張華敏，劉娜，鄧巧娟

（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東 湛江 524000）

非酒精性脂肪性肝病（non alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除病毒或酒精等因素引起的肝損傷，國內(nèi)目前有超過1.5億患者，其中20%~40%患者發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）[1-2]。細(xì)胞焦亡是近年來發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的一種新的程序性細(xì)胞死亡方式，目前已有研究表明細(xì)胞焦亡在NASH的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[3-4]。

羥基紅花黃色素A是一種單查爾酮類化合物，具有抗氧化、抗凋亡、抗炎癥、抗血小板凝集等活性。LI Y N[5]等研究表明羥基紅花黃色素A對于肝纖維化有一定的療效。HE Y[6]等研究表明羥基紅花黃色素A對大鼠酒精性肝損傷具有保護(hù)作用。本研究采用游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）處理L-02細(xì)胞建立NASH細(xì)胞模型，在此基礎(chǔ)上觀察和測定羥基紅花黃色素A對NASH的影響，并探尋其作用機(jī)制是否與肝細(xì)胞細(xì)胞焦亡有關(guān)，從而為NASH的臨床治療研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞L-02細(xì)胞系購于中科院上海細(xì)胞庫，將細(xì)胞解凍后離心，加入DMEM培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑 羥基紅花黃色素A（上海士鋒生物科技有限公司，貨號：78281-02-4，純度≥98%）；DMEM（美國Gibco公司，貨號：12100046）；胎牛血清（美國Gibco公司，貨號：16000044）；油紅O染色液（上海生工，貨號：E607319-0010）；油酸（上海生工，貨號：A502071-0250）；棕櫚酸（上海純優(yōu)生物，貨號：P0687）；一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒（上海生工，貨號：B639277-0050）；Trizol（上海生工，貨號：B610409-0025）；炎癥小體感受器分子NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）兔單克隆抗體（艾博抗公司，貨號：M00034）；半胱氨酸蛋白酶1（Cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase-1）兔單克隆抗體（艾博抗公司，貨號：ab207802）；消皮素D（Gasdermin D，GSDMD）兔單克隆抗體（艾博抗公司，貨號：ab209875）；白細(xì)胞介素-18（IL-18）兔多克隆抗體（艾博抗公司，貨號：ab207324）；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）兔多克隆抗體（英國abcam，貨號：ab9722）；磷酸甘油脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔多克隆抗體（英國abcam，貨號：ab9485）；HRP標(biāo)記二抗（英國abcam，貨號：ab30451）。

1.3 主要儀器HERAcell150i型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；51029702型超凈臺（Thermofisher公司）；680型酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）；CFX96型PCR儀（Bio-Rad公司）；PowerPac Basic型電泳儀（Bio-Rad公司）；AlphaImager HP型凝膠成像系統(tǒng)（美國阿爾法公司）。

1.4 分組與給藥 將油酸或棕櫚酸溶解于無水乙醇中，制備為50 mmol/L的儲存液。羥基紅花黃色素A溶解于DMEM培養(yǎng)基，濃度為500 mg/L。實(shí)驗(yàn)分為對照組、模型組和羥基紅花黃色素A組，對照組為不做處理的人正常肝臟細(xì)胞L-02，模型組用500μmol/L的FFA（油酸∶棕櫚酸=2∶1）處理L-02細(xì)胞24 h，羥基紅花黃色素A組在模型組基礎(chǔ)上用0.2 mg/mL的羥基紅花黃色素A處理細(xì)胞24 h，羥基紅花黃色素A處理時(shí)間和方法參考文獻(xiàn)[5]。

1.5 油紅O染色檢測各組細(xì)胞中的脂質(zhì)沉積 將油紅O工作液加入各組細(xì)胞中，室溫孵育60 min，棄染色液，用PBS清洗后，顯微鏡下觀察拍照。

