劉君恒，馮曉颯，張 源，高建忠

( 1.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306； 2.上海海洋大學(xué)，上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306； 3.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306 )

魚類是現(xiàn)存脊椎動物中最大的類群，距今已有6億多年的存在歷史，它們代表了廣泛的生理學(xué)、生態(tài)學(xué)和自然歷史[1-3]。雜交作為物種強化和基因重組的主要驅(qū)動力，在物種歷史演變中發(fā)揮重要作用[4]。近50年來，由于過度捕撈，現(xiàn)有魚類已無法滿足人類對水產(chǎn)品的需求，雜交被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域中[5]。但早期人們對于魚類雜交研究主要集中在雜種優(yōu)勢的應(yīng)用上，對于相關(guān)基礎(chǔ)遺傳學(xué)的報道較少[6]。

研究發(fā)現(xiàn)，不同魚類因為食性和攝食習慣的差異會導(dǎo)致其消化道在結(jié)構(gòu)和功能上有所不同[7-8]。如草魚(Ctenopharyngodonidellus)♀和鳙魚(Aristichthysnobilis)♂雜交F1代在食性上更接近于草魚[9]；Li等[5]在對團頭魴(Megalobramaamblycephala)和翹嘴鲌(Culteralburnus)進行正、反雜交后發(fā)現(xiàn)，所獲得的兩種雜交后代在腸道形態(tài)上都更接近于團頭魴。

錦鯉(Cyprinuscarpio)和草金魚(Carassiusauratus)是重要觀賞魚類，深受廣大水族愛好者的喜愛。為選育觀賞價值更高的長尾錦鯉，筆者進行了錦鯉與長尾草金魚的雜交。同時發(fā)現(xiàn)，錦鯉與草金魚雖同為雜食性魚類，但錦鯉腸道粗大，草金魚腸道細長，且排布狀態(tài)存在差異，而錦鯉與草金魚雜交子代的腸道性狀也不同于雙親，推測二者雜交子代腸道遺傳特性可能介于錦鯉與草金魚之間。為查明錦鯉和草金魚雜交子代的腸道參數(shù)和功能特征，筆者選取昭和錦鯉與長尾草金魚作為親本，進行自交及正、反交，并對子代的腸道參數(shù)、組織形態(tài)、pH環(huán)境及消化酶活性進行比較分析，以期為錦鯉與草金魚雜交育種和飼養(yǎng)提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 親本來源及苗種生產(chǎn)

親本昭和錦鯉和長尾草金魚均來自上海海洋大學(xué)觀賞水族良種培育與健康養(yǎng)殖實驗室。于2019年5月8日挑選品相良好、體質(zhì)健壯的親本進行人工注射催產(chǎn)。親本于5月9日開始產(chǎn)卵受精，后經(jīng)自然孵化得到昭和錦鯉自交F1(昭和組)、長尾草金魚自交F1(草金組)、正交F1(長尾草金魚♀×昭和錦鯉♂，正交組)和反交F1(昭和錦鯉♀×長尾草金魚♂，反交組)。

1.1.2 養(yǎng)殖管理

分別選取昭和組、草金組、正交組和反交組各150尾試驗魚，每組分成6個平行，每個平行25尾，進行分缸飼養(yǎng)。試驗過程中養(yǎng)殖用水為曝氣后的自來水，溶解氧>5.0 mg/L，水溫25～28 ℃，pH 7.1。各組魚苗開口餌料為鹵蟲無節(jié)幼體。待試驗魚轉(zhuǎn)食顆粒飼料后移入5 m×3 m水泥池中，按照魚體質(zhì)量的3%日投喂3次(8：00、13：00、18：00)，喂養(yǎng)周期為45 d。

1.2 樣品采集

養(yǎng)殖試驗結(jié)束時，將試驗魚進行8 h饑餓處理，每組魚隨機選取10尾用間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(100 mg/L)麻醉后，用游標卡尺和天平測量魚體長(L, mm)、體質(zhì)量(m, g)后在冰面上進行解剖，取魚體整個腸道，測量其腸長(LG, mm)、腸質(zhì)量(mG, g)。用解剖刀輕輕刮取魚體前腸、中腸和后腸內(nèi)容物1 g置于無菌離心管，用于測量腸道pH；另取腸壁用0.68%無菌生理鹽水沖洗后置于無菌離心管內(nèi)，保存于-80 ℃用于消化酶活性測定；再分別選取10尾魚，將腸道按折點劃分為前腸、中腸和后腸，置于波恩氏液中固定[10]，用于腸道切片組織形態(tài)測定。

1.3 樣品處理

腸道pH測定：將腸道內(nèi)容物解凍后，參照文獻[11]的方法測定。腸道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性參照南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進行測定[12]。將腸道組織從波恩氏液中取出用75%乙醇洗滌后，經(jīng)脫水、包埋(取各腸段中間1 cm)、切片和蘇木精—伊紅染色等步驟進行觀察測量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計計算及分析

