。反應(yīng)程序為95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，27 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。使用2% 瓊脂糖凝膠(Biowest, Espana)電泳檢測PCR 擴增產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen Biosciences,USA)對目的片段進行切膠回收。利用微型熒光計(Promega，USA, QuantusTMFluorometer)對純化后的片段進行定量檢測。根據(jù)定量結(jié)果對各樣本進行相應(yīng)比例混合，利用測序儀(Illumina, San Diego, USA, Illumina MiSeq)進行測序。

1.5 生物信息學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析使用美吉生物云平臺的免費在線平臺(www.i-sanger.com)。首先根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接(merge)成一條序列，同時對reads的質(zhì)量和merge的效果進行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向，即為優(yōu)化數(shù)據(jù)。采用fastp、FLASH軟件進行序列去雜。采用Usearch進行OTU聚類分析：對優(yōu)化序列提取非重復(fù)序列；去除沒有重復(fù)的單序列；按照97%相似性對非重復(fù)序列(不含單序列)進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列；將所有優(yōu)化序列map至OTU代表序列，選出與代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學(xué)分析，并分別在各個分類水平：域、界、門、綱、目、科、屬、種統(tǒng)計各樣本的群落物種組成。根據(jù)OTU分析結(jié)果，利用Shannon，Chao 1，coverage指數(shù)對樣本進行α多樣性分析，反映微生物群落的豐富度和多樣性及群落覆蓋度。采用物種Venn圖和群落組成分析兩組樣本中所共有和獨有的物種(如OUT)數(shù)目及不同分組在各分類水平(如域、界、門、綱、目、科、屬、種、OTU等)上的物種組成情況。采用PCoA分析研究樣本群落組成的相似性或差異性。采用Lefse多級物種差異判別分析進一步對兩組間腸道菌群物種豐度差異進行分析。采用共線性網(wǎng)絡(luò)及單因素網(wǎng)絡(luò)分析樣本與物種間的共存關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 IH組和NC組腸道菌群多樣性分析 IH組和NC組共有424544個16S rRNA基因序列，平均每個樣本有26534個序列通過了QIIME的篩選。IH組OTUs 數(shù)量(1044個)與NC組(1078個)相比無顯著差異(P>0.05)。IH組與NC組有效OTUs 共1153個，共有OTUs 969個，獨有OTUs分別為75、109個。兩組的群落多樣性(Shannon指數(shù))和群落豐富度(Chao1指數(shù))分析結(jié)果顯示，間歇性缺氧暴露并未顯著增加大鼠糞便樣本的群落多樣性和豐富度(P>0.05)。IH組和NC組腸道菌群Coverage 指數(shù)均接近1，且兩組間無顯著性差異(P>0.05)，提示各樣品文庫的覆蓋率較高，測序結(jié)果可以代表了樣品中微生物的真實情況，見表1。

表1 IH組和NC組腸道菌群α多樣性指數(shù)

2.2 IH組和NC組主要腸道菌群組成分析 基于非加權(quán)的PCoA 分析結(jié)果顯示，IH組和NC組的所有樣本在坐標組合中分離分布，兩組主成分占總變異的28.11%(PC1)和12.96%(PC2)。ANOSIM檢驗結(jié)果證實了組間的顯著分離，表明IH組和NC組之間的微生物組成存在顯著性差異(P<0.01)，見圖1。本研究在不同分類學(xué)水平上分析了IH組和NC組腸道菌群物種豐度，結(jié)果顯示，兩組大鼠間腸道菌群組成均存在差異。在門水平上，優(yōu)勢菌群依次為厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門、軟壁菌門。其余的細菌屬于所有樣本中相對豐度小于1%的其他9個門，見圖2A。在科水平上，兩組大鼠腸道菌群共計發(fā)現(xiàn)52個科，其中包括12個優(yōu)勢菌科，依次為，S24-7，毛螺菌科，瘤胃菌科，普雷沃氏菌科，乳桿菌科，消化鏈球菌科，脫硫弧菌科，韋榮球菌科，擬桿菌科，柔膜細菌RF9，理研菌科，克里斯滕森菌科。其余的細菌屬于所有樣本中相對豐度小于1%的其他40個科，見圖2B。

