尹元元，耿燕娜，范明松

·藥劑與工藝·

Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化延胡索乙素聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米粒處方和體外釋藥行為研究

尹元元1，耿燕娜1，范明松2*

1.河南大學(xué)淮河醫(yī)院，河南 開封 475000 2.上海雷允上藥業(yè)有限公司技術(shù)中心，上海 201401

Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法（Box-Behnken design-response surface method，BBD-RSM）優(yōu)化延胡索乙素（THP）聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA］納米粒（THP-PLGA-NPs）處方，并進(jìn)行體外評價(jià)。納米沉淀法制備THP-PLGA-NPs，以包封率、載藥量、多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）和粒徑大小為評價(jià)指標(biāo)，單因素結(jié)合BBD-RSM篩選最優(yōu)處方，采用甘露醇作為凍干保護(hù)劑制備成凍干粉，將最優(yōu)處方進(jìn)行表征及體外釋放實(shí)驗(yàn)。最佳處方為PLGA用量為491.8 mg、油水體積比1∶5.2、乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.12%。THP-PLGA-NPS包封率為（185.07±1.06）%，載藥量為（4.73±0.21）%，粒徑為（181.32±7.14）nm，分別與模型預(yù)測值接近。體外釋藥具有明顯的緩釋特征，釋藥過程符合Higuchi模型：M/M＝0.112 41/2＋0.078 0，＝0.987 9。Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可用于THP-PLGA-NPS處方的篩選，且優(yōu)化后的納米粒具有緩釋作用。

延胡索乙素；PLGA納米粒；納米沉淀法；處方優(yōu)化；Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法；緩釋特征；體外釋放

延胡索乙素（tetrahydropalmatine，THP）是一種異喹啉類生物堿，主要從罌粟科紫堇屬植物延胡索W.T.Wang提取得到[1]。研究發(fā)現(xiàn)，THP具有抗腫瘤、降血壓、抗心律失常、鎮(zhèn)痛、神經(jīng)保護(hù)、抗焦慮等多種藥理活性[2-4]。但THP體內(nèi)穩(wěn)定差[5]，不易溶于水[6]，體外溶出受限，生物利用度低[5]。而且THP具有一定的急性毒性[7]，安全性存在一定隱患，故傳統(tǒng)制劑不利于THP發(fā)揮藥效，在臨床上的應(yīng)用受到較大限制。

納米給藥系統(tǒng)可改善難溶性藥物的溶解度和溶出度，提高藥物的生物利用度，提高靶向性及藥效，降低毒副作用等，因而在醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域頗受專家學(xué)者關(guān)注[8]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly(lactic-co- glycolic acid)，PLGA］是一種安全、無毒且可生物降解的納米載體，最終產(chǎn)物是二氧化碳和水[9-10]，已被美國FDA批準(zhǔn)用于臨床研究，國內(nèi)外研究者采用PLGA制備納米粒的研究越來越多[11-14]，有效提高了生物利用度及藥效。Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法（Box-Behnken design-response surface method，BBD-RSM）是常用的處方優(yōu)化方法，具有精確度高、預(yù)測性強(qiáng)等特點(diǎn)[15-16]。

因此，本研究采用BBD-RSM對THP-PLGA納米粒（THP-PLGA-NPs）處方進(jìn)行研究，在單因素考察的基礎(chǔ)上，選擇PLGA用量、油水體積比和乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別作為自變量，選擇包封率、載藥量和粒徑大小分別作為因變量，期望得到具有理想包封率、載藥量和粒徑的THP-PLGA-NPs處方。進(jìn)一步制備成凍干粉，考察穩(wěn)定性及體外釋藥情況，期望通過本研究為THP納米制劑研發(fā)提供參考，也為后續(xù)體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)等評價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1260型高效液相色譜儀（HPLC），配置DAD檢測器，Agilent公司；QUINTIX125D-1CN型電子天平，賽多利斯儀器公司；ZNCL-S-5D型多點(diǎn)數(shù)顯磁力攪拌器，上海越眾儀器設(shè)備有限公司；RC-6D型溶出儀，天津創(chuàng)興電子設(shè)備制造股份有限公司；DW-86L388J型超低溫冰箱，深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司；12V20AH型超聲儀，蘇州東風(fēng)亞森新能源科技有限公司；Master-sizer型粒度分析儀，馬爾文儀器公司；JSM-IT500型掃描電子顯微鏡（SEM），日本電子株式會(huì)社；CTFD-12P型真空凍干機(jī)，深圳市科力易翔儀器設(shè)備有限公司；GXF-03A型氣動(dòng)安瓿軋蓋機(jī)，廣州冠鑫輕工機(jī)械制造有限公司。

