呼 琳 宋冰冰 郝好英 王 璐 何巧花

河南省人民醫(yī)院(鄭州,450003)

輔助生殖技術(shù)(ART)是治療不孕癥的主要手段，凍融囊胚移植(FBT)子宮內(nèi)膜容受性較好，使子宮內(nèi)膜與胚胎發(fā)育有同步性，且凍融過(guò)程中可淘汰部分發(fā)育不佳的囊胚;另外，囊胚略過(guò)胚胎基因組激活期，可一定程度去除非整體胚胎利于胚胎選擇，因此，凍融單囊胚移植(SFBT)技術(shù)在輔助人類生殖領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用，可有效改善臨床妊娠率并降低多胎妊娠發(fā)生。目前研究認(rèn)為[1-3]，F(xiàn)BT的臨床妊娠結(jié)局與女性患者年齡、囊胚質(zhì)量、激素、維生素D等有關(guān)[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，凍融胚胎移植(FET)后第3d雌二醇(E2)水平可預(yù)測(cè)自然周期FET的妊娠結(jié)局[6]；另外，25-OH維生素D[25(OH)D]可能通過(guò)影響子宮內(nèi)膜容受性進(jìn)而降低FET的妊娠率[7]。但血清E2、25(OH)D水平與SFBT臨床妊娠結(jié)局的關(guān)系鮮有報(bào)道?；诖?，本研究通過(guò)測(cè)定接受SFBT的女性血清E2、25(OH)D水平，分析兩者與臨床妊娠結(jié)局的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性收集2018年6月-2020年7月于本院接受SFBT的女性患者臨床資料204例，按其臨床妊娠結(jié)局分為非妊娠組和妊娠組。收集囊胚移植日內(nèi)膜厚度、不孕類型、基礎(chǔ)卵泡刺激素(bFSH)水平等資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①男女雙方染色體均正常；②不孕原因是男性或輸卵管因素；③均行單囊胚移植；④女性月經(jīng)周期均較規(guī)律。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有家族性/遺傳性病史；②合并高泌乳素血癥、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌病、多囊卵巢綜合征、甲狀腺內(nèi)分泌疾?。虎酆喜⒆訉m畸形、宮腔粘連；④有子宮畸形術(shù)、宮腔粘連分離術(shù)；⑤有不良孕產(chǎn)史。女性患者或家屬簽署知情同意書，研究符合《赫爾辛基宣言》，獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1囊胚培養(yǎng)不孕女性經(jīng)常規(guī)促排卵后取卵，根據(jù)男方精液狀況采用卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射單精子受精或常規(guī)體外受精。受精后第3天選1～2個(gè)胚胎用于冷凍/移植，剩余正常受精的胚胎放入G2培養(yǎng)液(瑞典Vitrolife公司)中囊胚培養(yǎng)2～3d，符合冷凍標(biāo)準(zhǔn)的囊胚采用玻璃化冷凍儲(chǔ)存。

1.2.2囊胚凍融囊胚冷凍：將囊胚激光皺縮后放于平衡液中，室溫平衡12 min，轉(zhuǎn)置玻璃化冷凍液(日本KITAZATO公司)中平衡45s，將囊胚行液氮保存。囊胚復(fù)蘇：囊胚移植當(dāng)天將囊胚于液氮中取出，迅速置于復(fù)蘇液(日本KITAZATO公司)中解凍，于培養(yǎng)液中沖洗數(shù)次后移入提前平衡過(guò)夜的G2囊胚培養(yǎng)液(瑞典Vitrolife公司)中，之后放入37℃、5% O2、6% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。囊胚移植前需判斷囊胚存活狀況：囊胚腔重新擴(kuò)張為囊胚存活。

1.2.3內(nèi)膜準(zhǔn)備、囊胚移植內(nèi)膜準(zhǔn)備：均采用自然周期內(nèi)膜準(zhǔn)備。月經(jīng)周期第11天起采用B超監(jiān)測(cè)卵泡，至排卵日后第1天給予常規(guī)黃體支持，第5天行囊胚移植。

