馬晨夕,趙金良,曾萌冬,宋銀都,周云紅
( 上海海洋大學(xué),農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心,水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,上海 201306 )
糖代謝是動(dòng)物體內(nèi)的重要生理代謝過程,糖可為機(jī)體生長(zhǎng)代謝提供所需能源和碳源,滿足機(jī)體生命活動(dòng)的基本需求。糖代謝主要包括糖異生、糖酵解、戊糖磷酸等代謝途徑,魚類糖代謝基本過程與哺乳動(dòng)物相似。在機(jī)體內(nèi)糖原是葡萄糖的儲(chǔ)存形式,在血液中的運(yùn)輸形式是葡萄糖,血糖水平可反映機(jī)體內(nèi)糖代謝狀況[1]。血糖水平主要受胰島素和胰高血糖素的調(diào)節(jié)[2]。對(duì)于養(yǎng)殖魚類,飼料中淀粉是體外糖的主要來源,攝入后經(jīng)淀粉酶消化成單糖,吸收后經(jīng)血液運(yùn)輸?shù)礁鹘M織中進(jìn)行合成代謝和分解代謝。研究表明,魚類對(duì)糖的利用能力較低,表現(xiàn)在高血糖的不耐受性和低血糖的耐受性[3],肉食性魚類對(duì)碳水化合物利用能力更低,與草食性和雜食性魚類相比,當(dāng)攝入葡萄糖后,肉食性魚類的糖酵解效能弱而糖異生效能強(qiáng)是糖利用率低的主要原因[4]。盡管如此,魚體內(nèi)仍有完善的葡萄糖感知、吸收與代謝調(diào)控機(jī)制[5]。
鱖魚(Sinipercachuatsi)為肉食性養(yǎng)殖魚類,養(yǎng)殖時(shí)主要投喂活魚餌。魚苗階段,當(dāng)餌料魚供應(yīng)不足時(shí),鱖魚苗表現(xiàn)為耐饑餓能力差,常會(huì)發(fā)生自相殘殺,影響魚苗產(chǎn)量[10],饑餓狀態(tài)下,魚類糖代謝會(huì)發(fā)生變化。另一方面,為擺脫鱖魚養(yǎng)殖對(duì)活魚餌的嚴(yán)重依賴,20世紀(jì)80年代后期起,國(guó)內(nèi)學(xué)者開展了大量的飼料馴化和配合飼料中營(yíng)養(yǎng)需求研究[11-12]。目前認(rèn)為,鱖魚對(duì)蛋白質(zhì)的需求量很高,能耐受較高的脂肪水平,而對(duì)碳水化合物的利用較差[13-14],但碳水化合物對(duì)魚類生長(zhǎng)是必不可少的。筆者對(duì)鱖幼魚進(jìn)行了人工飼料投喂、饑餓與活餌再投喂處理,分析對(duì)其肝體指數(shù)、肝肌糖原含量和血糖濃度、激素含量及代謝酶活性的影響,探究不同營(yíng)養(yǎng)水平下鱖幼魚糖代謝的變化,以期為鱖幼魚營(yíng)養(yǎng)生理學(xué)提供基礎(chǔ)資料。
鱖幼魚購(gòu)自湖州市某家庭農(nóng)場(chǎng),于上海海洋大學(xué)新場(chǎng)養(yǎng)殖基地室內(nèi)水泥池中暫養(yǎng)。取鱖幼魚600尾,平均體長(zhǎng)(44±1.02) mm,平均體質(zhì)量(1.94±0.15) g,進(jìn)行飼料馴化,采用“活餌→活餌加死餌→死餌加冰鮮餌→冰鮮加軟顆粒飼料→軟顆粒飼料”方式逐步過渡馴化,馴化從2019年6月1日開始,馴化時(shí)間為17 d,直至鱖幼魚完全攝食飼料;另取鱖幼魚300尾,平均體長(zhǎng)(43±1.36) mm,平均體質(zhì)量(1.89±0.12) g,采用活魚餌投喂。飼料投喂、饑餓與活餌再投喂與飼料馴化的試驗(yàn)環(huán)境一致,水深2.0 m,水溫(23±0.5) ℃,溶解氧≥8.0 mg/L,pH 7.5~8.0。鱖魚粉料購(gòu)自浙江某生物科技有限公司,投喂前30 min,粉料與水按7∶3(質(zhì)量比)均勻混合,擠壓成粒徑0.3 cm×0.7 cm的飼料。餌料魚為鯽魚(Carassiusauratus)苗,全長(zhǎng)2 cm,購(gòu)自上海市松江水產(chǎn)良種場(chǎng)。