THP對照品，批號(hào)110726-202020，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.3%，中國食品藥品檢定研究院；THP原料藥，批號(hào)200216，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，成都嘉葉生物科技有限公司；聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA），75∶25，相對分子質(zhì)量為15 000～20 000，德國Evonik Industries公司；甘露醇（批號(hào)20191105）、蔗糖（批號(hào)20200302）、乳糖（批號(hào)20190915），上?？道噬锟萍加邢薰?；泊洛沙姆188，批號(hào)WPEE587E，德國巴斯夫有限公司；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Thermo-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；流動(dòng)相為甲醇-0.1%乙酸水溶液（稀三乙胺調(diào)pH值至5.8左右）（60∶40）；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；檢測波長為281 nm；進(jìn)樣體積為10 μL。THP在8.2 min左右出峰，理論塔板數(shù)以THP計(jì)不低于8500，色譜圖見圖1。

圖1 THP對照品(A) 和THP-PLGA-NPs樣品(B)、空白(C) 的HPLC圖

2.1.2 供試品溶液的配制 精密量取1 mL的THP- PLGA-NPs混懸液至50 mL量瓶中，加入10 mL丙酮，超聲5 min以破壞THP-PLGA-NPs，放置至室溫，甲醇定容至刻度線，即得THP-PLGA-NPs供試品溶液?？瞻譖LGA納米粒供試品溶液同法制備。

2.1.3 對照品儲(chǔ)備液的配制及線性關(guān)系考察 精密稱取THP對照品10 mg溶于100 mL甲醇，得質(zhì)量濃度為100 μg/mL的THP對照品儲(chǔ)備液。流動(dòng)相作為稀釋液，分別配制質(zhì)量濃度為20.00、10.00、5.00、0.50、0.10、0.05 μg/mL的THP對照品溶液，分別進(jìn)樣，測定各個(gè)質(zhì)量濃度的峰面積。以THP質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），得線性回歸方程＝18.157 4－0.523 8，＝0.999 9，因此THP在0.05～20.00 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為0.05、5.00、20.00 μg/mL的THP對照品溶液，分別進(jìn)HPLC測定6次，計(jì)算得THP峰面積的RSD值分別為0.56%、0.34%、0.32%，可見儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取THP-PLGA-NPs供試品溶液，于0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣測定THP，計(jì)算得THP峰面積的RSD值為0.73%，所以供試品溶液在24 h穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取THP-PLGA-NPs混懸液，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測定THP，計(jì)算得THP質(zhì)量濃度的RSD值為1.63%，所以重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 取9份0.5 mL的THP- PLGA-NPs混懸液，分為3組，每組各3份，分別加入100 μg/mL THP對照品貯備液1.5、3.0、4.5 mL。按照“2.1.2”項(xiàng)下方法操作，分別制備THP-PLGA- NPs供試品溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算THP含量及回收率。結(jié)果顯示，THP的平均加樣回收率為100.26%，RSD為1.84%，可見回收率較高。

