張 杰，程 偉，李 娜，潘天全，陳興杰，楊金玉，杜先鋒

（1.安徽金種子酒業(yè)股份有限公司，安徽阜陽236048； 2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽合肥238009）

中國白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一，根據(jù)風(fēng)味不同，白酒主要分為十二大類：濃香型、清香型和醬香型等[1-2]。其中濃香型白酒占白酒總量的70%，它是以高粱等谷物為原料，以酒曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮、發(fā)酵、蒸餾等工藝制作而成[3]。在傳統(tǒng)固態(tài)白酒的釀造過程中，微生物群落的多樣性對白酒不同風(fēng)格、產(chǎn)量及品質(zhì)起到關(guān)鍵性作用[4]。大曲是一種富含釀酒所需要的菌系、酶系、物系的復(fù)合載體，具有“糖化、發(fā)酵、生香”等功能，是傳統(tǒng)固態(tài)釀酒發(fā)酵的動力[5]。大曲中含有以霉菌和酵母菌為主的真菌以及較小的細(xì)菌，這些微生物菌落便是酒體風(fēng)味品質(zhì)形成的關(guān)鍵因素[6]。因此探究濃香型大曲培養(yǎng)過程中微生物群落組成和功能有助于解析大曲的風(fēng)味信息，在大曲培養(yǎng)過程中調(diào)整培養(yǎng)條件，對提高大曲及濃香型白酒質(zhì)量有深遠(yuǎn)意義[7]。

傳統(tǒng)大曲微生物研究主要以各種微生物類型培養(yǎng)皿篩選，通過微生物群落形狀特征、理化特征及菌落數(shù)目進(jìn)行相關(guān)研究。大曲的研究多趨向于單一的風(fēng)味或者微生物[8]，近年來隨著生物化學(xué)和分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者可以借助高通量測序技術(shù)，進(jìn)一步分析大曲中微生物群落的多樣性[9]。茶是世界上公認(rèn)的健康飲料，夏秋茶在夏秋季節(jié)光照強(qiáng)、溫度高的條件下生長速率快，導(dǎo)致其持嫩性差，茶葉易老化，其碳代謝程度較高，氮代謝程度相對較低，從而使得茶葉中多酚類物質(zhì)較高，而芳香物質(zhì)、維生素、氨基酸等含量低，質(zhì)量明顯低于春茶[10-11]。在大曲制作過程中，夏秋茶經(jīng)粉碎后與曲料混合制成茶曲，多酚含量高的夏秋茶對曲塊中的微生物具有選擇性的影響，并產(chǎn)生特征性的生物化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致曲塊微生物種類、生物酶類有顯著特點[12]。

本研究通過高通量測序技術(shù)，分別對同一時間入房培養(yǎng)的傳統(tǒng)中溫大曲、茶曲以及它們在培養(yǎng)階段的微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性變化進(jìn)行研究，得出兩種大曲主要微生物群落構(gòu)成，結(jié)合培養(yǎng)階段環(huán)境條件記錄，根據(jù)所需大曲要求更好地調(diào)控大曲培養(yǎng)條件，以期為白酒提質(zhì)、增加健康因子提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

大曲取樣：對安徽金種子生態(tài)釀酒基地培曲車間同一天入房傳統(tǒng)中溫大曲（以下簡稱中溫大曲）、夏秋茶大曲茶曲（以下簡稱茶曲）進(jìn)行取樣，兩種大曲培養(yǎng)時間均為27 d，分別取入房第1天、第3天、第5天、第7天、第12天、第17天、第22天、第27天曲樣，所對應(yīng)的樣品名稱分別為CHU1、CHU2、CHU3、CHU4、CHU5、CHU6、CHU7、CHU8（中溫大曲），CHA1、CHA2、CHA3、CHA4、CHA5、CHA6、CHA7、CHA8（茶曲）。每次取樣從固定的3個點（內(nèi)、中、外）周邊取并暫存于無菌塑封袋，帶回微生物實驗室并在無菌環(huán)境中進(jìn)行粉碎，采用四分濃縮法留樣保存于無菌袋中，存于-80℃冰箱中備用。

儀器設(shè)備：SW-CJ-2D型超凈工作臺，深圳市瑞鑫達(dá)化玻儀器有限公司；小型多功能粉碎機(jī)，永康市久品工貿(mào)有限公司；醫(yī)用低溫保存箱，安徽中科都菱商用電器股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大曲微生物DNA提取及PCR擴(kuò)增定量