1.2.4臨床妊娠判定囊胚移植后第14天測(cè)定人絨毛膜促性腺激素(HCG)水平，HCG>25 mU/ml于囊胚移植后第28天B超檢查，有孕囊確定為臨床妊娠。

1.2.5指標(biāo)檢測(cè)收集女性囊胚移植后第3天空腹外周血，采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國(guó)雅培)微顆?；瘜W(xué)發(fā)光法測(cè)定血清E2水平，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)AB)測(cè)定血清25(OH)D水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較

兩組年齡、不孕年限、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、子宮內(nèi)膜厚度、不孕類型、bFSH水平無(wú)差異(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組血清E2、25(OH)D水平比較

妊娠組血清E2(544.92±108.63 pmol/L)、25(OH)D(65.37±16.26 nmol/L)水平均高于非妊娠組(365.73±72.57 pmol/L、41.65±10.44 nmol/L)(t=14.472、12.257， 均P<0.001)。

2.3 影響SFBT臨床妊娠結(jié)局因素分析

以SFBT女性是否妊娠(否=0、是=1)為因變量，年齡、不孕年限、BMI、內(nèi)膜厚度、不孕類型、bFSH、E2、25(OH)D為自變量，行l(wèi)ogistic回歸分析。結(jié)果顯示，E2、25(OH)D均是影響臨床妊娠結(jié)局的保護(hù)因素(P<0.05)，年齡是影響臨床妊娠結(jié)局的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表2。

表2 影響SFBT臨床妊娠結(jié)局因素的logistic回歸分析

2.4 血清E2、25(OH)D水平對(duì)SFBT臨床妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC曲線顯示，血清E2預(yù)測(cè)SFBT臨床妊娠結(jié)局的曲線下面積(AUC)為0.892(95%CI:0.849～0.936)，截?cái)嘀禐?44.76 pmol/L，約登指數(shù)為0.691，其敏感度、特異性分別為89.7%、79.4%；血清25(OH)D預(yù)測(cè)SFBT臨床妊娠結(jié)局的AUC為0.893(95%CI:0.849～0.937)，截?cái)嘀禐?2.72 nmol/L，約登指數(shù)為0.672，其敏感度、特異性分別為88.7%、78.5%；兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)SFBT臨床妊娠結(jié)局的AUC為0.949(95%CI:0.920～0.977)，約登指數(shù)為0.811，其敏感度、特異性分別為87.6%、93.5%。

3 討論

隨著玻璃化冷凍技術(shù)出現(xiàn)及囊胚培養(yǎng)技術(shù)日漸成熟，F(xiàn)BT臨床妊娠率顯著提高，且單囊胚移植可有效降低流產(chǎn)率及多胎妊娠率，SFBT已被臨床采用[8-9]。SFBT的臨床妊娠結(jié)局可能受多方面因素影響，尋找與SFBT臨床妊娠結(jié)局相關(guān)且可評(píng)估的指標(biāo)，對(duì)及時(shí)干預(yù)并改變臨床妊娠結(jié)局有一定參考意義。

E2是子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備所必需物質(zhì)，其影響子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化及胚胎對(duì)子宮內(nèi)膜粘附，有助于孕育囊胚，且影響黃體期呈現(xiàn)的第二個(gè)高峰，可提高妊娠率，與妊娠結(jié)局密切相關(guān)[10-11]。E2可有效預(yù)測(cè)早孕期妊娠結(jié)局[12]；另外，E2在非正常妊娠女性中呈低水平，對(duì)臨床判定早孕結(jié)局有一定指導(dǎo)意義[13]。以上研究表明，血清E2水平異?？赡芘c不良妊娠結(jié)局相關(guān)。本研究中非妊娠女性血清E2水平低于妊娠女性，提示E2可能影響SFBT的臨床妊娠結(jié)局。推測(cè)，囊胚移植后第3日是孕激素分泌達(dá)到高峰、黃體成熟、E2分泌第二高峰期，而血清E2水平降低引起孕激素受體不足，導(dǎo)致黃體功能降低，使胚胎種植率降低[6]，影響妊娠結(jié)局，但其具體影響機(jī)制有待深入探究證實(shí)。本研究顯示，血清E2預(yù)測(cè)行SFBT治療女性臨床妊娠結(jié)局的AUC為0.892，當(dāng)E2<444.76 pmol/L時(shí)臨床妊娠幾率較小，提示E2有望成為預(yù)測(cè)SFBT臨床妊娠結(jié)局的潛在指標(biāo)。