RGL=LG/L

(1)

RGD=LG/m

(2)

wGM=mG/m

(3)

IZ=LG/[10×(m1/3)][13]

(4)

切片形態(tài)數(shù)據(jù)采用Image J軟件進行測量，所測得試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，并用Turkey方法進行多重比較(顯著性水平為0.05)。試驗統(tǒng)計分析結(jié)果用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 昭和錦鯉與長尾草金魚自交及正、反交F1腸道參數(shù)比較

昭和組和正交組的腸質(zhì)量差異不顯著(P>0.05)，草金組和反交組的腸質(zhì)量差異不顯著(P>0.05)，但昭和組和正交組的腸質(zhì)量顯著高于草金組和反交組的腸質(zhì)量(P<0.05)(表1)。昭和組和反交組的腸長差異不顯著(P>0.05)，但均顯著低于草金組和正交組的腸長(P<0.05)。昭和組與草金組的相對腸長、Zihler′s指數(shù)以及相對腸密度差異顯著(P<0.05)，但正交組和反交組之間差異不顯著(P>0.05)，介于兩自交組之間。昭和組與兩雜交組的相對腸質(zhì)量差異不顯著(P>0.05)，但草金組的相對腸質(zhì)量為0.12，顯著高于這3個試驗組。

表1 昭和錦鯉與長尾草金魚自交及正、反交F1腸道參數(shù)

2.2 昭和錦鯉與長尾草金魚自交及正、反交F1腸道組織形態(tài)比較

4組魚的前中后腸絨毛高度均存在顯著性差異(P<0.05)，前中后腸絨毛高度大小均為：昭和組>正交組>反交組>草金組(表2)。草金組與正、反交組的前腸隱窩深度差異不顯著(P>0.05)，但昭和組的前腸隱窩深度顯著高于其他3組(P<0.05)。4組魚的中、后腸隱窩深度存在顯著性差異(P<0.05)，中腸隱窩深度大小為：草金組>昭和組>反交組>正交組，后腸隱窩深度大小為：昭和組>反交組>草金組>正交組。正交組和反交組的前腸肌層厚度在兩自交組之間無顯著性差異(P>0.05)，且昭和組的前腸肌層厚度顯著高于草金組(P<0.05)。但草金組與反交組的中腸肌層厚度無顯著性差異(P>0.05)，與昭和組、正交組的中腸肌層厚度有顯著性差異(P<0.05)，且顯著低于昭和組、正交組的中腸肌層厚度。4組魚的前中后腸的黏膜厚度均存在顯著性差異(P<0.05)，雜交組在兩自交組之間，昭和組顯著高于草金組(P<0.05)。昭和組和正交組的前中腸絨毛高度/隱窩深度無顯著性差異(P>0.05)，且顯著高于其他兩組的前中腸絨毛高度/隱窩深度(P<0.05)。4組魚的后腸絨毛高度/隱窩深度存在顯著性差異(P<0.05)，大小依次為：昭和組>正交組>反交組>草金組。

表2 昭和錦鯉與長尾草金魚自交及正、反交F1腸道組織形態(tài)

2.3 昭和錦鯉與長尾草金魚自交及正、反交F1腸道pH比較

正交組和反交組的前腸pH無顯著性差異(P>0.05)，但與兩個親本之間存在顯著性差異(P<0.05)，正反交的前腸pH低于草金組pH，而高于昭和組pH(表3)。4組魚的中后腸pH均不存在顯著性差異(P>0.05)。

表3 昭和錦鯉與長尾草金魚自交及正、反交F1腸道pH

2.4 昭和錦鯉與長尾草金魚自交及正、反交F1腸道消化酶活比較

4組試驗魚的淀粉酶差異顯著(P<0.05)，且正交組淀粉酶活性為107.43 U/mg，顯著高于昭和組和反交組(圖1a)。昭和組和草金組的脂肪酶活性差異不顯著(P>0.05)，但顯著低于正交組和反交組的脂肪酶活性，且反交組脂肪酶活性最高(圖1b)。正交組和反交組的蛋白酶活性無顯著性差異(P>0.05)，介于兩自交組之間，但昭和組的蛋白酶活性顯著低于草金組(P<0.05)(圖1c)。

3 討 論

3.1 昭和錦鯉與長尾草金魚自交、正反交F1腸道參數(shù)

