孫雙權(quán)，陳立新，唐春華，李慧，楊誼

上海市松江區(qū)中心醫(yī)院泌尿外科，上海 201600

膀胱癌是人類(lèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，對(duì)患者的生理、心理及社會(huì)生活質(zhì)量均造成了嚴(yán)重的不利影響[1]。約75%的膀胱尿路上皮癌患者表現(xiàn)為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，25%的患者表現(xiàn)為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌。對(duì)于非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者，手術(shù)切除術(shù)后常規(guī)行膀胱灌注治療，但效果并不理想。臨床上迫切需要更為有效的治療方法來(lái)降低非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌患者的手術(shù)后復(fù)發(fā)率。目前新的研究方向包括免疫抑制治療，針對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNAs、micro RNAs或腫瘤干細(xì)胞的靶向治療方法等[2]。

微小核糖核酸(MicroRNA)是由19～25個(gè)核苷酸組成的非編碼的單鏈RNA，其與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷移及凋亡密切相關(guān)。通過(guò)與mRNA的3'UTR結(jié)合，miRNA可以導(dǎo)致翻譯抑制或mRNA降解。單個(gè)miRNA可以靶向多個(gè)mRNAs，而單個(gè)mRNA的3'UTR也可能包含多個(gè)miRNAs的識(shí)別信號(hào)。microRNA-222(miR-222)屬于miR-221/222家族。研究發(fā)現(xiàn)，miR-222在膀胱癌組織中的表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的癌旁組織，其高表達(dá)與腫瘤分級(jí)和分期顯著相關(guān)[3]，而且miR-222的過(guò)度表達(dá)對(duì)TaT1期患者的短期復(fù)發(fā)和進(jìn)展有較好的陽(yáng)性預(yù)測(cè)價(jià)值[4]，其有可能成為一種膀胱癌早期發(fā)現(xiàn)進(jìn)展或復(fù)發(fā)的隨訪標(biāo)記物，甚至是治療膀胱癌患者的有用靶點(diǎn)[5]。

CDKN1B基因編碼一種細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶抑制劑(p27)，與CDK抑制劑CDKN1A/P21具有相似性，其參與了多種腫瘤的發(fā)生過(guò)程。CALLEGARI等[6]通過(guò)免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，在鼠肝癌模型中，miR-221的表達(dá)上調(diào)同時(shí)伴隨有CDKN1B/p27和CDKN1C/p57表達(dá)的顯著抑制。在很多人類(lèi)的癌細(xì)胞中，miR221/222可能通過(guò)靶向調(diào)控CDKN1B的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，包括胰腺癌、肝癌及非小細(xì)胞肺癌[7-9]。本研究定量檢測(cè)了膀胱尿路上皮癌組織及癌旁組織中miR-222及CDKN1B(p27)的表達(dá)差異，觀察miR-222對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的影響，并對(duì)miR-222的可能靶點(diǎn)CDKN1B進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、臨床組織樣本 人膀胱癌細(xì)胞株T24購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)；收集2018年1月至2019年6月45例在上海市松江區(qū)中心醫(yī)院確診并行經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)的膀胱尿路上皮癌患者的膀胱癌組織標(biāo)本及配對(duì)癌旁組織。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書(shū)，標(biāo)本采用液氮保存。

1.1.2 儀器及實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清、雙抗、PBS緩沖液從美國(guó)GIBCO公司買(mǎi)入。CDKN1B抗體購(gòu)自Abcam公司，Lip2000試劑從美國(guó)Invitrogen公司購(gòu)買(mǎi)；MTT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱 基，miR-222 inhibitor NC、miR-222 inhibitor和miR-222 mimic均由上海吉瑪生物公司合成；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自Sigma公司，紫外分光光度計(jì)購(gòu)自Beckman公司，CFX384多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。TRIzol?Plus RNA Purification Kit(貨號(hào)：12183-555)購(gòu)自Invitrogen公司，RNase-Free DNase Set(貨號(hào)：79254)購(gòu)自Qiagen公司，Super-ScriptTMⅢReverse Transcriptase(貨號(hào)：18080085)購(gòu)自Thermo fisher公司和PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(貨號(hào)：A25779)購(gòu)自Applied Biosystems公司，引物miR-222和U6均由華大基因合成。

