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        木薯MeSAD基因的電子克隆與生物信息學(xué)分析

        2021-11-22 11:03:38杜尚廣涂序堂曹文艷徐雅楠羅火林
        關(guān)鍵詞:進(jìn)化樹(shù)親水性木薯

        杜尚廣,涂序堂,熊 敏,余 波,曹文艷,徐雅楠,羅火林

        (1.南昌師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,南昌 330000;2.南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,南昌 330000)

        木薯(ManihotesculentaCrantz),又名樹(shù)葛,是大戟科木薯屬多年生灌木,起源于南美洲亞馬遜流域,現(xiàn)已廣泛分布于熱帶及亞熱帶區(qū)域[1-2]。木薯光合效率高、塊莖中含有大量的淀粉,是7億人賴(lài)以生存的主糧之一[3-4],木薯在我國(guó)已有200余年的種植歷史,是廣東、廣西和海南等地區(qū)的一種重要糧食作物。隨著木薯產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展,木薯廣泛應(yīng)用于飼料、乙醇等生產(chǎn),現(xiàn)已成為一種重要的工業(yè)原料[5-6]。木薯喜高溫、耐干旱貧瘠,但耐寒能力差;春潮早臨及倒春寒等低溫氣候?qū)?dǎo)致木薯減產(chǎn)、嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致絕產(chǎn),低溫現(xiàn)已成為木薯北移的主要限制因素[7-8]。目前,培育低溫耐受品種及其遺傳改良已成為世界性難題,因此克隆并研究木薯抗寒基因具有一定的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。

        Δ9-硬脂酰-ACP脫氫酶(SAD蛋白)是植物抵抗逆境脅迫的重要酶,并在響應(yīng)低溫過(guò)程中具有至關(guān)重要的作用[9]。低溫使植物細(xì)胞膜流動(dòng)性下降,引起膜脂相變、降解,甚至導(dǎo)致植物死亡[10]。不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acids,FAs)能夠提高生物膜的穩(wěn)定性,防止變?yōu)槟z相,維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定[10]。SAD是一種可溶性蛋白,定位于質(zhì)體基質(zhì),可將飽和的硬脂酰-ACP脂肪酸鏈還原成不飽和的油酰-ACP,提高植物中FAs的水平[3]。當(dāng)前研究表明,植物的耐寒能力和細(xì)胞中FAs的水平具有一定的聯(lián)系[11]。將擬南芥SAD6基因轉(zhuǎn)入突變體中,能夠顯著提高FAs的水平,并減小低溫、干旱和缺氧等逆境的傷害[12]。研究發(fā)現(xiàn),與野生型相比,SAD轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotianatabacum)植株FAs的含量增高,并且其抗寒能力明顯增強(qiáng)[13]。對(duì)擬南芥[14]、花生(Arachishypogaea)[15]和小麥(Triticumaestivum)[16]等研究表明,SAD基因在抵抗低溫脅迫過(guò)程中發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用,但尚未有關(guān)木薯SAD基因的報(bào)道。

        本研究利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),以擬南芥SAD同源蛋白為探針,通過(guò)電子克隆技術(shù)獲得木薯SAD基因的cDNA序列。使用生物信息學(xué)方法,對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行一級(jí)至高級(jí)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位等進(jìn)行預(yù)測(cè),并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),分析木薯SAD基因的進(jìn)化特征。因此,克隆木薯SAD基因?qū)ζ淠秃虻墓δ荑b定和遺傳改良提供參考,也為抗性品種的培育和篩選奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 木薯MeSAD基因的cDNA獲取

        以擬南芥的SAD氨基酸序列(登錄號(hào):2281099)為探針,利用tblast在線工具搜索木薯的同源EST序列,選取一條Query cover最高、E值最低的同源序列,并以之為誘餌,利用blast在線搜索能覆蓋誘餌的EST序列,利用DNAMAN拼接,繼續(xù)blast直至無(wú)新的EST序列可拼接,得到SAD基因的全cDNA序列。本實(shí)驗(yàn)所用的EST序列包括:DV455612.1、FF381161.1、FF380418.1、DB941776.1、DB938249.1、DB938249.1、DV456201.1和DB937741.1。

        1.2 理化性質(zhì)分析、疏水性/親水性分析

        分別利用DNAMAN和ORF finder軟件完成cDNA和開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)的翻譯和讀??;利用ProtParam tool在線工具完成蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的預(yù)測(cè);利用ProtScale軟件完成蛋白質(zhì)的親水性/疏水性分析。