1.2.1 飼料養(yǎng)殖試驗(yàn)
自飼料馴化成功的鱖幼魚中隨機(jī)挑選45尾測(cè)量體質(zhì)量,作為飼料組的初始值,平均體質(zhì)量(3.27±0.63) g;自活餌投喂中挑選規(guī)格相近45尾測(cè)量體質(zhì)量,作為活餌組的初始值,平均體質(zhì)量(3.54±0.52) g。飼料組和活餌組各設(shè)3個(gè)平行,每個(gè)平行15尾,置于1 m×1 m×1.5 m網(wǎng)箱中進(jìn)行養(yǎng)殖試驗(yàn)。飼料組每日表觀飽食投喂2次(8:00和16:00),活餌組足量投喂活鯽魚苗,試驗(yàn)周期為3周。
1.2.2 饑餓與再投喂試驗(yàn)
從投喂活餌的鱖幼魚中挑選健康狀況良好、規(guī)格整齊的135尾,平均初始體長(zhǎng)(81.06±2.58) mm,平均初始體質(zhì)量(8.14±1.38) g,隨機(jī)分成3組:正常投喂組、饑餓組、饑餓后再投喂組,每組各設(shè)3個(gè)平行,每個(gè)平行15尾。正常投喂組連續(xù)投喂活鯽魚苗3周,饑餓組3周內(nèi)均不投餌,饑餓后再投喂組為饑餓2周、再投喂活鯽魚苗1周,其他試驗(yàn)條件同上,試驗(yàn)周期為3周。
1.2.3 樣品采集
取樣前,各組試驗(yàn)魚均禁食1 d,放入間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽麻醉液(400 mg/L)中完全麻醉后,擦干水分,稱量體質(zhì)量、測(cè)體長(zhǎng)。每組隨機(jī)取10尾,每尾斷尾取血約0.1 mL,置于肝素鈉處理過的離心管中,12 000 r/min(離心半徑12 cm)離心5 min,取血清,置于-80 ℃保存,待測(cè)血糖濃度。隨后,于冰塊上迅速取肝臟和背部肌肉稱量質(zhì)量,置于-80 ℃下保存待測(cè)。
1.2.4 生化測(cè)定
酶活性測(cè)定:在冰水浴上取各組試驗(yàn)魚肝臟,用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(0.01 mol/L,pH 7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果),稱量0.06 g組織,剪碎,按1∶9(m/V)的比例加入磷酸緩沖鹽溶液540 μL,用玻璃勻漿器在冰水浴中勻漿,勻漿混合液4 ℃、5000 r/min(離心半徑12 cm)離心8 min,吸取離心上清液于(25±1) ℃條件下使用酶標(biāo)儀(Synergy H1,美國(guó)伯騰儀器有限公司)在450 nm下分別測(cè)定葡萄糖激酶、己糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶、果糖-1,6-二磷酸酶、葡萄糖脫氫酶、糖原合成酶、糖原磷酸化酶以及胰島素、胰高血糖素吸光度值。所用試劑購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司,具體操作步驟和試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算按說明書進(jìn)行。
由于吸收塔的空塔流速一般在3~4m/s,而濕電內(nèi)部的電場(chǎng)風(fēng)速為2~3m/s,所以濕電殼體的直徑往往大于下部吸收塔的直徑,這對(duì)濕電和吸收塔的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)提出了更為苛刻的要求。如不能解決結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)問題,那么一體式濕電無疑就是“空中樓閣”。