2.2 THP-PLGA-NPs的制備[11]

沉淀法制備THP-PLGA-NPs。取30 mg的THP和適量的PLGA溶于20 mL有機(jī)溶劑中，超聲溶解得有機(jī)相。配制一定體積、一定濃度的穩(wěn)定劑水溶液作為水相。將有機(jī)相用注射器逐滴滴加至水相中，滴畢后于一定功率下超聲（工作2 s，間隔1 s）。減壓旋蒸除盡有機(jī)溶劑，過0.45 μm微孔濾膜，即得THP-PLGA-NPs混懸液。

空白PLGA-NPs除不加THP外同法制備。

2.3 包封率、載藥量、粒徑及Zeta電位的測定

取1 mL的THP-PLGA-NPs混懸液至離心管中，于溫度為4 ℃的條件下12 000 r/min高速離心30 min，取續(xù)濾液測定游離THP質(zhì)量濃度，計(jì)算含量（游離）。精密量1 mL THP-PLGA-NPs至50 mL量瓶，加入10 mL丙酮，超聲5 min破壞THP-PLGA- NPs，放置至室溫，甲醇定容至刻度線，進(jìn)樣測定THP質(zhì)量濃度，計(jì)算THP總含量（總）。取1 mL的THP-PLGA-NPs混懸液于?60 ℃預(yù)凍2 d后低溫凍干，稱質(zhì)量（0）。按下式計(jì)算THP-PLGA-NPs的包封率和載藥量。

包封率＝(總－游離)/總

載藥量＝(總－游離)/0

取THP-PLGA-NPs混懸液0.1 mL，加入蒸餾水4 mL混勻，取適量置于比色皿中，于粒度分析儀上測定THP-PLGA-NPs的粒徑、PDI和Zeta電位。

2.4 THP-PLGA-NPs單因素考察

2.4.1 有機(jī)溶劑種類的考察 固定THP用量為30 mg，PLGA用量為500 mg，泊洛沙姆188質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%，油水體積比為1∶5，超聲功率為250 W，超聲時(shí)間為10 min，減壓旋蒸為3 h的條件下，分別考察丙酮、二氯甲烷和兩者等量混合溶劑作為有機(jī)溶劑時(shí)對THP-PLGA-NPs包封率、載藥量、粒徑、PDI和Zeta電位的影響，結(jié)果見表1。不同溶劑對THP-PLGA-NPs包封率、載藥量和粒徑等有較大的影響，二氯甲烷的包封率和載藥量高于丙酮，可能是由于二氯甲烷脫除速率較快，降低了藥物進(jìn)入水相幾率，有利于PLGA材料包裹藥物。而采用丙酮和二氯甲烷混合溶劑制備的THP-PLGA-NPs包封率和載藥量相對更高，且粒徑、PDI相對較小，Zeta電位絕對值相對較大，故選擇丙酮和二氯甲烷等量混合溶劑來制備THP-PLGA-NPs。

2.4.2 PLGA用量的考察 固定THP用量為30 mg，有機(jī)溶劑為丙酮和二氯甲烷等量混合溶劑，泊洛沙姆188質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%，油水體積比為1∶5，超聲功率為250 W，超聲時(shí)間為10 min，減壓旋蒸為3 h的條件下，考察PLGA用量為400、450、500、550 mg時(shí)對THP-PLGA-NPs包封率、載藥量、粒徑、PDI和Zeta電位的影響，結(jié)果見表2。隨著PLGA用量的增加THP-PLGA-NPs粒徑呈增大趨勢，可能是由于PLGA用量的增加提高了體系的黏度所致。隨著PLGA用量的增加，包封率總體呈增加趨勢，但增加到一定程度后載藥量下降明顯。當(dāng)PLGA用量為500 mg左右時(shí)THP-PLGA-NPs的各個(gè)指標(biāo)均較好，但需要進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

表1 有機(jī)溶劑種類的考察(, n = 3)