圖1 IH組和NC組腸道菌群PCoA分析圖

圖2 IH組和NC組腸道菌群在門和科分類水平上的相對豐度

2.3 IH組和NC組腸道菌群物種差異分析 Lefse多級物種差異判別分析結(jié)果顯示，在門水平，擬桿菌門(P<0.05)、軟壁菌門(P<0.01)在IH大鼠腸道中顯著富集，而厚壁菌門(P<0.05)在NC組大鼠腸道中顯著富集，但并未發(fā)現(xiàn)間歇性缺氧對大鼠腸道內(nèi)變形菌門(P>0.05)物種豐度的影響。其余的9個弱勢菌門的物種豐度在兩組間均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。在科水平上，12個優(yōu)勢菌科中，普雷沃氏菌科(P<0.05)，克里斯滕森菌科(P<0.001)，韋榮球菌科(P<0.05)，柔膜細菌RF9(P<0.01)在IH大鼠腸道中顯著富集，理研菌科(P<0.001)，乳桿菌科(P<0.01)在NC組大鼠腸道中顯著富集。而在弱勢菌科中，產(chǎn)堿菌科(IH組：0.624%，NC組：0.075%;P<0.01)，紅螺菌科(IH組：0.110%，NC組：0.035%;P<0.05)，vadinBE97(IH組：0.003%，NC組：0%;P<0.05)IH組顯著富集，未發(fā)現(xiàn)其他弱勢菌科在兩組間分布的顯著差異(P>0.05，見圖3A、圖3B。采用共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)分析及單因素相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，IH組和NC組間有廣泛的物種之間的相互作用。此外，我們在兩組均發(fā)現(xiàn)了游離的OTUs，IH組和NC組各發(fā)現(xiàn)43個、39個游離的OTU樣本(圖4)。對分類水平總豐度前30的OTU進行單因素相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果顯示56.7% OTUs(17/30)屬于厚壁菌門，36.7% OTUs(11/30)屬于擬桿菌門，剩余6.6% OTUs(2/30)屬于變形菌門(圖5)。屬于擬桿菌門的OTU928可以與14種主要的OTUs相互作用，屬于厚壁菌門的OTU397和OTU405分別可以與14、13種主要的OTUs相互作用，屬于擬桿菌門的OTU1011、OTU914和OTU261分別可以與13、13、12種主要的OTUs相互作用，其他兩個厚壁菌門(OTU887、OTU592)分別可以與11、10種主要的OTUs相互作用，而擬桿菌門的OTU1073也發(fā)現(xiàn)可以11種主要的OTUs相互作用。

圖3 IH組和NC組腸道菌群LEfSe分析圖

圖4 IH組和NC組腸道菌群共線性網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 分類水平總豐度前30的OTU單因素相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

OSAS是一種伴有心血管疾病、代謝異常的全身性、綜合性疾病。IH在OSAS及其相關(guān)多器官病變中發(fā)揮著重要作用，但其作用機制尚不完全明確。研究顯示腸道菌群可能與OSAS及其相關(guān)的包括新陳代謝在內(nèi)的多種疾病狀態(tài)密切相關(guān)。因此本研究通過IH模擬OSAS大鼠模型，發(fā)現(xiàn)IH可以顯著改變OSAS大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成，但對菌群的多樣性和豐富度并無顯著影響。