消化道作為魚類食物消化、吸收的主要場所，其承載魚類生命活動的基礎(chǔ)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，不同魚類因為食性和攝食習慣的差異會導(dǎo)致其消化道在結(jié)構(gòu)和功能上有所不同[10,15]，這也使得人們在魚類育種工作中對于親本和子代之間的遺傳差異有更好的了解。因此對魚腸道指數(shù)的研究，有助于人們更好地研究魚類攝食習性和健康狀況。腸長指數(shù)和Zihlre′s指數(shù)常被用來反映魚類的食性偏向性，對腸質(zhì)量和密度的研究，進一步反映了魚類對食物的消化能力。本試驗結(jié)果顯示，昭和錦鯉與長尾草金魚雖同為雜食性魚類，但長尾草金魚的相對腸長、Zihlre′s指數(shù)、相對腸密度、相對腸質(zhì)量均大于昭和錦鯉，說明長尾草金魚為雜食偏草食性魚類。通過雜交得到的后代，其腸道指標與親本相比均發(fā)生改變，且介于兩親本之間，這說明雜交后代的形態(tài)結(jié)構(gòu)受親本遺傳因素的影響，這與團頭魴和翹嘴鲌雜交及雜交鱘(Husohuso♀×A.schrenscki♂)的試驗中得出的結(jié)論相符[5,16]。本試驗結(jié)果顯示，雜交組魚腸道長度和質(zhì)量更偏向于各自的父本，但腸道指數(shù)之間并沒有顯示出這種偏向性。

3.2 昭和錦鯉與長尾草金魚自交及正、反交F1腸道組織形態(tài)

對腸道組織觀察可進一步了解魚類對食物的消化吸收能力，反映動物腸道消化功能的重要指標有絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度等[17-18]。其中腸絨毛對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收起重要作用，絨毛越長，其吸收部位面積越大，消化能力越強。隱窩深度是反映腸細胞分化絨毛的能力，腸道絨毛高度越高、隱窩深度越淺表示絨毛高度/隱窩深度越高，其消化吸收功能越強[16]。黏膜層有很多皺褶，這些皺褶可增大腸壁面積，腸黏膜的正常結(jié)構(gòu)與功能是營養(yǎng)物質(zhì)充分消化與吸收的基本保證[19]。肌層厚度變化對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運效率有重要的影響[20]。魚類腸道根據(jù)腸道在體內(nèi)粗細變化及折轉(zhuǎn)方向分成前、中、后3段[21]，前腸主要與消化吸收相關(guān)，中腸和后腸主要與免疫相關(guān)[22]。本試驗中，正交組的絨毛高度、肌層厚度和黏膜厚度3個指標均高于長尾草金魚組，且4組子代前腸絨毛高度均明顯高于中、后腸。前腸隱窩深度依次為正交組、長尾草金魚自交組、反交組、昭和錦鯉自交組。前、中腸的絨毛高度/隱窩深度正交組高于其他3組，且4組魚的前腸絨毛高度/隱窩深度高于中、后腸；而反交組的各項指標均介于兩個親本之間。通過以上結(jié)果分析可知，正交組腸道絨毛密集、肌層厚實，收縮力強，對營養(yǎng)物質(zhì)消化能力強，具雜種優(yōu)勢。從腸道健康方面考慮，應(yīng)選擇昭和錦鯉作為父本。這與徐瑩等[23-24]所觀察的草魚♀×赤眼鱒(Squaliobarbuscurriculus)♂雜交F1腸道組織形態(tài)的結(jié)果相似。

3.3 昭和錦鯉與長尾草金魚自交及正、反交F1腸道pH及消化酶活性

魚類的消化酶活性是反映魚類消化生理機能的一項重要指標[8]，消化器官的組織結(jié)構(gòu)和消化機能是與其食性相適應(yīng)的，消化器官的組織結(jié)構(gòu)不同其消化機能不同，消化酶的活性也有明顯差異[25]。本試驗正、反交子代腸道淀粉酶、脂肪酶活性均大于親本，脂肪酶、淀粉酶活性反映魚類對能量的利用情況[26]，表明雜交子代對飼料中脂肪和淀粉等營養(yǎng)物質(zhì)的利用率可能更高。長尾草金魚蛋白酶活性大于昭和錦鯉。魚類腸道(尤其是前腸)是魚類消化吸收的主要場所[27]，腸道蛋白酶的最適pH為8.0～10.0，甚至高達11.0[28-31]。本試驗中，子代蛋白酶活性和前腸pH大小均為：長尾草金魚自交組>正、反交組>昭和錦鯉自交組。較低的昭和錦鯉蛋白酶活性可能是因為前腸pH影響了蛋白酶活性[32-33]。腸道內(nèi)pH的改變會影響消化酶活性，進而影響到雜交魚的生長和發(fā)育[32-33]，為保證食物的消化吸收，可以在其飼料中添加一定的酶制劑，提高飼料利用率。

4 結(jié) 論

昭和錦鯉與長尾草金魚正、反交子代腸道特性高于或介于二者自交子代之間，綜合了二者的腸道性狀。