吳 雙，邢金云，王 燕，田 薇，任秀梅

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南通 226001）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以膝關(guān)節(jié)疼痛為主要表現(xiàn)，伴有局部腫脹、畸形、功能活動受限的慢性關(guān)節(jié)疾病。隨著人口老齡化不斷加劇，膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。流行病學(xué)顯示，我國65歲以上的人群中本病的發(fā)病率高達85%[1]，嚴(yán)重影響了中老年人生活質(zhì)量。目前國內(nèi)外治療KOA的方法眾多，以非甾體抗炎藥為代表的藥物治療及手術(shù)治療較為常見，但因其副作用大、費用昂貴，臨床應(yīng)用具有一定的局限性。艾灸作為中醫(yī)傳統(tǒng)治療方法，借助燒灼艾葉產(chǎn)生的溫?zé)嵝?yīng)和藥理作用，安全有效，無毒副作用，可達到防病治病的目的，對膝骨關(guān)節(jié)炎的防治具有獨特優(yōu)勢。本研究通過觀察艾灸“犢鼻”“足三里”對KOA模型兔的膝關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)及行為學(xué)的影響，以期為臨床艾灸治療膝骨關(guān)節(jié)炎提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康新西蘭大耳白兔40只，雌雄不限，6個月齡，體質(zhì)量2.0~3.0 kg，由南通大學(xué)動物實驗中心提供，動物合格證號：201829201。所有動物飼養(yǎng)于南通大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)環(huán)境保持在溫度23℃，濕度50%，單籠飼養(yǎng)，常規(guī)飲食，自由攝水。實驗過程嚴(yán)格遵循《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 藥物與試劑艾灸條（泰州市灸療技術(shù)研究所泰州久火灸療用品有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號：Q/321203CJL002-2016）；1、5 mL一次性使用無菌注射器（上?？档氯R企業(yè)發(fā)展集團股份有限公司，醫(yī)療器械注冊證編號：國械標(biāo)準(zhǔn)20163150518）；75%酒精溶液（山東安捷高科消毒科技有限公司，標(biāo)準(zhǔn)號：Q/371402AAJ008），以上均由南通大學(xué)附屬醫(yī)院針灸科提供。木瓜蛋白酶（美國Worthington，活力：200萬單位/g）；p38阻斷劑SB203580（APEXBIO，Houston，USA；貨 號：A8254）；蘇 木素、伊紅染料（PHYGENE，貨號：PH0516）。

1.3 主要儀器手術(shù)刀片（華佗牌，生產(chǎn)編號：20010020）；RM2135型石蠟切片機（德國徠卡）；Leica DM4000B型顯微鏡（德國徠卡）；DW-86L628型-70℃低溫冰箱（中國海爾）。

1.4 造模與分組將40只新西蘭大耳白兔根據(jù)體質(zhì)量由Excel 2003產(chǎn)生隨機數(shù)字表，隨機分為對照組、模型組、艾灸組、抑制劑組，每組10只。所有兔于相同條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，記錄各組兔體質(zhì)量，觀察精神狀態(tài)、活潑程度、進食量等情況無差別后，在無菌條件下，對模型組、艾灸組、抑制劑組兔采用注射木瓜蛋白酶法造模[2-4]。具體操作：將4 g木瓜蛋白酶用100 mL的生理鹽水配成4%的濃度，將實驗兔固定于固定器中，屈曲右后肢膝關(guān)節(jié)，局部碘伏棉簽消毒后，自髕韌帶外側(cè)進針，將提前配置好的4%木瓜蛋白酶溶液按照0.1 mL/kg注射于右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)。造模結(jié)束后繼續(xù)歸籠喂養(yǎng)，每日驅(qū)趕兔活動30 min，2周后對比觀察發(fā)現(xiàn)模型組、抑制劑組、艾灸組兔右后肢膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹、屈伸功能障礙，并評估Lequesne評分，總分＞4分為造模成功。