血糖測(cè)定采用葡萄糖氧化酶法[15],肝、肌糖原的測(cè)定采用蒽酮顯色法[16],所用試劑購(gòu)自南京建成生物科技有限公司,具體方法按說明書操作步驟進(jìn)行。
1.2.5 相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析
在Excel 2019中對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,運(yùn)用SPSS 19.0軟件對(duì)每組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,用單因子方差分析和LSD多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),每組數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,顯著性水平為0.05。
RLGR/%=(Lt-L0)/L0×100%
wWGR/%=(mt-m0)/m0×100%
wLWGR/%=(mht-mh0)/mh0×100%
wLI/%=mh/m×100%
式中,RLGR為體長(zhǎng)增長(zhǎng)率;wWGR為體質(zhì)量增加率;wLWGR為肝質(zhì)量增加率;wLI為肝指數(shù);Lt、L0分別代表試驗(yàn)魚的平均終末體長(zhǎng)、平均初始體長(zhǎng)(mm);mt、m0分別代表試驗(yàn)魚的平均終末體質(zhì)量、平均初始體質(zhì)量(g);mht、mh0分別代表試驗(yàn)魚的平均終末肝質(zhì)量、平均初始肝質(zhì)量(g);t表示試驗(yàn)天數(shù)(d);mh、m分別代表試驗(yàn)魚的肝臟質(zhì)量、體質(zhì)量(g)。
在飼料養(yǎng)殖試驗(yàn)中,經(jīng)過3周投喂配合飼料和活餌對(duì)鱖幼魚生長(zhǎng)影響顯著?;铕D組與飼料組的體長(zhǎng)、體質(zhì)量、肝質(zhì)量終末值與初始值相比均顯著增加(P<0.05)(表1)。且活餌組體長(zhǎng)、體質(zhì)量、肝質(zhì)量終末值與飼料組終末值相比均顯著增加(P<0.05)?;铕D組體長(zhǎng)增長(zhǎng)率、體質(zhì)量增加率、肝質(zhì)量增加率均顯著高于飼料組??傮w來看,飼料組生長(zhǎng)速度顯著慢于活餌組,而飼料組的肝指數(shù)顯著高于活餌組(P<0.05)。
表1 飼料養(yǎng)殖試驗(yàn)鱖幼魚各組生長(zhǎng)指標(biāo)的變化
在饑餓與再投喂試驗(yàn)中,與正常投喂組相比,饑餓組體長(zhǎng)、體質(zhì)量、肝質(zhì)量與肝指數(shù)均顯著下降(P<0.05)(表2),其中體質(zhì)量顯著下降57%,肝質(zhì)量顯著下降70.83%,肝指數(shù)顯著下降;再投喂組體長(zhǎng)、體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝指數(shù)均有恢復(fù)。