2.4.3 油水體積比的考察 固定THP用量為30 mg，PLGA用量為500 mg，有機(jī)溶劑為丙酮和二氯甲烷等量混合溶劑，泊洛沙姆188質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%，超聲功率為250 W，超聲時(shí)間為10 min，減壓旋蒸為3 h的條件下，分別考察油水體積比為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6時(shí)對THP-PLGA-NPs包封率、載藥量、粒徑、PDI和Zeta電位的影響，結(jié)果見表3。隨著水相體積的增加，HP-PLGA納米粒的粒徑和PDI值呈減小趨勢。包封率和載藥量先增大后減小，可能是隨著水相體積的增大，在乳化劑增溶作用下使藥物進(jìn)入水相，影響了PLGA材料對藥物的包裹。綜合考慮，選擇油水體積比為1∶5左右繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

表2 PLGA用量的考察(, n = 3)

2.4.4 乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的考察 固定THP用量為30 mg，PLGA用量為500 mg，有機(jī)溶劑為丙酮和二氯甲烷等量混合溶劑，油水體積比為1∶5，超聲功率為250 W，超聲時(shí)間為10 min，減壓旋蒸為3 h的條件下，分別考察乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)對THP-PLGA-NPs包封率、載藥量、粒徑、PDI和Zeta電位的影響，結(jié)果見表4。隨著乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，包封率和載藥量均呈先增加后減少趨勢，而粒徑呈現(xiàn)變小后增大。這可能是當(dāng)乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)不足時(shí)影響乳化效果，導(dǎo)致PDI值較高，且Zeta電位絕對值也較低，但質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)則使藥物進(jìn)入水相，影響PLGA材料的包裹。隨著乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，油水界面張力下降，故形成納米粒粒徑較小，當(dāng)進(jìn)一步增加乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)體系的黏度也隨之上升，使形成納米粒的粒徑反而變大，PDI值也有變大趨勢。綜合考慮，需選擇乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%左右繼續(xù)進(jìn)行處方優(yōu)化。

2.4.5 超聲時(shí)間的影響 固定THP用量為30 mg，PLGA用量為500 mg有機(jī)溶劑為丙酮和二氯甲烷等量混合溶劑，油水體積比為1∶5，乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，超聲功率為250 W，減壓旋蒸為3 h條件下，分別考察超聲時(shí)間對THP-PLGA-NPs的影響，結(jié)果見表5。隨著超聲時(shí)間的增加，包封率、載藥量和Zeta電位絕對值均先增加后減小，可能是超聲時(shí)間過長時(shí)對PLGA納米粒有一定的破壞作用所致。粒徑和PDI值先變小后變大，可能是過長的超聲時(shí)間使納米粒重新聚集，導(dǎo)致平均粒徑變大，同時(shí)PDI值也上升。雖然超聲12 min具有較小的粒徑，但包封率和載藥量明顯低于超聲10 min時(shí)的包封率和載藥量，且超聲12 min時(shí)的PDI值也相對高。綜合考慮，故選擇超聲時(shí)間為10 min。

表3 油水體積比的考察(, n = 3)

表4 乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的考察(, n = 3)

2.4.6 超聲功率的影響 固定THP用量為30 mg，PLGA用量為500 mg，有機(jī)溶劑為丙酮和二氯甲烷等量混合溶劑，油水體積比為1∶5，乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，超聲時(shí)間為10 min，減壓旋蒸為3 h條件下，考察超聲功率對THP-PLGA-NPs包封率、載藥量、粒徑、PDI和Zeta電位的影響，結(jié)果見表6。超聲功率達(dá)到300 W時(shí)，THP-PLGA-NPs的封率和載藥量下降明顯，粒徑和PDI值變大趨勢明顯。功率為200 W時(shí)THP-PLGA-NPs包封率、載藥量相對最高，且粒徑和PDI值相對最小，故選擇超聲功率為200 W。

表5 超聲時(shí)間的考察(, n = 3)