1.2 方法

1.2.1 Real time PCR檢測(cè)miR-222表達(dá)水平 總RNA抽提：取50 mg的樣本組織，加1 mL Trizol研磨勻漿，加1/2 Trizol體積的氯仿提取，并用異丙醇或純酒精沉淀RNA后用DEPC水溶解，用紫外分光光度計(jì)定量并檢測(cè)純度；PCR擴(kuò)增：取1μg RNA用Super-ScriptTMⅢReverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Green染料法進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)miR-222的相對(duì)表達(dá)量。逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物序列miR-222(基因序列號(hào)為MIMAT0004569)：ATTCGCACTGGATACGACGGTCAG；用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)PCR引 物，miR-222-F：CGCGCTCAGTAGCCAGTGTA，SNORD48(內(nèi)參)-F：GATGATGACCCCA-GGTAACTCT，反向通用引物micro-R為：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT。反應(yīng)體系為：在20μL的體系中加Power SYBR?Green Master Mix 10μL，10μmol/L Forward Primer 0.5μL，10μmol/L micro-R 0.5μL，SDW 8μL，CDNA 1.0μL，用DEPC水定容到總體積20μL。反應(yīng)條件：95℃，1 min，1個(gè)循環(huán)；95℃，15 s，60℃，25 s，40個(gè)循環(huán)，收集熒光在60℃處；55℃～95℃繪制溶解曲線。每個(gè)樣品重復(fù)三次，用2-ΔΔct法統(tǒng)計(jì)分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染膀胱癌T24細(xì)胞株 使用DME培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗，于5%CO2、37℃的無(wú)菌環(huán)境中常規(guī)培養(yǎng)。2～3 d換液一次，4～5 d傳代一次，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種鋪板在6孔板里面，24 h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：control組(空白膀胱癌T24細(xì)胞株)、miR-222 inhibitor NC組、miR-222 inhibitor組和miR-222 mimic組，共四組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將miR-222 inhibitor NC、miR-222 inhibitor和miR-222 mimic，按照15 nmol/mL加入到250μL培養(yǎng)液里面，同時(shí)取10μL Lip2000加入到250μL培養(yǎng)液里面，靜置5 min，前兩者混合在一起，miRNA溶液與脂質(zhì)體混和均勻，室溫靜置20 min，培養(yǎng)板上的細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)洗滌細(xì)胞1～2次。每孔細(xì)胞加500μL miRNA/脂質(zhì)體混合物，輕輕搖晃混勻后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6 h。取出培養(yǎng)板，小心吸去miRNA/脂質(zhì)體混合物，每孔加500μL新鮮的含血清DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后期檢測(cè)。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將上述處理完成的細(xì)胞，進(jìn)行胰酶消化，吹打變成單細(xì)胞懸液，按照每空1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，終體積為100μL，接種到96孔板內(nèi)，并且設(shè)置了空白孔，每組4重復(fù)，進(jìn)行培養(yǎng)1D、2D、3D后，加入20μL MTT(5 mg/mL)溶液，繼續(xù)孵育4 h，扔掉孔內(nèi)上清液，加入150μL DMSO，搖床震蕩培養(yǎng)直至結(jié)晶物溶解完成，酶標(biāo)儀挑取合成的程序，OD490nm讀值，最后用軟件制作生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑和Transwell小室置于37℃恒溫水浴箱溫育。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化細(xì)胞后用無(wú)血清培養(yǎng)基混勻細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，調(diào)整濃度為每毫升10個(gè)細(xì)胞。在下室(即24孔板底部)加入600μL含20%血清的培養(yǎng)液。上室加入單細(xì)胞懸液150μL，37℃、5%CO2飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用鑷子小心夾出小室，吸干上室液體，甲醇室溫固定30 min。取出小室，吸干上室固定液，結(jié)晶紫染液室溫染色15～30 min，PBS沖洗多次，用自制脫脂棉棒輕輕吸去上室殘留液體，并取掉底膜殘留細(xì)胞，完成后取出小室，底膜晾干，然后封片，顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)隨機(jī)細(xì)胞視野5個(gè)，SPSS統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 收集的細(xì)胞用PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取1×106萬(wàn)細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后丟掉上清液，加入500μL的Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕混勻細(xì)胞，再加入5μL Annexin V-FITC探針，輕輕混勻，25℃，避光孵育10 min。1 000 r/min離心5 min，丟掉上清，加入10μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.2.6 MiR-222與CDKN1B的結(jié)合關(guān)系測(cè)定 采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，利用生物信息預(yù)測(cè)網(wǎng)站(miRbase.org，Targetscan.org)預(yù)測(cè)miR-222與CDKN1B的結(jié)合片段。將擴(kuò)增的CDKN1B 3'-UTR序列插入到pMIR-Report Luciferase質(zhì)粒位點(diǎn)當(dāng)中，分別構(gòu)建pGL3-CDKN1B-3'UTR WT和pGL3-CDKN1B-3'UTR Mut的熒光素酶報(bào)告載體(pMIR-Report Luciferase)，將上述熒光素酶報(bào)告載體及突變載體與miR-222 NC、miR-222 mimic、miR-222 inhibitor共同轉(zhuǎn)染至T24細(xì)胞，Dual Luciferase報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性，分析miR-222與CDKN1B的結(jié)合關(guān)系。