1.6 ELISA檢測各組細(xì)胞內(nèi)ALT、AST、SOD、MDA、IL-18、IL-1β含量 收集各組細(xì)胞，2 500 r/min離心20 min，收集上清備用。按照各自ELISA檢測試劑盒說明書檢測細(xì)胞內(nèi)谷丙轉(zhuǎn)移酶（Alanine transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、IL-18、IL-1β含量。

1.7 RT-qPCR檢測細(xì)胞中NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、GSDMD mRNA表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，分別加入TRIzol提取RNA，再參照一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒檢測NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、GSDMD mRNA表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參。RT-qPCR反應(yīng)程序見說明書。引物如下，NLRP3正向：5'-GCGCCTCAGTTAGAGGATGT-3'，反向：5'-ACCAGCTACAA AAAGCATGGA-3'；Caspase-1正向：5'-TTTCCGCAAGGTTCGATTTTCA-3'，反向：5'-GGCATCTGCGCTCTACCATC-3'。GSDMD正向5'-CCATCGGCCTTTGAGAAAGTG-3'，反向：5'-ACACATGAATAACGGGGTTTCC-3'；GAPDH正向：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3'，反向：5'-GGGGTCATT GATGGCAACAATA-3'。

1.8 Western blotting檢測各組細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，分別加入RIPA裂解液，冰上放置20 min后，4℃13 000 r/min離心20 min，取35μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)PVDF膜，用2%BSA封閉液封閉，分別加入一抗（1∶1 000）4℃過夜，以GAPDH抗體（1∶10 000）為參照，再加入二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h。ECL曝光成像，采用Alpha Imager HP凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較均采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 油紅O染色結(jié)果 對照組細(xì)胞內(nèi)未出現(xiàn)紅色脂滴，模型組細(xì)胞紅色脂滴較多，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞間隙變大；與模型組比較，羥基紅花黃色素A組紅色脂滴減少，細(xì)胞腫脹得到改善。（見圖1）

圖1 油紅O染色結(jié)果圖（×400）

2.2 羥基紅花黃色素A抑制NASH炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激 與對照組比較，模型組IL-18、IL-1β、MDA明顯升高（P＜0.05），SOD明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，羥基紅花黃色素A組IL-18、IL-1β、MDA明顯下降（P＜0.05），SOD明顯升高（P＜0.05），提示羥基紅花黃色素A能夠改善NASH炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。（見圖2~3）

圖2 各組細(xì)胞炎癥因子含量比較（±s，n=3）

圖3 各組細(xì)胞MDA、SOD含量比較（±s，n=3）

2.3 羥基紅花黃色素A改善NASH肝細(xì)胞損傷 與對照組比較，模型組AST、ALT含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，羥基紅花黃色素A組AST、ALT含量明顯下降（P＜0.05），提示羥基紅花黃色素A能夠改善肝細(xì)胞損傷。（見圖4）

圖4 各組細(xì)胞ALT、AST含量比較（±s，n=3）

2.4 羥基紅花黃色素A抑制NLRP3 mRNA、Caspase-1mRNA、GSDMD mRNA的表達(dá) 與對照組比較，模型組NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、GSDMD mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，羥基紅花黃色素A組NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、GSDMD mRNA表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05）。（見圖5）

圖5 各組細(xì)胞NLRP3 mRNA、GSDMD mRNA、Caspase-1 mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=3）

2.5 羥基紅花黃色素A抑制NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β蛋白表達(dá) 與對照組比較，模型組NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，羥基紅花黃色素A組NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.05）。（見圖6）