維生素D可通過(guò)與其受體結(jié)合，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性及卵巢功能，進(jìn)而影響性激素產(chǎn)生、卵泡發(fā)育、胚胎種植過(guò)程，其缺乏可降低妊娠率甚至不孕[14-15]。25(OH)D是血液循環(huán)中維生素D的形式，可有效反映機(jī)體維生素D水平。研究發(fā)現(xiàn)，孕婦缺乏25(OH)D可增加妊娠合并癥及不良妊娠結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，及時(shí)測(cè)定孕婦25(OH)D水平可有效預(yù)防不良妊娠結(jié)局發(fā)生[16-17]；另外，血清25(OH)D水平與體外受精-胚胎移植妊娠結(jié)局有關(guān)[18]。以上研究表明，25(OH)D水平較低可能與女性臨床妊娠結(jié)局關(guān)系密切。本研究顯示，非妊娠組血清25(OH)D水平低于妊娠組，提示25(OH)D可能在SFBT的妊娠過(guò)程中有重要作用。分析原因：25(OH)D水平降低，一方面，可能通過(guò)影響囊胚發(fā)育及子宮內(nèi)膜容受性進(jìn)而影響SFBT臨床妊娠結(jié)局；另一方面，其抑制Th1細(xì)胞增殖的作用降低，使白介素-2等殺傷性細(xì)胞因子產(chǎn)生較多，并抑制Th2細(xì)胞產(chǎn)生大量白介素-4等免疫耐受細(xì)胞因子，打破Th1/Th2平衡，造成免疫紊亂，使SFBT女性臨床妊娠幾率較低[19]。其具體機(jī)制仍需深入探討。本研究中，血清25(OH)D預(yù)測(cè)行SFBT治療女性臨床妊娠結(jié)局的AUC為0.893，當(dāng)血清25(OH)D水平低于52.72 nmol/L時(shí)，非臨床妊娠結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)較高，提示25(OH)D對(duì)SFBT臨床妊娠結(jié)局有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。

本研究顯示，E2、25(OH)D均是影響臨床妊娠結(jié)局的保護(hù)因素，年齡是影響臨床妊娠結(jié)局的危險(xiǎn)因素，提示囊胚移植后第3日血清E2、25(OH)D水平降低，可能通過(guò)影響黃體功能，引發(fā)免疫紊亂，調(diào)節(jié)子宮免疫耐受性，增加SFBT女性發(fā)生非臨床妊娠風(fēng)險(xiǎn)。監(jiān)控囊胚移植后第3日血清E2、25(OH)D水平，確定SFBT女性年齡，可有助于及時(shí)預(yù)防非臨床妊娠結(jié)局。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血清E2、25(OH)D聯(lián)合預(yù)測(cè)SFBT臨床妊娠結(jié)局的AUC、特異性均提高，提示E2、25(OH)D聯(lián)合檢測(cè)有較高的臨床參考價(jià)值。

綜上所述，E2、25(OH)D在SFBT非妊娠女性血清中呈低水平，兩者聯(lián)合檢測(cè)可提高對(duì)SFBT臨床妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)效能，對(duì)評(píng)估床妊娠結(jié)局有較高價(jià)值。后續(xù)仍需擴(kuò)大樣本、從多角度探討E2、25(OH)D在SFBT臨床妊娠結(jié)局中的影響機(jī)制，為臨床預(yù)測(cè)SFBT臨床妊娠結(jié)局增加理論依據(jù)。