在飼料養(yǎng)殖試驗(yàn)中,飼料組、活餌組肝糖原含量和血糖濃度與各組初始值差異不顯著,飼料組與活餌組肌糖原含量均顯著高于各組初始值(P<0.05),飼料組肝糖原、肌糖原含量和血糖濃度與活餌組間差異不顯著(表3)。飼料組葡萄糖激酶、己糖激酶活性與活餌組間未見顯著差異,與其初始值差異也不顯著,而飼料組磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶活性顯著高于活餌組(P<0.05)。飼料組糖異生代謝酶磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶、果糖-1,6-二磷酸活性與活餌組間差異不顯著;戊糖磷酸途徑代謝酶葡萄糖脫氫酶活性與活餌組差異也不顯著。飼料組與活餌組糖原合成酶、糖原磷酸化酶活性差異不顯著,胰島素含量、胰高血糖素質(zhì)量濃度差異不顯著,且與各初始值間無顯著變化。
表2 饑餓與再投喂試驗(yàn)鱖幼魚各組生長(zhǎng)指標(biāo)的變化
表3 飼料養(yǎng)殖試驗(yàn)各組糖代謝相關(guān)指標(biāo)的變化比較
在饑餓與再投喂試驗(yàn)中,與正常投喂組相比,饑餓組肝糖原、肌糖原含量和血糖濃度均顯著下降(P<0.05)(表4),其中肝糖原含量顯著下降74.32%,肌糖原含量顯著下降44.19%,血糖濃度也顯著下降37.70%;再投喂組肝糖原含量顯著恢復(fù)(P<0.05),肌糖原含量有一定水平恢復(fù),血糖濃度基本恢復(fù)到最初水平。與正常投喂組相比,饑餓組糖酵解酶活性均有不同程度下降,其中,磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶活性顯著性下降(P<0.05);再投喂組糖酵解各代謝酶活性無顯著變化。與正常投喂組相比,饑餓組糖異生途徑中磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶、果糖-1,6-二磷酸活性基本無變化,戊糖磷酸途徑中葡萄糖脫氫酶活性顯著下降(P<0.05);再投喂組糖異生代謝酶活性差異不顯著,而戊糖磷酸途徑葡萄糖脫氫酶差異顯著(P<0.05)。與正常投喂組相比,饑餓組糖原合成酶活性顯著下降(P<0.05),糖原磷酸化酶活性顯著升高(P<0.05),胰島素含量顯著下降,胰高血糖素質(zhì)量濃度顯著上升;饑餓后再投喂組糖原合成酶、糖原磷酸化酶活性恢復(fù),胰島素含量、胰高血糖素質(zhì)量濃度恢復(fù)到正常水平。
表4 饑餓與再投喂試驗(yàn)各組糖代謝相關(guān)指標(biāo)的變化比較
目前認(rèn)為,鱖幼魚配合飼料中蛋白質(zhì)最適含量為44.7%~45.8%[13],脂質(zhì)最適含量為7%~12%[11],本試驗(yàn)中所用飼料基本符合,能滿足鱖幼魚的生長(zhǎng)需求。與活餌投喂相比,飼料投喂對(duì)鱖幼魚生長(zhǎng)仍有一定影響,具體表現(xiàn)為飼料組體長(zhǎng)增長(zhǎng)率、體質(zhì)量增加率均顯著低于活餌組,這一結(jié)果與雜交鱘(Acipenserschrenckii♀ ×A.baeri♂)仔魚[17]和點(diǎn)帶石斑魚(Epinepheluscoioides)幼魚[18]飼料投喂后生長(zhǎng)結(jié)果基本一致。分析認(rèn)為,人工飼料中可能因缺乏生物活餌料中的某些微量活性物質(zhì),使蛋白酶分泌減少[19],因此,活餌投喂比飼料投喂更利于促進(jìn)魚體對(duì)食物的消化利用。由于鱖魚飼料中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成含量與活餌間存在差異,因此,也在一定程度上影響鱖幼魚攝食與生長(zhǎng)。