采用CTAB或SDS方法對樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。

以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物(Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer:New England Biolabs)和高效高保真酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。

引物對應(yīng)區(qū)域：16S V4區(qū)引物（515F和806R）：鑒定細(xì)菌多樣性。

ITS1區(qū)引物（ITS5-1737F和ITS2-2043R）：鑒定真菌多樣性。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測；對檢測合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化，采用酶標(biāo)定量，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.2.3 文庫構(gòu)建和上機(jī)測試

使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用Nova-Seq6000進(jìn)行上機(jī)測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 中溫大曲、茶曲微生物聚類

2.1.1 花瓣圖分析

根據(jù)聚類得到OTUs結(jié)果，分析不同樣本之間共有、特有的OTUs，當(dāng)樣本數(shù)大于5時，繪制成花瓣圖如圖1。中溫大曲在8個時間點所取樣品共獲得細(xì)菌OTU數(shù)目為220個，其中共有的細(xì)菌OTU為98個，茶曲共獲得細(xì)菌OTU數(shù)目為303個，其中共有的細(xì)菌OTU為92個；中溫大曲在8個時間點所取樣品共獲得真菌OTU數(shù)目為345個，其中共有的真菌OTU為32個，茶曲共獲得真菌OTU數(shù)目為310個，其中共有的真菌OTU為23個。

圖1 OTU分布花瓣圖

2.1.2 物種分布情況分析

根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，可以得知不同組樣品在各類水平（界、門、綱、目、科、屬、種）上的群落結(jié)構(gòu)組成情況。根據(jù)群落柱形圖，可以直觀呈現(xiàn)兩方面信息：(1)各樣本在某一分類學(xué)水平上主要包括的微生物；(2)樣本中各微生物的相對豐度（所占比重）[13]。如圖2、圖3分別為中溫大曲、茶曲中細(xì)菌及真菌在屬水平上各物種的豐度組成結(jié)構(gòu)。

圖2 中溫大曲、茶曲在屬水平上細(xì)菌物種豐度組成

圖3 中溫大曲、茶曲在屬水平上真菌物種豐度組成

本研究中，利用高通量測序方法從中溫大曲、茶曲中共檢測出266個菌屬。從圖2可以看出，從曲塊入房剛開始就網(wǎng)羅了環(huán)境中的微生物資源，隨著曲塊培育時間的增加，曲塊中微生物菌屬也發(fā)生著一些變化。主要細(xì)菌屬有Lactobacillus（乳桿菌屬）、Pseudomonas（假單孢菌屬）、Acetobacter（醋菌屬）、Staphylococcus（葡萄球菌屬）、Pantoea（泛菌屬）、Kocuria（考克氏菌屬）、Leuconostoc（明串珠菌屬）、Brevibacterium（短桿菌屬），其中Kocuria（考克氏菌屬）在茶曲中屬于主要菌屬但在中溫大曲中非主要菌屬。在整個培曲過程中，Lactobacillus屬于優(yōu)勢菌種，其含量一直大于10%；Pseudomonas在剛?cè)敕壳?天屬于優(yōu)勢菌種，且僅處于中溫大曲時含量高于10%，但后期含量下降明顯；Acetobacter隨著曲塊培養(yǎng)時間增加呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，中期8～10 d時含量最高，但在中溫大曲中不屬于優(yōu)勢菌種，在茶曲中含量大于10%屬于優(yōu)勢菌種。由此可見，原料使用不同對大曲中細(xì)菌多樣性存在影響，在不同的培曲時間下大曲中的優(yōu)勢菌種發(fā)生變化，但乳桿菌屬一直屬于優(yōu)勢菌屬。陳申習(xí)等[14]采用傳統(tǒng)分離方法和現(xiàn)代分子技術(shù)對清香型小曲白酒機(jī)械化生產(chǎn)中微生物動態(tài)變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)酒醅微生物的細(xì)菌主要為乳桿菌屬和芽孢桿菌屬。