1.5 實驗干預(yù)艾灸組：參照《實驗針灸學(xué)》家兔針灸穴位圖及人犢鼻穴、足三里穴，將兔置于固定器中，四肢束縛制動，右后肢簡單剃毛后，作穴位定位，艾條點燃施灸于右后肢犢鼻穴、足三里，艾條燃端距離穴位處皮膚2 cm。施灸過程中觀察兔的反應(yīng)，每穴每次15 min，5次/周，連續(xù)治療3周。抑制劑組：制作KOA模型后立即關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射p38阻斷劑SB203580 0.1 mL（100 μmol/L），1次/周，連續(xù)治療3周。模型組：制作KOA模型后，不予治療，單籠飼養(yǎng)，常規(guī)飲食；參照艾灸組與抑制劑組每日固定器固定30 min。對照組：不造模，不治療，單籠飼養(yǎng)，常規(guī)飲食；參照艾灸組與抑制劑組每日固定器固定30 min。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 Lequesne評分 治療前及每周治療結(jié)束后均由同一名不參與實驗的課題組成員稱質(zhì)量并評估Lequesne評分，測定其膝關(guān)節(jié)狀態(tài)改變與行為學(xué)改變。評估內(nèi)容包括局部疼痛刺激反應(yīng)、步態(tài)改變、關(guān)節(jié)活動范圍、關(guān)節(jié)腫脹程度4個方面，由同一名不知情的非本實驗人員進行評分并記錄總分。評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 Lequesne評分標(biāo)準(zhǔn)

治療前Lequesne評分：造模結(jié)束2周后，艾灸、抑制劑干預(yù)治療前即對全部兔進行評分，觀察其右后肢膝關(guān)節(jié)腫脹情況，對局部按壓的疼痛反應(yīng)程度及關(guān)節(jié)可自由活動的角度，驅(qū)趕兔并觀察步態(tài)情況，評分并記錄總分；治療后Lequesne評分：艾灸、抑制劑干預(yù)治療后次日，由同一觀察者重復(fù)上述操作。

1.6.2 關(guān)節(jié)軟骨觀察 治療3周后，耳緣靜脈注射空氣處死各組兔，置于手術(shù)臺上，使其呈仰臥位，先后伸直并固定其雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，使用手術(shù)刀將右膝髕骨處皮膚、肌肉、韌帶依次切開剝離后，肉眼觀察右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨表面整體情況，拍照并記錄其顏色、質(zhì)地、光滑程度。使用尖刀片切取右膝膝關(guān)節(jié)表面正中軟骨約100 mg軟骨標(biāo)本，用生理鹽水洗凈后，直接置于體積分數(shù)4%的中性甲醛中，固定72 h；將膝股骨遠端及脛骨近端連同軟骨下骨一并鋸下，去除周圍軟組織，將切除的完整組織標(biāo)本立即放入4%多聚甲醛液中，固定48 h，置于脫鈣液（甲醛10 mL，硝酸20 mL，雙蒸水90 mL）中脫鈣24 h，并常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，沿膝關(guān)節(jié)矢狀面切片，脫蠟、透明后行HE染色，顯微鏡下進行組織學(xué)觀察。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，計量資料均進行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，3組模型兔治療前后得分比較采用重復(fù)測量方差分析；組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組兔Lequesne評分比較造模后，模型組、抑制劑組、艾灸組兔Lequesne評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.916＞0.05），具有可比性。

組間比較：治療1周、2周、3周后，艾灸組、抑制劑組Lequesne評分均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；艾灸組與抑制劑組兔Lequesne評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

組內(nèi)比較：艾灸組、抑制劑組兔治療1周、2周、3周后Lequesne評分均明顯低于治療前（P＜0.01），模型組兔僅于治療第3周后Lequesne評分低于治療前（P＜0.01）。（見表2）

表2 各組兔治療前后Lequesne評分比較（±s，分）

表2 各組兔治療前后Lequesne評分比較（±s，分）

注：F時間主效應(yīng)=330.880，P時間主效應(yīng)=0.000；F分組主效應(yīng)=29.096，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=17.183，P交互效應(yīng)=0.001；與模型組比較，aP＜0.01；與同組治療前比較，bP＜0.01

組別 動物數(shù)（只） 治療前 治療1周后 治療2周后 治療3周后 F P模型組 10 8.80±0.327 8.40±0.221 7.70±0.271 6.25±0.261b 40.085 0.000抑制劑組10 8.70±0.367 6.45±0.273ab 5.45±0.283ab 3.70±0.186ab 285.000 0.000艾灸組 10 8.90±0.458 6.50±0.298ab 4.85±0.150ab 3.30±0.170ab 116.157 0.000 F 0.088 21.632 43.460 99.845 P 0.916 0.000 0.000 0.000

