龐彩蓮，劉敏娟，林景濤，陳凱妮，黃嘉瑩，吳品，周正維，許艷茹

東莞市大朗醫(yī)院檢驗科，廣東 東莞 523770

銅綠假單胞菌(PAE)是臨床上常見非發(fā)酵病原菌，也是當前多重耐藥菌較為難治的病原菌之一，近年來由于亞胺培南等碳青霉烯類抗生素的廣泛應用，PAE產生了碳青霉烯酶，給臨床抗感染治療造成極大困難[1]。本研究收集東莞地區(qū)感染標本中分離的耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌(CRPA)進行耐藥分析及碳青霉烯酶表型檢測，為臨床合理用藥及治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 收集2018年1月至2021年6月東莞地區(qū)二、三級綜合性醫(yī)院在臨床標本中分離的CRPA共216株，其中痰標本139株，腹腔膿液17株，肺泡灌洗液30株，傷口分泌物12株，尿液10株，胸水3株，血液5株，收集菌株為患者的第一株菌株，剔除重復株。

1.2 試劑和設備 血平板、麥康凱平板、M-H瓊脂平板、OXOID藥敏紙片(江門凱林有限公司)，VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定儀、比濁儀、GN鑒定卡、GN09藥敏卡等法國生物梅里埃原裝配套產品(廣州華鑫公司)，亞胺培南緩沖液(上?？圃瓕崢I(yè)發(fā)展有限公司)。

1.3 質控菌株 大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853均來自廣東省臨床檢驗中心。

1.4 菌株鑒定及藥敏試驗 取已分純新鮮培養(yǎng)的平板上細菌，用無菌生理鹽水調整菌懸液濃度至0.5個麥氏單位，使用法國生物梅里埃公司VITEK 2-Compact全自動微生物鑒定儀和GN卡、GN09卡進行菌株鑒定及藥敏試驗。

1.5 PAE產碳青霉烯酶及其表型檢測 采用2017年CLSI推薦的eCIM試驗檢測CRPA是否產碳青霉烯酶[2-3]。取10μL純菌落于2 mL胰蛋白胨大豆(TSB)肉湯中，放入含10μg美羅培南的無菌紙片，35℃孵育4 h±15 min，制備0.5麥氏濁度的大腸埃希ATCC25922菌懸液，將美羅培南紙片從TSB肉湯中取出，貼于已涂布有大腸埃希菌ATCC25922的MH瓊脂(MHA)平板上，35℃孵育過夜后，量取抑菌圈直徑，美羅培南抑菌圈直徑為6～15 mm或直徑為16～18 mm但抑菌圈內有散在菌落，判斷碳青霉烯酶陽性。碳青霉烯酶表型檢測[4]：采用紙片擴散法，嚴格按照藥物敏感性實驗流程及廠家說明書上操作，制備細菌懸液濃度為0.5麥氏單位，均勻涂布于MHA平板上，張貼4張亞胺培南(10μg/片)藥敏紙片，紙片中心距離≥25 mm，在其中三張紙片上分別滴加10μL EDTA溶液(0.5 mol/L)、10μL 3-氨基苯硼酸溶液(40 mg/mL)、10μL EDTA溶液(0.5 mol/L)+10μL 3-氨基苯硼酸溶液(40 mg/mL)，35℃培養(yǎng)過夜后判讀結果。判定指標為若含EDTA溶液抑制劑的亞胺培南抑菌圈直徑與單藥相差≥5 mm以上，則可判斷該菌株產生金屬β內酰胺酶，若含3-氨基苯硼酸抑制劑的亞胺培南抑菌圈直徑與單藥相差≥5 mm以上，則可判斷該菌株產絲氨酸酶。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用WHONET5.6和SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 菌株來源 216株CRPA菌株標本分布以痰標本為主，其中以痰液和肺泡灌洗液最多13.89%，見表1。

表1 216株CRPA菌株標本來源分布及構成比

2.2 CRPA產碳青霉烯酶檢測結果 216株CRPA中產碳青霉烯酶83株，占38.4%(83/216)，其中產絲氨酸酶38株，占17.6%(38/216)，產金屬酶30株，占13.9%(30/216)，同時產絲氨酸酶+金屬酶15株，占6.9%(15/216)，不產碳青霉烯酶133株，占61.6%(133/216)。

2.3 CRPA的藥敏結果 216株CRPA的藥敏結果顯示，亞胺培南和美羅培南耐藥率分別為96.1%和72.6%，氨曲南耐藥率為50.9%，其他藥物耐藥率均在40%以下，見表2。

表2 216株CRPA的藥敏結果(%)

3 討論

碳青霉烯類抗生素是目前臨床上常用且有效的抗銅綠假單胞菌藥物，耐藥率也在不斷上升。很多報道PAE耐藥率上升與產酶有關[5-6]；朱蓓偉等[7]還報道，PAE的耐藥機制主要為外膜蛋白Opr-D2缺失和產SPM型金屬酶。東莞地區(qū)216株CRPA碳青霉烯酶表型檢測結果顯示，產碳青霉烯酶共83株，占38.4%，其中產絲氨酸酶38株，占17.6%，產金屬酶(MBLs)30株，占13.9%，同時產絲氨酸酶+金屬酶15株，占6.9%，不產碳青霉烯酶133株，占61.6%。因此，本實驗中產MBLs只是PAE對碳青霉烯類耐藥的機制之一，不是對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機制，與劉濤等[8]報道相似。這可能是因為PAE固有耐藥性、外膜蛋白Opr-D2缺失、非特異外排泵高表達作用、外膜通透性降低等導致細菌耐藥；其次，不合理抗菌藥物使用包括臨床抗菌藥物濫用、患者未遵從醫(yī)囑或未按療程規(guī)范使用抗菌藥物，以及在農牧業(yè)和魚類飼養(yǎng)過程中大量使含有抗菌藥物飼料等情況；醫(yī)療機構感染預防與控制措施不當，導致交叉?zhèn)鞑?，產生更多的耐藥菌株[9]。

本研究中，菌株來源分布主要以痰標本為主，占64.35%，其次為肺泡灌洗液和傷口分泌物，無菌體液如胸水和血液比例相對較低。216株CRPA的藥敏結果顯示，亞胺培南和美羅培南耐藥率分別為96.1%和72.6%，耐藥率在50%～70%的有氨曲南，耐藥率在30%～50%的有哌拉西林、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶、環(huán)丙沙星，耐藥率在30%以下的有哌拉西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、阿米卡星、妥布霉素、慶大霉素、左旋氧氧沙星。與曾婷等[10]報道的除哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率最低為50.53%外、其他的耐藥率均≥60%有差異。在CRPA中敏感性最好的是氨基糖苷類和阿米卡星，其次為慶大霉素和妥布霉素，敏感性均為75%以上，與王瓊瓊等[11]、張艷芳等[12]報道相近，因此，在用藥時首選耐藥率在30%以下的藥物。

據(jù)萬永艷[13]報道，碳青霉烯類抗菌藥物的使用量與PAE對美羅培南、亞胺培南的耐藥率呈正相關。因此，臨床應綜合考慮感染菌的耐藥表型和藥敏結果，合理選擇抗菌藥物，強化碳青酶烯類抗菌藥物臨床應用的監(jiān)督管理[14]，對MBLs陽性的感染菌，即使亞胺培南體外藥敏結果敏感，臨床也應慎用，對碳青霉烯類耐藥將意味著同時對多種抗菌藥物耐藥。

(志謝：東莞市人民醫(yī)院、東華醫(yī)院及兄弟單位提供菌株。)