1.2.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取適量細(xì)胞，用冰PBS洗滌3次。取適量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，比例為1：100，在冰上裂解20 min。11 000 r/min的速度離心10 min，取上清。測(cè)定和調(diào)節(jié)蛋白濃度，保持每孔的加樣量在30μg。將準(zhǔn)備好的樣品和蛋白質(zhì)marker(10～180 kD)，分別上樣電泳直至電泳完全。然后將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)至NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入稀釋好的一抗抗體，4℃過(guò)夜。二抗室溫1 h振蕩孵育，最后ECL化學(xué)發(fā)光曝光顯色。

1.2.8 免疫組化染色 膀胱癌及癌旁組織固定、脫水、包埋、切片，除去內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶，抗原修復(fù)高壓鍋修復(fù)：立即投入檸檬酸緩沖液，等到沸騰，浮子升起，計(jì)時(shí)2 min，自然冷卻至室溫；血清封閉、加入稀釋好的一抗抗體，4℃過(guò)夜。二抗室溫1 h振蕩孵育。加DAB顯色劑，蘇木素復(fù)染后，封片、顯微鏡下拍照，數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 每組實(shí)驗(yàn)均安排重復(fù)三次，采用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用Dunnet-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-222在膀胱癌和癌旁組織中的表達(dá)差異 45例手術(shù)后病理證實(shí)為膀胱尿路上皮癌的標(biāo)本經(jīng)Real time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：膀胱癌組織組miR-222基因表達(dá)量為2.31±0.27，癌旁組織組miR-222基因表達(dá)量為0.92±0.04，膀胱癌組織miR-222基因表達(dá)量約為癌旁組織的2.2倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.481，P<0.05)。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 為了研究miR-222對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖的影響，將miR-222模擬物(miR-222 mimic)、抑制劑(miR-222 inhibitor)及其陰性對(duì)照物(miR-222 inhibitor NC)轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞，從以下生長(zhǎng)曲線可以看出，control組與miR-222 inhibitor NC組生長(zhǎng)基本持平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但miR-222 inhibitor組和miR-222 mimic組顯示出明顯的生長(zhǎng)差異，miR-222 inhibitor組明顯低于其余組，而miR-222 mimic組明顯高于miR-222 inhibitor組和其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 各組T24細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