        1.3 亞細(xì)胞定位和跨膜區(qū)分析、磷酸化位點(diǎn)與信號(hào)肽分析

        分別利用ProtComp 9.0和TMHMM等在線工具進(jìn)行表達(dá)蛋白亞細(xì)胞定位和跨膜區(qū)的分析;分別利用NetPhos 3.1、SignalP 4.1完成磷酸化位點(diǎn)與信號(hào)肽的預(yù)測(cè)和分析。

        1.4 二級(jí)及高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

        利用NCBI的CDD在線工具進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)和分析;利用SOPMA、SWISS-MODEL和VMD 1.9.3進(jìn)行二級(jí)及高級(jí)結(jié)構(gòu)的分析。

        1.5 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

        利用ClustalX 2.0軟件完成木薯和其他15種植物SAD蛋白序列的多重比對(duì)分析[6-7];利用MEGA X進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,進(jìn)化樹(shù)遺傳距離、檢驗(yàn)方法、循環(huán)次數(shù)分別設(shè)置為Kimura雙參數(shù)模型、Bootstrap method、1 000。

        2 結(jié)果

        2.1 基因全cDNA獲取

        在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中,利用擬南芥SAD氨基酸序列作為探針進(jìn)行比對(duì),選取相似度最高的序列,以之為探針繼續(xù)比對(duì),選擇7條親緣關(guān)系較近的EST進(jìn)行拼接和衍生;得到木薯SAD基因的全cDNA序列(圖1A)。cDNA序列總長(zhǎng)為1 685 bp,ORF為176~1 366 bp(圖1B);翻譯蛋白含396個(gè)氨基酸,起始和終止密碼子分別是ATG和TAA。新基因命名及表達(dá)蛋白名分別為MeSAD、MeSAD。

        2.2 理化性質(zhì)分析

        使用ProtParam tool工具預(yù)測(cè)MeSAD蛋白的理化性質(zhì)可知。表達(dá)蛋白包含396個(gè)氨基酸,由20種氨基酸構(gòu)成,含量最高和最低的氨基酸分別為亮氨酸(9.8%)、半胱氨酸(0.8%)。分子式是C2031H3181N545O597S15、分子量是45.3 kDa;脂肪系數(shù)是81.82;負(fù)電荷殘基是58、正電荷殘基是52;等電點(diǎn)(Theoretical pI)是5.93,呈酸性;不穩(wěn)定系數(shù)是37.55;平均總親水性是-0.443。

        圖1 (A)木薯SAD基因的cDNA拼接圖、(B)cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

        2.3 疏水性/親水性分析

        分析MeSAD蛋白的疏水性/親水性可知(圖2A),第132位纈氨酸(Val)以及第265位的組氨酸(His)分別具有最高得分(2.522)和最低得分(-2.478),平均疏水指數(shù)為-0.443。即該蛋白質(zhì)屬于親水性蛋白。

        2.4 亞細(xì)胞定位和跨膜區(qū)分析

        分析MeSAD蛋白的亞細(xì)胞定位可知,葉綠體的積分值最大(9.28)(表1);分析圖2B可知,該蛋白無(wú)跨膜區(qū)域。

        2.5 磷酸化位點(diǎn)與信號(hào)肽分析

        分析MeSAD蛋白潛在的磷酸化位點(diǎn)可知(圖3A),絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點(diǎn)數(shù)目分別是19、13、5。信號(hào)肽分析可知(圖3B),該蛋白質(zhì)無(wú)信號(hào)肽。

        氨基酸位點(diǎn)

        氨基酸位點(diǎn)圖2 (A) MeSAD蛋白疏水性/親水性預(yù)測(cè)、(B)跨膜區(qū)域的預(yù)測(cè)

        表1 MeSAD蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

        氨基酸位點(diǎn)

        氨基酸位點(diǎn)圖3 (A) MeSAD蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)、(B) 信號(hào)肽預(yù)測(cè)

        2.6 二級(jí)及高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

        分析MeSAD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)可知,多肽鏈結(jié)構(gòu)中含有α螺旋(53.28%)、無(wú)規(guī)則卷曲序列(34.09%)、延伸鏈(7.58%)和β轉(zhuǎn)角(5.05%)等(圖4A)。選擇“2j2f.pdb”模板,采用SWISS-MODEL在線軟件進(jìn)行高級(jí)結(jié)構(gòu)分析,其氨基酸序列一致性為60%,覆蓋度為92%,SAD主要由α螺旋以及無(wú)規(guī)則卷曲序列構(gòu)成;使用VMD 1.9.3軟件繪制高級(jí)結(jié)構(gòu)(圖4B)。

        圖4 (A) MeSAD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、(B)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

