周曉謙 金星姬 楊竹生 楊秀敏

[摘要]目的：探討百里香醌對(duì)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞增殖、凋亡的影響及可能機(jī)制。方法：將A431細(xì)胞分為對(duì)照組，低、中、高濃度實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組采用DMEM培養(yǎng)，而低、中、高濃度實(shí)驗(yàn)組分別采用含1、15、30μg/ml百里香醌的DMEM培養(yǎng)。MTT法檢A431細(xì)胞增殖;臺(tái)盼藍(lán)法觀察A431細(xì)胞存活;劃痕試驗(yàn)檢測(cè)各組A431細(xì)胞遷移;免疫熒光法檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá);Westernblot檢測(cè)各組A431細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cyto C和PARP蛋白表達(dá)。結(jié)果：百里香醌能有效抑制人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞增殖，且呈濃度及時(shí)間依賴性;臺(tái)盼藍(lán)法顯示，百里香醌濃度增加使A431細(xì)胞死亡率上升，呈濃度依賴性;與對(duì)照組比較，低、中、高濃度實(shí)驗(yàn)組A431細(xì)胞遷移能力降低;與對(duì)照組比較，經(jīng)百里香醌處理后A431細(xì)胞Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)降低;Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，不同濃度百里香醌處理后A431細(xì)胞Bax、cyto-C、caspase-3和PARP表達(dá)水平增加，而Bcl-2表達(dá)下降。結(jié)論：百里香醌具有抑制A431細(xì)胞增殖、侵襲以及誘導(dǎo)凋亡的作用，其機(jī)制可能是Bax/Bcl-2比值升高，促使釋放至胞漿中Cyto C增加，進(jìn)而激活Caspase-3以及PARP蛋白有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]百里香醌;人皮膚鱗狀細(xì)胞癌;增殖;凋亡;遷移

[中圖分類號(hào)]R739.5? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2021）06-0114-04

Thymoquinone Regulates Caspase-3/Bax/Bcl-2 Signaling Pathway and Induces Proliferation and Apoptosis of Cutaneous Squamous Cell Carcinoma

ZHOU Xiao-qian，JIN Xing-ji，YANG Zhu-sheng，YANG Xiu-min

（Department of Dermatology，Beijing Tongren Hospital，Capital Medical University，Beijing 100730，China）

Abstract： Objective? To investigate the effect of thymoquinone on the proliferation and apoptosis of human cutaneous squamous cell carcinoma A431 cells and its possible mechanism. Methods? A431 cells were divided into the control group and the low， medium and high concentration experimental groups. The control group was cultured with DMEM， while the experimental-L， M， H groups were cultured with DMEM containing 1， 15 and 30 μg/ml thymoquinone， respectively. The proliferation of A431 cells was detected by MTT. The survival of A431 cells was observed by trypan blue method. The migration of A431 cells was detected by scratch test. The expression of Bax and Bcl-2 protein was detected by immunofluorescence. The expression of Bax， Bcl-2， Caspase-3， Cyto C and PARP protein in A431 cells were detected by Western blot. Results? Thymoquinone can effectively inhibit the proliferation of human skin squamous cell carcinoma A431 cells in a concentration and time-dependent manner. Trypan blue assay showed that the mortality of A431 cells increased with the increase of thymoquinone concentration. Compared with the control group， the migration ability of A431 cells in the experimental-L， M， H groups was decreased. Compared with the control group， the expression of Bax increased and the expression of Bcl-2 decreased in A431 cells treated with thymoquinone. Compared with the control group， the expression levels of Bax， Cyto-c， Caspase-3 and PARP were increased in A431 cells treated with different concentrations of thymoquinone， while the expression of Bcl-2 was decreased. Conclusion? Thymoquinone can inhibit the proliferation， invasion and induce apoptosis of A431 cells. The mechanism may be related to the increase of the ratio of Bax/Bcl-2， the increase of Cyto C released into the cytoplasm， and the activation of Caspase-3 and PARP protein.