干預(yù)方式與時間存在交互作用，變化趨勢相同，治療后Lequesne評分較治療前均降低，其中艾灸組與抑制劑組下降趨勢較模型組更明顯。（見圖1）

圖1 交互效應(yīng)輪廓圖

2.2 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨觀察對照組兔關(guān)節(jié)解剖后肉眼可見關(guān)節(jié)局部境界清晰，無腫脹，關(guān)節(jié)周圍肌肉飽滿無萎縮，關(guān)節(jié)間隙未見狹窄，軟骨表面光滑，無積液；模型組兔關(guān)節(jié)解剖后肉眼可見關(guān)節(jié)局部明顯腫脹，關(guān)節(jié)周圍肌肉明顯萎縮，關(guān)節(jié)間隙狹窄，軟骨表面粗糙，關(guān)節(jié)囊肥大增厚，有淡黃色渾濁黏稠分泌物；艾灸組與抑制劑組差距較小，均可見關(guān)節(jié)局部較對照組輕微腫脹，腫脹程度均明顯輕于模型組，關(guān)節(jié)周圍肌肉萎縮不明顯，關(guān)節(jié)囊輕度增生，關(guān)節(jié)間隙稍變窄，軟骨表面尚平滑，少量乳白色分泌物。（見圖2）

圖2 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨比較

2.3 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)改變對照組切片中髓腔內(nèi)細胞分布均勻，細胞數(shù)量正常；模型組切片中髓腔內(nèi)可見明顯細胞聚集，分布雜亂，大量炎細胞浸潤，炎細胞數(shù)量明顯增多；艾灸組及抑制劑組切片中髓腔內(nèi)炎細胞聚集程度及數(shù)量較模型組明顯減少。（見圖3）

圖3 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)改變（HE，×200）

3 討 論

膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）是以關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為特征的疾病，其病理改變以軟骨變性、關(guān)節(jié)增生、骨贅形成為主。隨著人年齡的增長，關(guān)節(jié)軟骨變性破壞，加上關(guān)節(jié)活動過多，關(guān)節(jié)增生骨贅形成，刺激周圍軟組織，導(dǎo)致炎癥性充血滲出、炎性滲出物壓迫，引起不同程度的疼痛、腫脹及關(guān)節(jié)活動障礙。因此，抑制炎癥反應(yīng)、緩解疼痛、改善膝關(guān)節(jié)功能活動，對膝骨關(guān)節(jié)炎的治療具有重要意義[5]。近年來，對于膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床研究大多從炎癥反應(yīng)機制、軟骨代謝機制、血液循環(huán)機制[6]等方面展開。本研究以艾灸抑制膝關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)，改善膝關(guān)節(jié)局部血液微循環(huán)，減輕膝關(guān)節(jié)局部疼痛為切入點，觀察艾灸“犢鼻”“足三里”對KOA模型兔膝關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)及行為學(xué)的影響。

p38 MAPK信號通路是MAPKs通路中的重要分支，在疼痛信息傳遞過程中起到重要作用，與細胞炎癥、應(yīng)激、凋亡的調(diào)控密切相關(guān)[7]。當(dāng)p38 MAPK受到炎性因子等外界刺激被激活后發(fā)生磷酸化，使機體的痛閾降低，疼痛敏感[8]。而此過程能被p38 MAPK的阻斷劑SB203580阻斷，特異性的與兩種序列非常相近的蛋白質(zhì)結(jié)合并抑制其活性，從而有效地抑制炎癥因子。YANG K Y等[9]研究發(fā)現(xiàn)注射p38 MAPK抑制劑SB203580能有效緩解痛覺過敏。因此，對于p38 MAPK信號通路的調(diào)控與膝骨關(guān)節(jié)炎病程的發(fā)展密切相關(guān)。

中醫(yī)學(xué)認為，KOA屬“痹證”范疇?！肮使潜圆灰眩瑥?fù)感于邪，內(nèi)會于腎；筋痹不已，復(fù)感于邪，內(nèi)會于肝”?！端貑枴ど瞎盘煺嬲撈分杏涊d：“丈夫八歲，腎氣實……七八，肝氣衰，筋不能動”。膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展主要是由于年老體弱，筋骨失養(yǎng)，肝腎虧虛，氣血不足，復(fù)感外邪，風(fēng)寒濕熱侵襲肢體，經(jīng)絡(luò)痹阻，日久氣血瘀滯，筋脈拘攣，屈伸不利，不通則痛，發(fā)為本病[10]。本病以虛為主，虛中夾實。因此，中醫(yī)治療應(yīng)以培本固元，補氣活血為主。