2.3 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-222 mimic組的細(xì)胞遷移數(shù)量為(220±26)個(gè)，明顯多于miR-222 inhibitor組的(90±15)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.263，P<0.01)，control組細(xì)胞遷移數(shù)量多于miR-222 inhibitor組，但是低于miR-222 mimic組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2和圖3。

圖2 不同處理組細(xì)胞的遷移數(shù)量(×100)

圖3 各組T24細(xì)胞的遷移數(shù)量結(jié)果

2.4 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果 流式結(jié)果顯示，miR-222 mimic組的凋亡率明顯低于抑制了miR-222表達(dá)的miR-222 inhibitor組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，也低于正常的control組和miR-222 inhibitor NC組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4和圖5。

圖4 各組T24細(xì)胞流式凋亡圖片

圖5 各組T24細(xì)胞流式凋亡結(jié)果比較

2.5 MiR-222與CDKN1B的結(jié)合關(guān)系測(cè)定及Western blot分析 采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到miR-222與CDKN1B mRNA 3'UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖6A；熒光素酶活性報(bào)告分析顯示，與miR-222 NC組相比，miR-222組WT細(xì)胞的熒光活性表達(dá)量顯著降低，MUT細(xì)胞的熒光活性表達(dá)量不受影響，見(jiàn)圖6B；Western blot結(jié)果顯示：與control組相比，miR-222 mimic組T24細(xì)胞中CDKN1B(p27)蛋白表達(dá)量顯著降低，與miR-222 inhibitor NC組相比，miR-222 inhibitor組T24細(xì)胞中CDKN1B(p27)蛋白表達(dá)量明顯升高，見(jiàn)圖6C、6D，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6 組織免疫組化染色結(jié)果 為了證明CDKN1B(p27)蛋白在細(xì)胞中的分布與表達(dá)差異，對(duì)膀胱癌組織和癌旁組織進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示：CDKN1B(p27)蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性染色為棕黃色。結(jié)果表明，與癌旁組織相比，CDKN1B(p27)蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖7和圖8。

圖8 膀胱癌和癌旁組織中的CDKN1B(p27)蛋白的表達(dá)量

3 討論

膀胱腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多基因調(diào)控過(guò)程。miRNA通過(guò)誘導(dǎo)降解或阻斷翻譯來(lái)抑制基因表達(dá)，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。miR-221與miR-222在結(jié)構(gòu)和功能上具有較大的相似性，在多種人類(lèi)腫瘤中發(fā)揮了重要作用，如膀胱癌、前列腺癌、胃癌及甲狀腺癌等[10-13]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-222在膀胱腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的非癌組織[14]，高級(jí)別尿路上皮癌比低級(jí)別尿路上皮癌組織中miR-222水平高，肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(T2-T4)比淺表性膀胱癌(TaT1)組織中miR-222水平高,過(guò)度表達(dá)miR-222的患者在治療后短期復(fù)發(fā)和進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)更大[4]。本實(shí)驗(yàn)用熒光定量PCR法檢測(cè)了miR-222在膀胱癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異，結(jié)果表明，miR-222在膀胱癌組織中的表達(dá)遠(yuǎn)高于癌旁組織中的表達(dá)。在體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染miR-222 mimic使miR-222在膀胱癌T24細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)可使細(xì)胞增殖及遷移能力增強(qiáng)，并抑制癌細(xì)胞的凋亡，而下調(diào)miR-222則明顯降低了膀胱癌T24細(xì)胞增殖和遷移能力，促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。這些研究表明，在體外，miR-222具有促進(jìn)膀胱癌發(fā)生發(fā)展的作用。