Key words： thymoquinone; human cutaneous squamous cell carcinoma; proliferation; apoptosis; migration

人體皮膚是最直接與外界接觸的器官，有助于吸收、分泌和免疫，是人體抵御外界有害物質(zhì)侵入的第一道防線[1]。近年來，皮膚鱗狀細(xì)胞癌（Cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）在皮膚非黑色素細(xì)胞性惡性腫瘤中發(fā)病率居第二位，且呈增高趨勢(shì)[2]。然而，許多公眾對(duì)皮膚癌缺乏認(rèn)識(shí)，導(dǎo)致延誤診斷，影響及時(shí)有效的治療，嚴(yán)重影響患者的健康和生活。黑種草籽油是從黑種草中提取的油類物質(zhì)，百里香醌（Thymoquinone，TQ）是其中的主要活性成分，具有抗炎、抗微生物、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用[3]。大量研究報(bào)道，百里香醌可以通過多種機(jī)制參與不同類型腫瘤細(xì)胞的抗癌作用，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、結(jié)腸直腸癌等[4-5]。但百里香醌關(guān)于鱗狀細(xì)胞癌的作用機(jī)制尚未闡明，本研究旨在探討百里香醌對(duì)A431細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響，并探討其可能機(jī)制。

1? 材料和方法

1.1 試劑和儀器：百里香醌（美國(guó)Santa Cruz公司）;DMEM培養(yǎng)基（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）;多克隆Bcl-2相關(guān)X蛋白（BAX）、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、細(xì)胞色素C氧化酶（Cyto C）、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）;噻唑藍(lán)（MTT）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）;轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)，BIORAD）;多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)，Biotek）。

1.2 細(xì)胞株和分組：A431細(xì)胞來源于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM中培養(yǎng)，細(xì)胞置于5% CO2、37℃孵育箱中，相對(duì)濕度為（85±5）%，70%時(shí)融合后，可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn);將A431細(xì)胞分為對(duì)照組（Control），低、中、高濃度實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，而低、中、高濃度實(shí)驗(yàn)組分別采用含1、15、30μg/ml百里香醌的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測(cè)百里香醌對(duì)A431細(xì)胞活力影響：用不同濃度（1、15、30μg/ml）的百里香醌處理A431細(xì)胞（1×106個(gè)/毫升），將處理后的細(xì)胞培養(yǎng)24、48和72h，用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力，二甲基亞砜溶解細(xì)胞中的藍(lán)紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值，細(xì)胞活力用陰性對(duì)照（0d）的相對(duì)百分比表示。

1.4 臺(tái)盼藍(lán)染色試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活：將A431細(xì)胞（1×106個(gè)/毫升）接種到6孔培養(yǎng)板中，并置于5% CO2、37℃孵育箱中培養(yǎng)過夜，然后用0、1、15和30μg/ml百里香醌處理細(xì)胞24h，胰蛋白酶消化，細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以9：1混勻，孵育3min后，在顯微鏡下觀察（死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染）。

1.5 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)百里香醌對(duì)A431細(xì)胞遷移：將各組A431細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合時(shí)，用無(wú)菌20μl槍尖垂直線性劃痕，用PBS洗2遍，洗去細(xì)胞碎片和死細(xì)胞，加1 000μl培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，劃痕后0、24h拍照，比較各組間劃痕愈合的差異。

1.6 免疫熒光法檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)[6]：將百里香醌（0，15μg/ml）處理24h的A431細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15min，然后PBS清洗，加入0.5% riton X-100處理15min（再次清洗），并用5%羊血清封閉30min，加入一抗Bax（1：2 000稀釋）和Bcl-2（1：1 000稀釋），4℃下孵育過夜，PBS沖洗細(xì)胞，加入FITC偶聯(lián)抗兔IgG室溫下孵育1h，沖洗，加入DAPI復(fù)染，用熒光顯微鏡檢測(cè)觀察。

1.7 Westernblot檢測(cè)各組A431細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cyto C和PARP蛋白表達(dá)[7]：用百里香醌處理細(xì)胞48h，離心RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取蛋白，BCA法蛋白定量。每孔20μl上樣，樣品直接用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，于室溫下用5%脫脂牛奶封閉2h，一抗4℃下孵育過夜，隨后TBST洗膜，室溫下與HRP結(jié)合的二抗孵育1h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）化學(xué)發(fā)光試劑顯色，曝光成像，使用Image J軟件對(duì)得到的圖像進(jìn)行掃描和量化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，通過單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組比較，P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 各組A431細(xì)胞增殖情況比較：與陰性對(duì)照組（0d）相比，經(jīng)百里香醌（15、30μg/ml）治療后細(xì)胞活力下降（P<0.05），且不同濃度百里香醌治療后A431細(xì)胞活力逐漸降低呈劑量及時(shí)間依賴性，而經(jīng)1μg/ml百里香醌治療后，各時(shí)間點(diǎn)A431細(xì)胞活力無(wú)顯著性差異（P>0.05）。見圖1。