對(duì)南方鲇(Silurusmeridionalis)[20]和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[21]研究發(fā)現(xiàn),飼料中過多的糖可轉(zhuǎn)化成糖原儲(chǔ)存在肝臟中,導(dǎo)致肝指數(shù)增大。對(duì)烏鱧(Channaargus)[22]研究發(fā)現(xiàn),肝指數(shù)的增大與肝臟脂肪含量有關(guān)。本試驗(yàn)中,飼料組與活餌組在肝糖原含量上并無顯著差異,飼料組肝指數(shù)高于活餌組,可能由于飼料制作過程中某些必需營(yíng)養(yǎng)素(如維生素)被破壞[23-24],部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不平衡造成肝臟脂肪代謝緩慢,轉(zhuǎn)運(yùn)失調(diào),導(dǎo)致脂肪肝形成,肝組織有一定程度增大[25]。飼料中脂肪含量高可引起魚類脂肪肝[26],本試驗(yàn)中,飼料的粗脂肪含量顯著高于活魚餌,可能為飼料組肝指數(shù)高的原因。飼料中合理的營(yíng)養(yǎng)配比不僅有利于魚體生長(zhǎng),對(duì)魚體健康也至關(guān)重要。
本試驗(yàn)中,活餌與飼料喂食3周,飼料組血糖濃度、糖原含量、胰島素含量和胰高血糖素質(zhì)量濃度與活餌組間均無顯著差異。除飼料組糖酵解代謝酶磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶活性顯著高于活餌組外,其他糖代謝途徑中代謝酶活性并無顯著差異。一般來說,當(dāng)飼料淀粉含量增加時(shí),在一定程度上會(huì)促進(jìn)糖酵解過程,表現(xiàn)為糖酵解酶活性增強(qiáng),以減少血液中的葡萄糖濃度,維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡,這在歐洲鱸(Dicentrarchuslabrax)[27]和河鱸(Percafluviatilis)[28]的不同碳水化合物水平對(duì)肝糖代謝影響研究中得到證實(shí)。另有研究報(bào)道,不同的糖脂比影響糖酵解酶活性,且糖的來源[29]及魚的種類不同時(shí),糖酵解發(fā)生變化的關(guān)鍵酶亦會(huì)出現(xiàn)不同變化[30]。本試驗(yàn)中,飼料與活餌的糖脂比分別為71.25%、23.81%。在飼料喂食條件下,糖酵解磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶活性表現(xiàn)增強(qiáng),推測(cè)可能為飼料與活餌中糖脂比不同引起的,且飼料的糖脂比高于活餌。
當(dāng)面臨饑餓脅迫時(shí),魚類和其他動(dòng)物一樣,也會(huì)動(dòng)用儲(chǔ)能物質(zhì)(如糖原、脂類和蛋白質(zhì))來提供能量,且魚類更傾向優(yōu)先動(dòng)用脂類和蛋白質(zhì)供能[31-32]。本試驗(yàn)中,饑餓組與正常投喂組相比,體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝指數(shù)顯著下降,肝糖原含量、肌糖原含量、血糖水平也顯著下降。肝臟是主要的儲(chǔ)能場(chǎng)所,肝臟中貯存大量肝糖原,肝糖原可分解維持血糖水平,使魚體在饑餓狀態(tài)下維持一定的血糖濃度[33]。肝指數(shù)下降與肝糖原含量下降,說明在饑餓過程中鱖幼魚動(dòng)用了肝糖原來提供能量,這在南方鲇幼魚[34]的糖代謝研究中也有相似結(jié)果。肌肉是體質(zhì)量的主要組成部分,糖在肌肉組織中以肌糖原形式儲(chǔ)存,在特定生理饑餓狀態(tài)下,即肝糖原消耗到一定程度時(shí),機(jī)體也會(huì)動(dòng)用肌糖原協(xié)助提供能量維持生存需要[35]。本試驗(yàn)中,從體質(zhì)量的下降程度來看,饑餓狀態(tài)下除糖原分解外,鱖幼魚體內(nèi)蛋白質(zhì)和脂肪也應(yīng)有消耗,兩者通過糖異生作用生成葡萄糖,與肝糖原分解共同維持血糖濃度。這在食蚊魚(Gambusiaaffinis)和唐魚(Tanichthysalbonubes)幼魚饑餓狀態(tài)下主要能量物質(zhì)消耗研究[36]中有過報(bào)道。
