黃卓雅 廖鵬娟 黃楚楚 蔡敏儀 蘇桂曉 王秀平 張 旻 王曉冰

廣東省惠州市中心人民醫(yī)院(516001)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMT)。主要表現(xiàn)為痛經(jīng)、慢性盆腔痛、不孕及性交不適[1]。雖為良性疾病但具有多次復(fù)發(fā)特點(diǎn)[2]。發(fā)病機(jī)制尚不明確，多數(shù)研究表明，EMT的發(fā)生與雌激素及其受體的表達(dá)調(diào)控有關(guān)[3]。表皮生長因子受體(EGFR)是一種細(xì)胞膜表面的糖蛋白受體，介導(dǎo)細(xì)胞的生長、增殖、分化、黏附等過程，在機(jī)體生長發(fā)育中起重要作用[4]。林鳳等[5]研究表明，EGFR在增生期子宮內(nèi)膜、不典型增生子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜樣腺癌中均有表達(dá)，在子宮內(nèi)膜樣腺癌中陽性表達(dá)顯著升高。G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(GPER)是一種新型雌激素受體，與雌激素結(jié)合后參與基因調(diào)控。研究表明，GPER在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者中高表達(dá)，且GPER表達(dá)與卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展及臨床分期有關(guān)[6]。然而，目前EGFR聯(lián)合GPER檢測在EMT中的研究報(bào)道不多。本研究探討EGFR和GPER在EMT患者子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)水平及其相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年1月-2020年1月在本院就診并手術(shù)治療的EMT患者42例，年齡(43.3±3.9)歲(28～49歲)；按美國生育協(xié)會(huì)(AFS)標(biāo)準(zhǔn)分期為Ⅰ～Ⅱ期23例，Ⅲ～Ⅳ期19例；增殖期15例，分泌期27例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合EMT診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②經(jīng)腹腔鏡和術(shù)后病理確診；③近半年內(nèi)未接受過激素類藥物或免疫抑制劑治療；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患子宮內(nèi)膜癌卵巢癌；②患內(nèi)分泌、代謝及免疫性疾??；③伴有子宮內(nèi)膜不典型增生；④患有心腦腎等重要器官疾病。另選取同期因子宮平滑肌瘤而行全子宮切除手術(shù)31例患者作為對照組，年齡(43.6±2.5)歲(39～47歲)，并經(jīng)病理診斷為正常子宮內(nèi)膜，其中增殖期18例，分泌期13例。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批，患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

One Step PrimeScriptmiRNA cDNA Synthesis Kit購自寶生物工程(大連)有限公司。兔抗人EGFR購自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司、GPER多克隆抗體購自英國Abcam公司，SP試劑盒、DAB顯色試劑盒、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 研究方法

1.3.1樣品采集及保存收集EMT患者手術(shù)后在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜組織及對照組正常子宮內(nèi)膜，經(jīng)生理鹽水沖洗后置10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋。取部分標(biāo)本提取總RNA。

1.3.2內(nèi)膜組織EGFR和GPER mRNA的表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測EGFR的表達(dá)。引物序列見表1。反應(yīng)條件：95℃，75s；95℃，30s；65℃，75s；95℃，15s；共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，采用2-△△CT分析法進(jìn)行計(jì)算EGFR、GPER表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3免疫組織化學(xué)染色將石蠟標(biāo)本切片，經(jīng)脫蠟、高壓抗原修復(fù)，加3%H2O2去除內(nèi)源性酶活性，10%山羊血清37℃封閉30min，分別加入EGFR、GPER多克隆抗體(工作濃度1:200)，4℃孵育過夜，再加入二抗(工作濃度1:100)37 ℃孵育30 min，DAB染色，用磷酸緩沖液代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：EGFR以細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕色為陽性，GPER以細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕色為陽性。細(xì)胞陽性率評分：隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)≥100個(gè)細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)<5% 0分，5%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分。根據(jù)染色強(qiáng)度評分，不著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩項(xiàng)計(jì)分后乘積得分，0～1分陰性(-)，2～4分弱陽性(+)，5～8分陽性(++)，>9分強(qiáng)陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1內(nèi)膜組織EGFR、GPER mRNA表達(dá)水平

EGFR、GPER mRNA表達(dá)水平EMT異位內(nèi)膜組織與在位內(nèi)膜組織無差異(P>0.05)，但均高于正常子宮內(nèi)膜組織(P<0.05)。見表2。

表2 各內(nèi)膜組織中mRNA表達(dá)比較

2.2 內(nèi)膜組織EGFR、GPER 蛋白表達(dá)水平

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，EGFR在細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)均有表達(dá)，GPER蛋白主要定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中，見圖1(1539頁)。EGFR、GPER 蛋白陽性表達(dá)率在EMT異位內(nèi)膜組織與在位內(nèi)膜組織無差異(P>0.05)，但均高于正常子宮內(nèi)膜組織(P<0.05)。見表3。