從圖3可以看出，中溫大曲、茶曲從入房到培養(yǎng)結(jié)束有8個真菌屬相對豐度大于1%，分別為Blumeria（布氏白粉菌屬）、Saccharomycopsis（扣囊復(fù)膜孢酵母屬）、Rhizopus（根霉菌屬）、Thermoascus（熱子囊菌屬）、Issatchenkia（伊薩酵母屬）、Wickerhamomyces（異常威克漢姆酵母）、Aspergillus（曲霉菌屬）、Hanseniaspora（西方有孢漢遜酵母），其中Blumeria、Saccharomycopsis、Rhizopus、Thermoascus、Issatchenkia、Wickerhamomyces相對豐度均大于10%，屬于培曲過程中的優(yōu)勢菌種。研究表明，Blumeria在中溫大曲及茶曲培養(yǎng)前期0～8 d含量最高，但隨后下降明顯且最終含量低于1%；Saccharomycopsis、Wickerhamomyces在中溫大曲及茶曲培養(yǎng)階段呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢；Issatchenkia在中溫大曲及茶曲中初始含量均為零，在中期6～8 d時含量增加到10%以上，但后期含量明顯降低且低于1%；Rhizopus、Thermoascus在中溫大曲及茶曲培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢，且最終成為主導(dǎo)菌種。值得一提的是，Saccharomycopsis在中溫大曲中最終含量為12.12%，茶曲中最終含量為25.31%，差異明顯。由此可見，大曲中茶葉的添加對真菌優(yōu)勢菌種的分布有一定的影響，在不同的培曲時間下中溫大曲及茶曲中的優(yōu)勢菌種變化明顯。雷振河[15]應(yīng)用高通量測序技術(shù)對清香型白酒釀造用大曲和酒醅中微生物構(gòu)成進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)大曲中優(yōu)勢真核微生物主要包括曲霉菌屬、熱子囊菌屬、根霉菌屬、嗜熱真菌屬、假絲酵母屬，其中本研究中曲霉菌屬、熱子囊菌屬、根霉菌屬與其結(jié)果相似，存在差異可能是環(huán)境、原料、工藝等因素造成的[16]。

2.2 Alpha多樣性分析

2.2.1 微生物多樣性指數(shù)分析

使用Illumian MiSeq高通量測序技術(shù)分別對8個中溫大曲、8個茶曲樣品中微生物多樣性進(jìn)行分析，其細(xì)菌16S rRNA測序結(jié)果及多樣性見表1，真菌ITS測序結(jié)果及多樣性見表2。Observed_species：直觀觀測到的物種數(shù)目（也即是OTUs數(shù)目）。Shannon：樣品中的分類總數(shù)及其占比。群落多樣性越高，物種分布越均勻，Shannon指數(shù)越大。Simpson：表征群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度。Chao1：估計群落樣品中包含的物種總數(shù)。ACE：估計群落中OTU數(shù)目。Goods_coverage：測序深度指數(shù)。PD_whole_tree：群落內(nèi)物種的親緣關(guān)系。

如表1所示，中溫大曲中CHU7細(xì)菌豐富度最高，茶曲中CHA8細(xì)菌豐富度最高，中溫大曲中CHU8細(xì)菌多樣性最高，茶曲中CHA7細(xì)菌多樣性最高。如表2所示，中溫大曲中CHU6真菌豐富度最高，茶曲中CHA1真菌豐富度最高，中溫大曲中CHU3真菌多樣性最高，茶曲中CHA4真菌多樣性最高。

表1 中溫大曲、茶曲細(xì)菌多樣性指數(shù)

表2 中溫大曲、茶曲真菌多樣性指數(shù)

2.2.2 稀疏曲線和等級聚類曲線分析

稀釋曲線是從樣本中隨機(jī)抽取一定測序量的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計它們所代表物種數(shù)目（即OTUs數(shù)目），以抽取的測序數(shù)據(jù)量與對應(yīng)的物種數(shù)來構(gòu)建曲線。稀釋曲線可直接反映測序數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映樣本中物種的豐富程度，當(dāng)曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的物種（OTUs）。如圖4所示，中溫大曲、茶曲的細(xì)菌和真菌稀釋曲線都隨測序深度的增加呈現(xiàn)先增加后平緩的趨勢，這表明細(xì)菌、真菌的測序量合理，能夠反映出樣品中的微生物信息。