細(xì)胞周期的進(jìn)展需要細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶(CDK)的特異性激活。CDK抑制因子包括兩個(gè)家族：CDK4家族和CIP/KIP家族(激酶抑制蛋白)，后者包括p21、p27(CDKN1B)和p57。CDKN1B基因定位于12號(hào)染色體短臂，編碼p27蛋白。p27是由198個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，是一種關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，可以通過(guò)其N(xiāo)末端結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞周期蛋白和CDK亞單位相互作用來(lái)抑制細(xì)胞周期蛋白D、E和B-CDK復(fù)合物的催化活性，參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡[15-16]。p27增加2～3倍可以完全抑制G1～S期細(xì)胞周期蛋白CDK，阻止細(xì)胞周期從G期進(jìn)展到S期。CDKN1B(p27)在表達(dá)水平和亞細(xì)胞定位上都受到調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，CDKN1B參與了許多腫瘤的發(fā)生過(guò)程，如多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腫瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病、黑色素瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等[17]，其表達(dá)的缺失或下降與許多腫瘤的侵襲行為有關(guān)，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌及肺癌等[18]。在本研究中，通過(guò)膀胱癌組織和癌旁組織免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，CDKN1B(p27)在膀胱癌組織中的表達(dá)與癌旁組織相比顯著降低，證實(shí)CDKN1B參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。目前的研究表明，多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與調(diào)控CDKN1B的表達(dá)和分布。PI3K-AKT途徑通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控CDKN1B蛋白的表達(dá)，而泛素-蛋白酶體水解是CDKN1B轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的主要途徑，Ras-MAKP通路是參與這一過(guò)程最可能的信號(hào)通路。CDKN1B還與許多細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的分子存在相互作用，如Ras、Spy1、SKP2及CRM1等。

很多腫瘤抑制因子是miR-221和miR-222在癌癥中的靶點(diǎn)，包括細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑CDKN1B/p27和CDKN1C/p57[19]，14磷酸肌醇3激酶途徑磷酸酶和張力蛋白同系物(PTEN)的抑制劑、促凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤2-修飾因子(BMF)等。在肝癌細(xì)胞中，miR-221和miR-222的可能作用靶點(diǎn)包括p27、p57、BBC3及TIMP3等[20]。在高侵襲性胰腺導(dǎo)管腺癌中，miR-222的表達(dá)明顯增高，其可以通過(guò)抑制PPP2R2A激活A(yù)KT，促進(jìn)p27磷酸化，增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲和增殖能力[7]。在人類(lèi)卵巢癌細(xì)胞中，p27是miR-222的直接靶點(diǎn)，上調(diào)miR-222能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖[21]。研究發(fā)現(xiàn)，CDKN1B基因的3'UTR有兩個(gè)位點(diǎn)與miR-222種子序列相匹配，miR-222可能調(diào)節(jié)p27mRNA的翻譯及蛋白質(zhì)表達(dá)水平，但并不影響mRNA的水平，僅在CDKN1B3'UTR的一個(gè)靶位點(diǎn)中修飾不足以阻斷miR-222的功能。在本研究中，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)分析表明，在膀胱癌T24細(xì)胞中，CDKN1B可能是miR-222的直接靶點(diǎn)之一，miR-222對(duì)其具有負(fù)向調(diào)控的作用,導(dǎo)致p27表達(dá)下降，細(xì)胞周期進(jìn)展，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移。Western blot分析也進(jìn)一步證實(shí)，與對(duì)照組相比，增加miR-222的表達(dá)能明顯抑制p27的表達(dá)，而抑制miR-222的表達(dá)則能明顯增加p27的表達(dá)。但是，p27可能并不是miR-222的唯一靶點(diǎn)，其也可以通過(guò)靶向編碼p27蛋白降解的基因來(lái)間接參與p27蛋白水平的調(diào)節(jié)，其具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步深入的研究。

總之，本研究證實(shí)了miR-222在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，下調(diào)miR-222可以明顯抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，并且促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的凋亡；miR-222可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控抑癌基因CDKN1B表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用，其可能作為膀胱癌檢測(cè)與治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。