圖6 各組細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β蛋白表達(dá)比較（±s，n=3）

3 討 論

隨著對NASH發(fā)病機(jī)制研究的深入，目前越來越多研究表明炎癥反應(yīng)是NASH的主要誘導(dǎo)因素，而肝臟脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致的氧化應(yīng)激也會加重對肝臟的損傷[7-9]。IL-1β和IL-18是炎癥因子，在NASH發(fā)展中加重肝臟炎癥反應(yīng)；SOD具有抗氧化的作用，而MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，二者分別代表著抗氧化能力和氧化損傷程度；ALT和AST反映肝功能損傷程度，當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，ALT和AST會呈升高狀態(tài)[10-11]。李風(fēng)林等[12]發(fā)現(xiàn)非酒精性脂肪肝病大鼠血清IL-1β、IL-18含量較對照組明顯升高。楊素貞等[13]對NASH模型大鼠及正常大鼠血清ALT、AST、肝組織中MDA和SOD進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠ALT、AST、MDA含量明顯升高，SOD含量明顯下降。羥基紅花黃色素A具有單查爾酮苷類結(jié)構(gòu)，是紅花黃色素的有效成分。近幾年已有研究表明，羥基紅花黃色素A可通過抑制活性氧的生成，調(diào)節(jié)SOD和MDA的活性來緩解氧化應(yīng)激[14]。此外，羥基紅花黃色素A能抑制炎性細(xì)胞因子IL-1β，TNF-α的表達(dá)[15-16]。因此，推測羥基紅花黃色素A抑制NASH的發(fā)生發(fā)展可能與抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)有關(guān)。為了驗(yàn)證推測，本研究采用FFA處理L-02建立NASH細(xì)胞模型，經(jīng)羥基紅花黃色素A處理后，L-02細(xì)胞的氧化應(yīng)激和炎癥水平明顯降低，且AST、ALT含量明顯下降，這與推測結(jié)論一致。此外，羥基紅花黃色素A處理細(xì)胞的劑量0.2 mg/mL是經(jīng)過參考文獻(xiàn)及前期MTT預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選確定的，羥基紅花黃色素A在0~0.2 mg/mL的范圍內(nèi)細(xì)胞存活率較高，為非細(xì)胞毒性劑量。

細(xì)胞焦亡是一種依賴于Caspase的炎性細(xì)胞死亡形式，伴隨著細(xì)胞腫脹，質(zhì)膜孔洞形成，調(diào)控大量促炎性細(xì)胞內(nèi)容物釋放[17]。目前已有研究表明肝臟庫普弗細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和肝細(xì)胞都能發(fā)生焦亡參與NASH發(fā)生機(jī)制的調(diào)節(jié)[18]。NLRP3屬于Nod樣受體家族，由凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域及半胱氨酸蛋白酶1前體蛋白3部分組成，其通過激活并裂解pro caspase-1來調(diào)控成熟IL-1β和IL-18的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，進(jìn)而擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[19]。目前已有研究表明敲除NASH模型小鼠肝組織NLRP3基因后可抑制炎性反應(yīng)，緩解脂肪變性和肝炎病情[20]。GSDMD基因定位于人染色體8q24，因具有質(zhì)膜成孔活性成為Caspase-1和Caspase-11介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡的主要執(zhí)行者。YANG Y[21]等研究表明激活NLRP3/Caspase-1/GSDMD細(xì)胞焦亡信號通路可以促進(jìn)人類子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞焦亡。本研究結(jié)果顯示模型組細(xì)胞NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β均被激活，說明NASH介導(dǎo)了細(xì)胞焦亡，而經(jīng)羥基紅花黃色素A處理后，L-02細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β表達(dá)水平明顯降低，這與MRIDHA A R等[20]的研究和XU B[22]等的研究結(jié)果相似，提示羥基紅花黃色素A可以抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD細(xì)胞焦亡信號通路激活。

綜上所述，羥基紅花黃色素A可減輕L-02細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平，抑制肝細(xì)胞焦亡，從而改善NASH肝細(xì)胞損傷，可能與其抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD細(xì)胞焦亡信號通路的激活有關(guān)。然而羥基紅花黃色素A通過何種途徑抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD細(xì)胞焦亡信號通路有待進(jìn)一步研究。