2.4.7 減壓旋蒸時(shí)間的影響 固定THP用量為30 mg，PLGA用量為500 mg，有機(jī)溶劑為丙酮和二氯甲烷等量混合溶劑，油水體積比為1∶5，乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，超聲時(shí)間為10 min，超聲功率為200 W的條件下，考察減壓旋蒸時(shí)間對THP-PLGA- NPs包封率、載藥量、粒徑、PDI和Zeta電位的影響，結(jié)果見表7。減壓旋蒸時(shí)間過短時(shí)，可能是由于殘留的有機(jī)溶劑會(huì)破壞THP-PLGA-NPs，導(dǎo)致包封率、載藥量較低，但旋蒸時(shí)間過長時(shí)THP-PLGA-NPs可能會(huì)發(fā)生聚集，導(dǎo)致粒徑和PDI值變大。經(jīng)測定，旋蒸時(shí)間為3.5 h時(shí)有機(jī)溶劑基本被旋蒸除去，故選擇旋蒸時(shí)間為3.5 h。

表6 超聲功率的考察(, n = 3)

表7 減壓旋蒸時(shí)間的考察(, n = 3)

2.5 BBD-RSM優(yōu)化處方

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PLGA材料的用量、油水體積比和乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)（分別作為自變量1、2、3）對納米制劑的包封率、載藥量和粒徑大?。ǚ謩e作為響應(yīng)值1、2、3）影響較大，因此采用BBD-RSM對THP-PLGA-NPs處方進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，因素及水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表8。

將包封率、載藥量和粒徑歸一化處理得出總評歸一值（OD），并以O(shè)D值為BBD-RSM的響應(yīng)指標(biāo)。計(jì)算過程為①包封率（1）和載藥量（2）越大越好，max＝(M－min)/(max－min)；而粒徑（3）越小越好，min＝(max－M)/(max－min)，max和min分別為試驗(yàn)中最大值和最小值，M為試驗(yàn)中的測量值。②各指標(biāo)歸一值求算幾何平均數(shù)，得總評歸一值OD＝(12…d)1/k，為指標(biāo)數(shù)，結(jié)果見表8。

2.5.2 模型的擬合、效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測 采用Design Expert V8.0.6軟件進(jìn)行擬合，總評分OD值二次多元回歸方程為OD＝0.96－0.0201＋0.0172＋0.0673－0.02412＋0.3.16×10?313＋0.04023－0.27012－0.06122－0.61032。模型的值＜0.01，說明模型具有極顯著性意義，失擬項(xiàng)＝0.149 9＞0.05，說明未知因素對模型干擾很小。另外模型的2＝0.995 8，adj2＝0.990 4，說明模型與實(shí)際吻合度良好，因此可以采用此模型對THP-PLGA-NPs處方進(jìn)行研究，可信度較高。方差分析結(jié)果見表9，模型中3、23、12、22和32均顯著或極顯著（＜0.05、0.01）。

表8 BBD-RSM試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平及結(jié)果

固定PLGA材料的用量（1）、油水體積比（2）和乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)（3）因素中之一，得到另外2因素對OD值的三維曲面圖，結(jié)果見圖2。得到THP- PLGA-NPs最佳處方為PLGA用量為491.8 mg、油水體積比1∶5.2、乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.12%。在此條件下THP-PLGA-NPs包封率、載藥量和粒徑大小的預(yù)測值分別為85.95%、4.85%和176.46 nm。

2.6 工藝驗(yàn)證

分別測定3批THP-PLGA-NPs最佳處方的包封率、載藥量和粒徑，并與預(yù)測值相比較，計(jì)算實(shí)際值與預(yù)測值的偏差［偏差＝(預(yù)測值－實(shí)際值)/預(yù)測值］。結(jié)果見表10，實(shí)際值與預(yù)測值相對偏差均較小，均小于±5%，說明THP-PLGA-NPs實(shí)際測得的包封率、載藥量和粒徑大小與預(yù)測值較為接近，證明了采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化THP-PLGA- NPs處方具有良好的預(yù)測性，可靠性較高。THP- PLGA-NPs粒徑分布圖和Zeta電位圖分別見圖3和圖4。