圖4 細(xì)菌、真菌稀釋曲線分析圖

等級聚類曲線是將樣本中的OTUs按相對豐度（或者包含的序列數(shù)目）由大到小排序得到對應(yīng)的排序編號，再以O(shè)TUs的排序編號為橫坐標(biāo)，OTUs中的相對豐度（也可用該等級OTU中序列數(shù)的相對百分含量）為縱坐標(biāo)，將這些點用折線連接，即繪制得到Rank Abundance曲線，它可直觀的反映樣本中物種的豐富度和均勻度。在水平方向上，物種的豐富度由曲線的寬度來反映，物種的豐富度越高，曲線在橫軸上的跨度越大；在垂直方向上，曲線的平滑程度，反映了樣本中物種的均勻程度，曲線越平緩，物種分布越均勻[17]。如圖5所示，各樣品細(xì)菌、真菌等級聚類曲線均趨向平緩，說明各樣品細(xì)菌、真菌的測序數(shù)據(jù)物種組成的均勻度高，細(xì)菌微生物多樣性豐度及均勻度高于真菌。

圖5 細(xì)菌、真菌等級聚類曲線分析圖

2.3 Beta多樣性

2.3.1 NMDS分析

無度量多維標(biāo)定法（NMDS,Non-Metric Multi-Dimensional Scaling）[18]統(tǒng)計是一種適用于生態(tài)學(xué)研究的排序方法。NMDS是基于Bray-Curtis距離來進(jìn)行分析的非線性模型，根據(jù)樣本中包含的物種信息，以點的形式反映在二維平面上，克服了線性模型（包括PCA、PCoA）的缺點，更好地反映生態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的非線性結(jié)構(gòu)[19]。應(yīng)用NMDS分析，根據(jù)樣本中包含的物種信息，以點的形式反映在多維空間上，而對不同樣本間的差異程度，則是通過點與點間的距離體現(xiàn)，能夠反映樣本的組間和組內(nèi)差異等。

在NMDS分析中stress值大小體現(xiàn)了分析結(jié)果的優(yōu)劣性，如圖6所示stress值＜0.001，NMDS分析圖可被認(rèn)為一個好結(jié)果的差異性排序。其中CHU1、CHU2、CHU3、CHU4、CHU5 聚 為 一 類 ，CHA1、CHA2、CHA3、CHA4、CHA5聚為一類，可以看出中溫大曲與茶曲在培養(yǎng)前期細(xì)菌多樣性區(qū)別明顯，這與細(xì)菌前中期多樣性分布分析結(jié)果相似，說明在大曲中添加茶葉對曲塊培養(yǎng)前中期的細(xì)菌多樣性影響明顯，可能是前中期茶葉的添加影響了曲塊水分含量、水分散失速度、pH值等，使茶曲升溫較慢，因此對細(xì)菌微生物菌落差異影響較大。CHU6、CHU7、CHU8、CHA7、CHA8聚為一類，可以看出傳統(tǒng)大曲與茶曲在培養(yǎng)后期細(xì)菌多樣性區(qū)別較小，曲塊各項理化指標(biāo)也基本相同，對細(xì)菌的生長代謝影響小，因此后期中溫大曲與茶曲細(xì)菌生態(tài)結(jié)構(gòu)之間不存在明顯差異。CHA6單獨(dú)聚為一類，推測可能與翻曲過程中工藝操作差異性有關(guān)，需進(jìn)一步研究分析。

圖6 中溫大曲、茶曲細(xì)菌生態(tài)結(jié)構(gòu)中屬水平上的NMDS分析

如圖7所示，在屬類水平上stress值為0.149，而當(dāng)stress＜0.2時，可用NMDS二維點圖表示，其圖形更能說明分析數(shù)據(jù)所體現(xiàn)出的意義。其中CHU1、CHU2、CHU3、CHU4 聚為一類，CHA1、CHA2、HCA3、HCA4、CHA5 聚為一類 ，CHU5、CHU6、CHU7 聚為一類，CHA6、CHA7、CHA8、CHU8聚為一類，可以看出中溫大曲、茶曲在培養(yǎng)過程中真菌差異性明顯，說明原料不同對曲塊前中期真菌微生物多樣性影響較大，可能是茶葉的添加影響了曲塊中水分含量、曲塊透氣性、pH值等理化因素，從而使曲塊在培養(yǎng)前中期升溫差異較大，因而影響曲塊中真菌微生物多樣性。其中CHU8與茶曲聚為一類，推測可能與環(huán)境因素有關(guān)，需進(jìn)一步研究分析。