表3 各內(nèi)膜組織EGFR、GPER 蛋白表達(dá)水平比較[例(%)]

2.3 EMT在位內(nèi)膜增殖期和分泌期EGFR與GPER表達(dá)水平比較

EMT在位內(nèi)膜組織中EGFR、GPER蛋白在增殖期的陽性表達(dá)率高于分泌期(P<0.05)，而正常子宮內(nèi)膜組織中EGFR、GPER蛋白在增殖期與分泌期表達(dá)未見差異(P>0.05)。見表4。

表4 不同內(nèi)膜組織增生期和分泌期EGFR、GPER表達(dá)水平比較[例(%)]

2.4 EMT異位內(nèi)膜EGFR、GPER蛋白表達(dá)與EMT臨床分期關(guān)系

異位內(nèi)膜組織中，EGFR、GPER蛋白在Ⅲ～Ⅳ期陽性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)。見表5。

表5 EMT異位內(nèi)膜EGFR、GPER蛋白表達(dá)與EMT臨床分期關(guān)系[例(%)]

2.5 EMT組織中EGFR和GPER mRNA表達(dá)相關(guān)性

分析結(jié)果顯示，EMT組織中EGFR、GPER mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.581，P=0.000)。見圖2(1539頁)。

3 討論

EMT病變廣泛可發(fā)生于任何部位，具有性激素依賴的特點(diǎn)，能導(dǎo)致患者不孕及卵巢功能的破壞，具有類似低度惡性腫瘤的反復(fù)多次復(fù)發(fā)、不易切除干凈等特點(diǎn)。因此，探討EMT的發(fā)病機(jī)制，抑制子宮內(nèi)膜腺體細(xì)胞的增殖與過度生長，對EMT的診斷治療有重要意義[8-9]。

EGFR屬酪氨酸蛋白激酶受體家族成員，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖及生理活動(dòng)方面發(fā)揮重要作用。研究表明[10]，在子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型中，EGFR抑制劑可有效治療子宮內(nèi)膜異位病變并降低基質(zhì)金屬蛋白酶7(MMP-7)蛋白活性。EGFR介導(dǎo)的MMP-7上調(diào)在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展過程中，通過ERK1-AP1軸起到促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用。另有研究表明，EGFR在妊娠早期調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜功能方面發(fā)揮重要作用[11]。陶偉華等[12]研究表明，EGFR蛋白在子宮平滑肌瘤組織中表達(dá)升高，且與肌瘤數(shù)目增加、體積增大有一定關(guān)系。鈕怡超等[13]研究表明，子宮平滑肌瘤剔除術(shù)后復(fù)發(fā)患者子宮肌瘤旁肌層組織EGFR陽性表達(dá)高于非復(fù)發(fā)組，提示EGFR可能與子宮平滑肌瘤復(fù)發(fā)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，在EMT組織中EGFR蛋白表達(dá)水平高于正常子宮內(nèi)膜組織，且EMT在位子宮內(nèi)膜組織中增殖期EGFR陽性表達(dá)率高于分泌期，EMT異位內(nèi)膜組織中III～Ⅳ期的EGFR蛋白陽性表達(dá)率高于I～I(xiàn)I期，提示EGFR與EMT發(fā)生及分期有關(guān)。

GPER為新鑒定的雌激素受體，但又不同于經(jīng)典的雌激素受體ERα和ERβ，不僅能以相對較高的親和力與雌激素相結(jié)合，而且能觸發(fā)雌激素反應(yīng)。有研究表明，在子宮內(nèi)膜樣腺癌發(fā)生發(fā)展過程中，GPER可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞對雌激素的反應(yīng)；GPER抑制劑能有效抑制雌激素誘導(dǎo)的乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞MCF-12A生長[14-15]；GPER激動(dòng)劑可誘導(dǎo)卵巢異位的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞有絲分裂時(shí)的細(xì)胞周期阻滯，最終導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥的細(xì)胞凋亡[16]。研究表明[17]GPER激動(dòng)劑可激活EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響細(xì)胞增殖，可能為促進(jìn)細(xì)胞增殖、減弱自身凋亡，提示EGFR與GPER可能存在相互作用。本研究結(jié)果顯示，GPER在EMT組織中高表達(dá)，在位內(nèi)膜組織中GPER蛋白在增殖期的陽性表達(dá)率高于分泌期，異位內(nèi)膜組織中GPER蛋白在III～Ⅳ期的陽性表達(dá)率高于I～I(xiàn)I期。提示GPER可能參與了EMT的發(fā)生發(fā)展。EMT有著類似于低度惡性腫瘤特性，本文Pearson分析顯示EMT組織中EGFR與GPER表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示EGFR與GPER可能相互作用，共同參與了EMT的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，EMT組織中EGFR、GPER高表達(dá)，與EMT的發(fā)生及臨床分期有關(guān)，二者可能在EMT的發(fā)生中存在相互協(xié)同作用。但由于本研究臨床樣本數(shù)據(jù)少，其在子宮內(nèi)膜異位癥作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。