2.2 各組A431細(xì)胞活性比較：臺(tái)盼藍(lán)法觀察發(fā)現(xiàn)，死細(xì)胞呈明顯的藍(lán)色染色，無(wú)色透明細(xì)胞為活細(xì)胞。對(duì)照組A431細(xì)胞呈圓形、無(wú)色、透明，形狀規(guī)則，呈細(xì)胞間粘附，很少有藍(lán)色染色的死細(xì)胞;經(jīng)低濃度百里香醌處理后，觀察到一些相互粘附的無(wú)色細(xì)胞，而一些細(xì)胞被染成藍(lán)色，而百里香醌濃度增加會(huì)導(dǎo)致藍(lán)色染色細(xì)胞縮小、數(shù)量相應(yīng)增加，呈分散狀。見圖2。

2.3 百里香醌對(duì)各組A431細(xì)胞遷移影響：與對(duì)照組（0h）相比，24h后對(duì)照組劃痕逐漸愈合;24h后中、高濃度實(shí)驗(yàn)組劃痕距離大于對(duì)照組（0h）。見圖3。

2.4 百里香醌對(duì)A431細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)影響：Bax和Bcl-2蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)中。與對(duì)照組相比，經(jīng)15μg/ml百里香醌處理后A431細(xì)胞Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)降低。此外，與對(duì)照組相比，還觀察經(jīng)百里香醌處理后活細(xì)胞（DAPI染色的藍(lán)色細(xì)胞）數(shù)量減少，見圖4～5。

2.5 百里香醌對(duì)A431細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cyto C和PARP蛋白表達(dá)影響：與對(duì)照組相比，經(jīng)不同濃度百里香醌（0、1、15、30μg/ml）處理后A431細(xì)胞中Bax、Caspase-3、Cyto C和PARP蛋白表達(dá)逐漸升高，而Bcl-2表達(dá)下降，見圖6～7。

3? 討論

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cSCC）是一種起源于表皮或附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞的皮膚惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類健康[8]。盡管大部分皮膚鱗狀細(xì)胞癌都能通過手術(shù)切除，但仍有部分cSCC可以通過復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等途徑導(dǎo)致死亡，對(duì)于這些高危型cSCC至今仍無(wú)有效治療方案[9]。

百里香醌（TQ）作為一種天然活性成分，對(duì)多種惡性腫瘤如：肝癌、胰腺癌、大腸癌、肺癌、皮膚癌等均有治療作用[10]。研究還發(fā)現(xiàn)，百里香醌在多種癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲等過程中能起到抑制性作用[11]。然而，TQ對(duì)cSCC細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響目前仍不明確，因此本研究探討TQ是否通過Caspase-3/Bax/Bcl-2信號(hào)通路影響皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431的凋亡，為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的治療提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

MTT法檢測(cè)顯示，與陰性對(duì)照（0d）相比，不同濃度百里香醌（15、30μg/ml）治療后A431細(xì)胞活力下降，且隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，這說明百里香醌抑制A431細(xì)胞增殖具有劑量和時(shí)間依賴性。另一方面，臺(tái)盼藍(lán)染色顯示，經(jīng)低濃度百里香醌處理后，一些細(xì)胞被染成藍(lán)色，隨著百里香醌濃度增加藍(lán)色染色細(xì)胞萎縮、數(shù)量相應(yīng)增加，呈分散狀，觀察到不貼壁細(xì)胞，這說明百里香醌濃度的增加會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，24h后，中、高濃度實(shí)驗(yàn)組劃痕距離大于對(duì)照組（0h），說明百里香醌能抑制A431細(xì)胞的遷移，且具有劑量依賴性。

細(xì)胞凋亡過程不僅受到抗凋亡和促凋亡效應(yīng)分子的嚴(yán)格調(diào)控，如Bcl-2蛋白家族，還可以通過多種途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)[12]。Bcl-2家族包含抑制（Bax）和促進(jìn)細(xì)胞凋亡（Bcl-2）兩類功能相反的蛋白質(zhì)[13]。Bax/Bcl-2的表達(dá)比率對(duì)于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡至關(guān)重要，這個(gè)比率決定并調(diào)節(jié)細(xì)胞進(jìn)入凋亡階段的進(jìn)程[14]。Bax/Bcl-2比值的增加會(huì)刺激細(xì)胞色素C（Cyto C）從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞質(zhì)中的Cyto C與Apaf-1結(jié)合，激活Caspase-3和PARP[15]。活化的Caspase-3是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，負(fù)責(zé)關(guān)鍵細(xì)胞蛋白的切割和失活[16]，而PARP是一種促進(jìn)DNA損傷修復(fù)的酶[17]。Western blot檢測(cè)結(jié)果，經(jīng)不同濃度百里香醌處理后，A431細(xì)胞中Bax、Caspase-3、Cyto C和PARP蛋白表達(dá)逐漸升高，而Bcl-2表達(dá)下降。這提示Bax/Bcl-2比值升高，促使釋放至胞漿中Cyto C增加，可能與輔助因子Apaf-1結(jié)合并在ATP或dATP存在下促使其形成多聚體，進(jìn)而激活Caspase-3以及PARP蛋白;免疫熒光染色結(jié)果顯示，Bax和Bcl-2在細(xì)胞質(zhì)中廣泛分布，百里香醌處理后Bax和Bcl-2表達(dá)分別增加和減少，這進(jìn)一步證實(shí)了百里香醌誘導(dǎo)Bax/Bcl-2比值的增加及細(xì)胞凋亡，與Western blot檢測(cè)結(jié)果基本一致。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，百里香醌能抑制A431細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與百里香醌通過激活線粒體途徑，上調(diào)Bax/Bcl-2，進(jìn)而促進(jìn)Caspase-3、Cyto C和PARP在A431細(xì)胞中的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡有關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]鄭志忠，李利，劉瑋，等.正確的皮膚清潔與皮膚屏障保護(hù)[J].臨床皮膚科雜志，2017，46（11）：824-826.