2.7 THP-PLGA-NPs外觀及SEM觀察

THP-PLGA-NPs，外觀見圖5-A，略帶淺藍(lán)色乳光。取THP-PLGA-NPs混懸液0.1 mL，加入10 mL蒸餾水，混勻滴于銅柱，并常溫下自然揮干，于真空條件下噴金后置于SEM下觀察THP-PLGA-NPs外貌形態(tài)，結(jié)果見圖5-B。THP-PLGA-NPs外貌形態(tài)為橢圓形或球形粒子，各個(gè)粒子之間無粘連。

表9 方差分析

圖2 各因素與響應(yīng)值的三維圖

表10 預(yù)測值和實(shí)際值的比較(, n = 3)

圖3 THP-PLGA-NPs的粒徑分布

圖4 THP-PLGA-NPs的Zeta電位

圖5 THP-PLGA-NPs的外觀 (A) 及SEM圖(B)

2.8 THP-PLGA-NPs凍干粉的制備

2.8.1 凍干工藝及結(jié)果 取THP-PLGA-NPs混懸液加入一定量的凍干保護(hù)劑，混勻，于?60 ℃超低溫冰箱預(yù)凍1 d。置于?35 ℃冷凍干燥機(jī)中按照表11凍干程序進(jìn)行凍干，即得不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)、不同種類凍干保護(hù)劑的THP-PLGA-NPs的凍干粉末，分別評價(jià)凍干粉的外觀、色澤和分散時(shí)間，結(jié)果見表12。

蔗糖作為凍干保護(hù)劑時(shí)外觀、色澤和分散時(shí)間均不理想，當(dāng)乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于6%時(shí)雖外觀和色澤較為理想，但分散時(shí)間稍長，故最終選擇6%的甘露醇作為THP-PLGA-NPs的凍干保護(hù)劑，外觀飽滿，色澤均一，分散時(shí)間小于10 s。凍干粉外觀見圖6。

表11 凍干程序

表12 考察結(jié)果(n = 3)

2.8.2 THP-PLGA-NPs凍干粉穩(wěn)定性考察 取THP- PLGA-NPs混懸液置于干燥器中，分別于0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 d取0.1 mL，加入蒸餾水4 mL稀釋混勻，記錄粒徑和Zeta電位。取THP-PLGA-NPs凍干粉適量，0.1 mL蒸餾水復(fù)溶后同法操作，結(jié)果見表13。未凍干時(shí)，THP-PLGA- NPs 30 d后包封率下降超過20%，而凍干后包封率下降3%左右。未凍干時(shí)，30 d后粒徑增長至（343.94±36.48）nm，而凍干后粒徑增長幅度明顯較小。THP-PLGA-NPs凍干后PDI雖有變大趨勢，但30 d后仍小于0.3。因此，將THP-PLGA-NPs混懸液制備成凍干粉后有助于增加其穩(wěn)定性。

圖6 凍干粉外觀

2.9 體外釋藥行為研究及模型擬合

取適量THP-PLGA-NPs凍干粉（含10.0 mg的THP），加入3 mL 1.0% SDS水溶液，置于活化的透析袋中，兩端扎緊。取含10 mg THP溶液置于透析袋，同法操作。采用釋放介質(zhì)為1.0% SDS水溶液900 mL，設(shè)置溶出試驗(yàn)儀的溫度為（37±1）℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，于0、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36、48 h分別取樣3 mL，并立即補(bǔ)加空白釋放介質(zhì)3 mL。8500 r/min高速離心30 min后進(jìn)HPLC測定THP質(zhì)量濃度，計(jì)算含量及各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的累積釋放度，結(jié)果見圖7。THP原料藥在4 h內(nèi)基本釋放完畢，累積釋放度達(dá)到97.19%。THP- PLGA-NPs整個(gè)釋藥過程分為快速釋藥期和緩慢釋藥期，在0～6 h時(shí)間段釋藥相對較快，之后表現(xiàn)出明顯的緩釋特征，48 h內(nèi)的累積釋放度為72.67%。