        2.7 氨基酸同源性分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

        在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行MeSAD和其他植物的SAD氨基酸同源序列比對(duì),木薯與蓖麻(RicinuscommunisNP_001310659.1)、巴西橡膠樹(shù)(HeveabrasiliensisXP_021688869.1)、麻瘋樹(shù)(JatrophacurcasKDP44234.1)、可可(TheobromacacaoEOY04657.1)、臍橙(CitrussinensisXP_006494043.1)、溫州蜜柑(CitrusunshiuGAY44796.1)、克萊門(mén)柚(CitrusclementinaXP_006442769.1)序列一致性分別為95.71%,95.96%,95.20%,92.68%,90.66%,90.66%,90.66%。多重比對(duì)發(fā)現(xiàn),以上物種的SAD具有很高的同源性,并且1~40序列部分同源,40~396序列高度同源(圖5A)。利用NCBI的CDD在線工具分析可知(圖5B),SAD屬于類(lèi)鐵蛋白家族,具有?;?ACP脫氫酶結(jié)構(gòu)域(3~396),主要包括6個(gè)二鐵結(jié)合位點(diǎn)、33個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)以及14個(gè)底物結(jié)合口袋位點(diǎn)。

        為探究SAD基因的進(jìn)化特征,本研究基于SAD蛋白一級(jí)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建,結(jié)果表明,SAD基因的進(jìn)化和所選物種的進(jìn)化是一致的(圖5C)。木薯與蓖麻、巴西橡膠樹(shù)處于同一分支,這3種植物同屬于大戟科;樹(shù)棉(Gossypiumarboreum)、海島棉(Gossypiumbarbadense)和陸地棉(Gossypiumhirsutum)處于同一分支,這3種植物同屬于錦葵科;甜瓜(Cucumismelo)、南瓜(Cucurbitamoschata)和筍瓜(Cucurbitamaxima)同屬于葫蘆科,聚在另一分支;大豆(Glycinemax)、木豆(Cajanuscajan)和水黃皮(Pongamiapinnata)同屬于豆科,亦聚在另一分支。這與它們?cè)谥参镞M(jìn)化系統(tǒng)所處位置完全吻合。

        圖5 (A)不同植物中SAD氨基酸序列多重比對(duì)、保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)以及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

        3 討論

        SAD基因在植物響應(yīng)低溫脅迫中起到至關(guān)重要的作用[17]。迄今為止,SAD蛋白是植物中唯一發(fā)現(xiàn)的脂質(zhì)去飽和酶,SAD催化硬脂肪酸脫氫生成油酸,油酸被運(yùn)輸至類(lèi)囊體或細(xì)胞質(zhì)進(jìn)一步去飽和,以此提高其抗寒水平[17]。關(guān)于SAD基因的脂質(zhì)去飽和化研究現(xiàn)已成為生物化學(xué)及分子生物學(xué)的科研熱點(diǎn),克隆SAD基因具有十分重要的意義[18]。

        以往研究表明,SAD蛋白是植物中較為保守的一類(lèi)蛋白,具有典型的同型二聚體結(jié)構(gòu)以及4個(gè)α螺旋與Fe2+結(jié)合構(gòu)成的活性中心[19-21],本研究發(fā)現(xiàn)木薯的預(yù)測(cè)蛋白中具有這類(lèi)典型的結(jié)構(gòu)。SAD蛋白主要是靠三級(jí)結(jié)構(gòu)的Fe2+活性中心來(lái)行使功能[22-24],這說(shuō)明木薯預(yù)測(cè)蛋白具有SAD的功能。

        在GENEBANK數(shù)據(jù)庫(kù)中,SAD蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)果有兩個(gè),登錄號(hào)分別為XP_021610569和XP_021628521。這兩條序列是通過(guò)二代基因組測(cè)序預(yù)測(cè)而來(lái)的,成本高昂,并耗費(fèi)大量的人力和物力。本研究所預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)序列是基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的EST序列拼接的,零成本地預(yù)測(cè)SAD蛋白序列。經(jīng)過(guò)與GENEBANK數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列相比,和其一致性分別為98%和95%,這表明電子克隆可經(jīng)濟(jì)有效地預(yù)測(cè)基因序列。

        本研究利用電子克隆技術(shù)克隆木薯SAD基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,具有一定的科學(xué)意義。本研究的結(jié)果擬為木薯基因克隆、表達(dá)及干擾載體構(gòu)建提供參考,并為木薯SAD轉(zhuǎn)基因研究、抗寒機(jī)理闡述以及品種改良奠定基礎(chǔ)。

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