[2]張佳音，鐘咪，饒美榮，等.皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中BAG-1表達(dá)變化對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制[J].山東醫(yī)藥，2018，58（45）：9-12.

[3]Hosseinzadeh H，Parvardeh S.Anticonvulsant effects of thymoquinone， the major? constituent of Nigella sativa seeds， in mice[J].Phytomedicine，2004，11（1）：56-64.

[4]蔡偉，楊佳丹，高珊，等.百里香醌對(duì)脂多糖誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].中國(guó)藥房，2019，30（4）：464-468.

[5]Woo CC，Kumar AP，Sethi G，et al.Thymoquinone： potential cure for inflammatory disorders and cancer[J].Biochem Pharmacol，2012，83（4）：443-451.

[6]涂幸，羅利，劉藝琳，等.葡萄籽原花青素提取物對(duì)HT22細(xì)胞糖氧剝奪損傷的保護(hù)作用[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2020， 36（1）：57-64.

[7]魏明，師廣勇，劉佳，等.生存素小分子干擾RNA對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞生存素基因表達(dá)及生物學(xué)功能的影響[J].中華皮膚科雜志，2018，51（4）：305-309.

[8]昝雪娟，榮冬蕓，潘軍玲，等.姜黃揮發(fā)油聯(lián)合順鉑對(duì)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制[J].中華皮膚科雜志，2018，51（4）：294-298.

[9]王瑞，王菲菲，楊俊亞.手術(shù)切除聯(lián)合液氮冷凍治療皮膚鱗狀細(xì)胞癌患者的臨床療效觀察[J].中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2019，38（12）： 1398-1400.

[10]Masood AK.Thymoquinone， a constituent of prophetic medicine-black seed， is a miracle therapeutic molecule against multiple diseases[J].Int J Health Sci （Qassim），2019，13（1）：1-2.

[11]Zhu WQ，Wang J，Guo XF，et al.Thymoquinone inhibits proliferation in gastric cancer via the STAT3 pathway in vivo and in vitro[J].World J Gastroenterol，2016，22（16）：4149-4159.

[12]王海臻，蔡丹純，廖丹丹，等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡在妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥中的作用及機(jī)制[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，38（5）：572-577.

[13]程新燕，符翠莉.芹菜素對(duì)大鼠骨肉瘤細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白Bax，Bcl-2，Caspase-3，Caspase-9，細(xì)胞色素C的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（15）：139-142.

[14]單海軍，曹彩紅，張英英，等.補(bǔ)腎開竅祛痰方對(duì)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬神經(jīng)元凋亡基因Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax比例變化的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2018，29（6）：1336-1338.

[15]孫吉鳳，何海濤.黃芩素通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)體外培養(yǎng)喉癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2018，38（8）：1947-1951.

[16]竇雪嬌，陳松，張紅.七氟烷經(jīng)不同途徑吹入對(duì)體外循環(huán)犬肺組織呼吸功能和Caspase-3表達(dá)的影響[J].重慶醫(yī)學(xué)，2019，48（6）：917-920.

[17]李玲玲，趙玉霞.PARP-1及其抑制劑與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及放射敏感性關(guān)系研究進(jìn)展[J].中華放射腫瘤學(xué)雜志，2017，26（11）：1350-1353.

[收稿日期]2021-01-06

本文引用格式：周曉謙，金星姬，楊竹生，等.百里香醌調(diào)控Caspase-3/Bax/Bcl-2信號(hào)通路誘導(dǎo)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌增殖和凋亡的作用機(jī)制研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2021，30（6）：114-117，163.