Moreno-Indias等[15]報道與常氧組小鼠相比，間歇性缺氧處理可顯著增加小鼠腸道菌群OTU數(shù)量，同時顯著上調(diào)菌群平均多樣性和群落豐富度。與之相反，本研究在大鼠模型上并未發(fā)現(xiàn)IH組(1044個)與NC組(1078個)之間OTU數(shù)量之間的顯著差異。同時兩組的群落多樣性(Shannon指數(shù))和群落豐富度(Chao1指數(shù))分析結(jié)果并未顯示間歇性缺氧暴露顯著增加大鼠糞便樣本的細菌多樣性和豐富度。有意思的是，Chih-Yuan Ko等[17]研究了我國93例OSAHS患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于對照組，OSAHS患者Chao豐富度、Shannon多樣性和Simpson多樣性并沒有顯著增加，該結(jié)果與本研究結(jié)果類似。對IH組與NC組大鼠腸道菌群物種組成及差異分析結(jié)果顯示，在門水平兩組大鼠間腸道菌群組成存在顯著差異。但Moreno-Indias 等人在比較間歇性缺氧組和常氧組時，并未發(fā)現(xiàn)小鼠腸道菌群在門水平上的顯著差異[15]。此外Chih-Yuan Ko等[17]在OSAHS患者中亦未發(fā)現(xiàn)腸道菌群在門水平上與對照組人群之間的顯著差異。但在科水平，本研究與Moreno-Indias I等及Chih-Yuan Ko等研究結(jié)果類似，均發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌科水平上存在顯著差異[15,17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢菌群中，普雷沃氏菌科，克里斯滕森菌科，韋榮球菌科，柔膜細菌RF9在IH大鼠腸道中顯著富集，而理研菌科，乳桿菌科在NC組大鼠腸道中顯著富集。而弱勢菌群中，產(chǎn)堿菌科，紅螺菌科，vadinBE97在IH組顯著富集。前期研究已報道，間歇性缺氧處理小鼠與正常小鼠相比，腸道內(nèi)氧含量的總體減少[15]，提示IH處理將賦予厭氧菌群生存優(yōu)勢，而兼性厭氧菌甚至好氧菌則處于不利地位，從而引起優(yōu)勢菌群分布變化，尤其是引起專性厭氧菌在間歇性缺氧組中相對富集。

研究發(fā)現(xiàn)OSAS患者腸屏障標志物D-乳酸(D-LA)和腸脂肪酸結(jié)合蛋白(I-FABP)水平明顯升高，提示患者腸道通透性顯著增加[18-19]。且動物實驗同樣發(fā)現(xiàn)隨著間歇低氧時間的延長，腸道黏膜受損嚴重，通透性增高，該研究已報道腸道菌群移位可加重對腸系膜淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)損傷，進而增加氧化應(yīng)激水平[20]。普雷沃氏菌科已報道參與粘蛋白的降解過程，進而導(dǎo)致腸道通透性改變[21]。本研究結(jié)果顯示，普雷沃氏菌科在IH組大鼠腸道內(nèi)顯著富集，提示IH可能通過增加普雷沃氏菌科豐度進而引起腸道通透性改變。此外，有研究顯示韋榮球菌科為新的伴有代謝綜合征肥胖的生物標志物[22]，與Chih-Yuan Ko等[17]研究結(jié)果相似，本研究亦發(fā)現(xiàn)韋榮球菌科在IH組中富集，可能與IH 引起的肥胖密切相關(guān)。而克里斯滕森菌科被報道在低體質(zhì)指數(shù)(low body mass index，BMI)的人群中顯著富集，且在無菌小鼠中移植里斯滕森菌科后可引起體重顯著下降[23]。但本研究發(fā)現(xiàn)IH組中里斯滕森菌科顯著富集，這與IH誘導(dǎo)肥胖結(jié)論并不一致，該結(jié)果還需要進一步研究確認。與Moreno-Indias 等及Chih-Yuan Ko等研究結(jié)果相反，我們的研究結(jié)果顯示IH可引起乳桿菌科的顯著下調(diào)。而腸道中乳酸桿菌能夠通過代謝谷氨酸產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)。乳酸桿菌的減少，會影響腸道中GABA的產(chǎn)生，進而導(dǎo)致中樞中GABA的減少。而GABA能系統(tǒng)的功能障礙可能導(dǎo)致認知功能障礙[24-27]。提示IH引起乳桿菌科顯著下調(diào)可能參與認知功能障礙發(fā)生。

4 結(jié)論

本研究利用IH大鼠模型，進一步證實間歇性缺氧可引起腸道菌群結(jié)構(gòu)的顯著改變，從而改變宿主與腸道菌群之間的穩(wěn)態(tài)關(guān)系。本研究為腸道菌群參與OSAS及其多器官病變的發(fā)病機制提供了科學(xué)依據(jù)，而OSAS如何通過腸道菌群調(diào)節(jié)宿主代謝將值得進一步研究。