本試驗(yàn)中,饑餓對(duì)鱖幼魚胰島素含量和胰高血糖素質(zhì)量濃度影響顯著。饑餓狀態(tài)下,鱖幼魚胰島素含量顯著下降,胰高血糖素質(zhì)量濃度顯著上升,說明鱖幼魚體內(nèi)胰島素和胰高血糖素參與體內(nèi)血糖濃度調(diào)控。饑餓狀態(tài)下,胰島素含量降低和糖原合成酶活性下降的結(jié)果證明胰島素與它促進(jìn)合成代謝的特性相適應(yīng)[37-38]。胰高血糖素質(zhì)量濃度升高可促進(jìn)體內(nèi)肝糖原的分解和非糖物質(zhì)(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等)的轉(zhuǎn)化來快速升高血糖。
本試驗(yàn)中,與正常投喂組相比,鱖幼魚饑餓組戊糖磷酸途徑中葡萄糖脫氫酶活性下降幅度最大,糖酵解途徑磷酸果糖激酶次之,相比之下,糖異生途徑的磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶、果糖-1,6-二磷酸活性下降較小。正常生理狀態(tài)下,戊糖磷酸途徑可為魚體內(nèi)脂肪合成提供所需的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,當(dāng)處于饑餓狀態(tài)時(shí),推測(cè)鱖幼魚體內(nèi)戊糖磷酸途徑可能減弱或受到抑制,即通過抑制脂肪合成作用,減少其他代謝對(duì)葡萄糖的消耗來維持血糖濃度,滿足生命活動(dòng)基本需求。饑餓狀態(tài)下,隨著血糖濃度的持續(xù)降低,鱖幼魚磷酸果糖激酶活性下降,表明糖酵解途徑隨血糖水平相應(yīng)減弱。饑餓狀態(tài)下盡可能減少葡萄糖的消耗維持血糖濃度,這是魚體面對(duì)饑餓脅迫時(shí)的生理對(duì)策[39]。這也與草魚在饑餓狀態(tài)下糖酵解酶活性變化[37]相似。從肝糖原的耗竭程度來看,通過糖異生作用由非糖物質(zhì)蛋白質(zhì)和脂肪生成葡萄糖是提供葡萄糖能量的重要途徑,磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶、果糖-1,6-二磷酸活性降低最少,表明鱖幼魚在肝糖原顯著耗竭時(shí),糖異生作用對(duì)維持體內(nèi)葡萄糖水平更為重要。
有研究表明,短期饑餓后再投喂可使魚類機(jī)體生理功能恢復(fù)到正常水平,或出現(xiàn)補(bǔ)償生長(zhǎng)作用[40-41]。本試驗(yàn)中,鱖幼魚饑餓再投喂后肝質(zhì)量、肝指數(shù)、血糖濃度能恢復(fù)正常投喂組水平,但在體長(zhǎng)、體質(zhì)量、肝糖原、肌糖原各指標(biāo)方面仍與正常投喂組有差異(P<0.05)。不同指標(biāo)具有不同的恢復(fù)速度,可能與再投喂時(shí)間相對(duì)較短、葡萄糖補(bǔ)充量時(shí)間不足以及不同代謝過程有關(guān)。隨著葡萄糖補(bǔ)充水平的增加,各項(xiàng)指標(biāo)將得到相應(yīng)的最大恢復(fù),甚至?xí)霈F(xiàn)補(bǔ)償生長(zhǎng)。
本試驗(yàn)中,飼料組鱖幼魚生長(zhǎng)速度顯著慢于活餌組,兩組體內(nèi)糖代謝途徑無明顯差異。饑餓與活餌再投喂對(duì)鱖幼魚體內(nèi)的糖代謝影響較為顯著,具體體現(xiàn)在血糖、肝糖原、肌糖原、戊糖磷酸途徑代謝酶葡萄糖脫氫酶、糖酵解代謝酶磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、糖原合成酶、糖原磷酸化酶、胰島素及胰高血糖素水平變化顯著,再投喂后不同指標(biāo)恢復(fù)速度不同。