由于西藥、手術(shù)方法臨床治療KOA的局限性，中醫(yī)藥治療KOA的研究越來越多。艾灸療法作為中國傳統(tǒng)的治療方法，追古溯今，源遠流長。《素問·異法方宜論篇》中記載：“臟寒生滿病，其治宜灸焫”[11]。艾灸療法將艾葉等材料加工制成艾條，燃燒后在體表特定穴位上方溫熨，借助灸火的熱力和艾葉的藥理作用，激發(fā)經(jīng)絡(luò)氣血的運行，起到溫經(jīng)散寒、活血化瘀、通絡(luò)止痛、扶正祛邪的作用，從而達到防治疾病的目的。相關(guān)研究表明[12]，燃燒艾灸產(chǎn)生的熱量通過腧穴傳入體內(nèi)，達到疏經(jīng)通絡(luò)止痛的作用，從而改善關(guān)節(jié)活動功能障礙。本課題組前期研究顯示[13-14]，艾灸可明顯改善膝骨關(guān)節(jié)炎患者疼痛、僵硬、功能障礙等臨床表現(xiàn)，并能改善患者的生存質(zhì)量，是一種安全、有效的治療方法。

本研究選取“犢鼻”“足三里”，從腧穴角度看，兩穴均歸多氣多血之足陽明胃經(jīng)，犢鼻穴位于髕骨外側(cè)下方，髕韌帶外側(cè)凹陷中，具有祛風(fēng)散寒、通利關(guān)節(jié)的作用；足三里穴位于犢鼻穴下3寸，距脛骨前嵴約一橫指，具有活血通經(jīng)、扶正培元的作用。從解剖角度看，兩穴均位于膝周，膝關(guān)節(jié)局部皮膚薄而松弛，皮下脂肪少，周圍有韌帶加強關(guān)節(jié)的穩(wěn)定，股動脈、腘動脈、脛前動脈等多個分支在其周圍吻合形成動脈網(wǎng)，具有豐富的血供。許多研究證實艾灸的溫通作用能夠降低血液黏稠度和血小板的聚集，增加缺血組織血流量，有效改善血液微循環(huán)，促進膝關(guān)節(jié)動脈網(wǎng)功能的恢復(fù)，刺激局部肌肉，維持膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，還可降低關(guān)節(jié)滑膜炎癥，減輕關(guān)節(jié)軟骨的破壞。李秀彬等[15]通過觀察隔附子餅灸對膝骨關(guān)節(jié)炎患者血液流變學(xué)指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)艾灸能夠改善血液循環(huán)，清除自由基，減少炎癥刺激。

本實驗運用木瓜蛋白酶誘導(dǎo)法建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型，結(jié)果顯示造模后，模型組可見明顯細胞聚集，且分布雜亂，大量炎細胞浸潤，炎細胞數(shù)量明顯較多；與模型組比較，艾灸組、抑制劑組炎癥細胞聚集現(xiàn)象明顯減輕，艾灸組與抑制劑組比較，炎癥細胞聚集現(xiàn)象差異不大；通過比較每周治療后Lequesne評分，我們發(fā)現(xiàn)艾灸組、抑制劑組較模型組Lequesne評分明顯降低，提示艾灸治療與抑制劑治療均能減輕膝關(guān)節(jié)炎局部腫脹、疼痛，改善關(guān)節(jié)活動度，這與課題組前期的臨床試驗結(jié)果相吻合[13]；雖然艾灸組與抑制劑組治療后Lequesne評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是經(jīng)過3周的治療后，艾灸組Lequesne評分差值較抑制劑組更大。我們推測隨著治療時間的延長，艾灸療效逐步累積，兩組的差異會顯現(xiàn)出來，這有待于今后進一步的實驗研究。

結(jié)合組間膝關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)的改變與行為學(xué)改變可知，艾灸治療對膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨有保護作用，能夠有效地降低KOA兔膝關(guān)節(jié)炎癥聚集，減輕膝關(guān)節(jié)局部腫脹、疼痛，改善其活動步態(tài)與關(guān)節(jié)活動度，療效與p38 MAPK抑制劑SB203580治療相當(dāng)。提示p38 MAPK信號通路可能參與了艾灸治療膝骨關(guān)節(jié)炎的過程。具體的分子機制有待于進一步的實驗研究。