圖7 中溫大曲、茶曲真菌生態(tài)結(jié)構(gòu)中屬水平上的NMDS分析

2.3.2 聚類樹分析

對中溫大曲、茶曲樣品中微生物OTUs信息進(jìn)行加權(quán)聚類分析[20-21]，結(jié)果見圖8、圖9。由圖8可知，中溫大曲及茶曲中細(xì)菌優(yōu)質(zhì)序列中可以歸類為9個門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、類桿菌門（Bacteroidota）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、脫硫菌門（Desulfobacterota）、彎曲桿菌門（Campilobacterota）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）。其中厚壁菌門、變形菌門、類桿菌門和放線菌門占比較大，分別為40.44%、20.94%、14.50%、12.13%，另外，4種菌門中，中溫大曲中的厚壁菌門占比較多，茶曲中變形菌門、類桿菌門和放線菌占比較多。厚壁菌門為大曲中的優(yōu)勢微生物，可能是優(yōu)勢細(xì)菌屬屬于該門，且厚壁菌門主要由芽孢桿菌綱（Bacilli）和梭菌綱（Clostridia）等微生物組成[22]，具有很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，能夠在相對極端的條件下保持生長代謝；放線菌廣泛分布于土壤環(huán)境、海洋環(huán)境、植物體及其他極端自然生態(tài)環(huán)境中，與厚壁菌門相似，也具有極強(qiáng)的耐受性[23]。

圖8 中溫大曲、茶曲細(xì)菌生態(tài)結(jié)構(gòu)中門水平上的聚類樹分析

由圖9可知，中溫大曲及茶曲中真菌優(yōu)質(zhì)序列中可以歸類為10個門，分別為子囊菌門（Ascomycota）、毛霉門（Mucoromycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）、油壺菌門（Olpidiomycota）、無孢子菌門（Aphelidiomycota）、捕蟲霉門（Zoopagomycota）。其中子囊菌門、毛霉門、擔(dān)子菌門占比比較大，分別為66.44%、5.19%、4.19%，3種菌門中，中溫大曲中擔(dān)子菌門占比較多，茶曲中子囊菌門、毛霉門占比豐富。子囊菌門是曲皮和曲心中的唯一優(yōu)勢菌門，也是中溫大曲中的優(yōu)勢真菌菌門。

圖9 中溫大曲、茶曲真菌生態(tài)結(jié)構(gòu)中門水平上的聚類樹分析

3 結(jié)論

大曲是白酒釀造過程中微生物的主要來源，大曲微生物的群落結(jié)構(gòu)的組成往往影響著白酒的品質(zhì)。本研究利用高通量測序技術(shù)，分別對同一時間入房培養(yǎng)的中溫大曲、茶曲以及它們在培養(yǎng)階段的微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性變化進(jìn)行研究，得出兩種大曲主要微生物群落構(gòu)成。結(jié)果表明：（1）中溫大曲細(xì)菌OTU數(shù)目為220個，茶曲細(xì)菌OTU數(shù)目為303個；中溫大曲真菌OTU數(shù)目為345個，茶曲真菌OTU數(shù)目為310個，中溫大曲中真菌OTU數(shù)目占優(yōu)勢，茶曲中細(xì)菌OTU數(shù)目占優(yōu)勢；（2）大曲中優(yōu)勢細(xì)菌菌屬分別為乳桿菌屬、假單孢菌屬、醋菌屬、葡萄球菌屬、泛菌屬、考克氏菌屬、明串珠菌屬、短桿菌屬，其中考克氏菌屬僅在茶曲中屬于主要菌屬；大曲中優(yōu)勢真菌菌屬分別為布氏白粉菌屬、扣囊復(fù)膜孢酵母屬、根霉菌屬、熱子囊菌屬、伊薩酵母屬、異常威克漢姆酵母、曲霉菌屬、西方有孢漢遜酵母，各菌屬在中溫大曲、茶曲中含量差異較大；由此可見，原料中添加茶葉對曲塊細(xì)菌、真菌多樣性影響明顯；（3）在培曲過程中，隨著培育時間的增加，中溫大曲與茶曲中的乳桿菌屬（Lactobacillus）在整個培曲過程中都屬于優(yōu)勢菌屬，而其他菌屬受環(huán)境因素影響明顯；（4）NMDS多樣性分析結(jié)果表明，曲塊中添加茶葉對細(xì)菌前期多樣性影響明顯，但對后期多樣性影響較小，對于真菌而言，前后期多樣性影響均明顯。

從曲塊原料配制到曲塊入房培養(yǎng)的過程都是微生物選擇、富集的過程，因此對大曲微生物群落的構(gòu)成，不同原料對大曲微生物多樣性影響，培養(yǎng)過程中微生物多樣性變化等研究，將有助于從生物學(xué)角度為制曲工藝的調(diào)整、優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。