表13 穩(wěn)定性試驗(yàn)(, n = 3)

對THP-PLGA-NPs體外釋藥機(jī)制進(jìn)行擬合，結(jié)果見表14。由相關(guān)系數(shù)可知，THP-PLGA-NPs體外釋藥符合Higuchi模型：M/∞＝0.112 41/2＋0.078 0，＝0.987 9。

圖7 體外釋放曲線(, n = 6)

表14 藥物釋放模型和相關(guān)系數(shù)

M為￥時(shí)累積釋放度，M為時(shí)間累積釋放度，M/M為時(shí)間累積釋放百分率，為時(shí)間

Mis accumulative drug-release at time￥,Mis accumulative drug- release at time,M/Mis accumulative release rate at time,is time

3 討論

在制備THP-PLGA-NPs時(shí)，油相加入到水相的方式如注射器滴加法、直接注入法等對粒徑有一定影響，結(jié)果顯示注射器滴加得到的THP-PLGA-NPs粒徑分布更為均勻，PDI值更小?？赡苁怯捎谧⑷敕▽Φ嗡佥^難控制，導(dǎo)致有機(jī)相在水相中分布不均勻，影響了有機(jī)相與水相間的溶劑交換過程，從而納米粒的形成過程產(chǎn)生影響[17]，這點(diǎn)需要研究者加以注意。完全將納米藥物與游離藥物分離的難度較大，而且據(jù)研究顯示[18-19]納米藥物與游離藥物之間存在動(dòng)態(tài)平衡，將游離藥物分離除去可能會(huì)對納米制劑的穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響，故本研究不再分離游離藥物。

PLGA材料用量對納米粒包封率、載藥量及粒徑大小均存在一定影響。一般來講，載體用量越大，納米制劑的包封率越高，但過多的載體用量不僅會(huì)影響載藥量，也會(huì)影響體系的黏度，最終導(dǎo)致納米粒徑升高，因此，合適的載體用量是THP-PLGA-NPs的關(guān)鍵因素之一。油水比例也會(huì)影響PLGA納米粒質(zhì)量，水相比例較大時(shí)有助于降低體系黏度，從而使納米粒更易分散，得到的粒徑較小。但較大的水相比例會(huì)增加乳化劑用量，使藥物因增溶作用進(jìn)入水相，最終影響納米制劑的包封率及載藥量。當(dāng)水相過小時(shí)，則會(huì)造成納米粒不易分散，從而發(fā)生團(tuán)聚，最終使粒徑及PDI增大。

本研究采用的乳化劑泊洛沙姆188具有巨大的空間位阻效應(yīng)，有助于提高PLGA納米粒的穩(wěn)定性，但其質(zhì)量分?jǐn)?shù)大小也影響著納米制劑的包封率、載藥量及粒徑大小。因此，選用PLGA用量、油-水比例和乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為主要影響因素，采用Box-Behnken響應(yīng)面法來優(yōu)化THP-PLGA-NPs處方。

前期研究顯示，THP-PLGA-NPs放置穩(wěn)定性存在較大問題，當(dāng)直接采用冷凍干燥法制備成凍干粉時(shí)，其粒徑及PDI值明顯變大，且包封率下降明顯。可能是由于在凍干過程中隨著水分的除去，納米粒子之間出現(xiàn)聚集、融合等現(xiàn)象，使粒徑增加，且分布不規(guī)律，最終使粒徑及PDI值變大。形成的冰晶也會(huì)對納米粒形成“固化損傷”，導(dǎo)致藥物泄露，造成包封率下降[20]。加入保護(hù)劑后，可有效阻止納米粒子聚集，降低或避免“固化損傷”，降低冷凍干燥過程中THP-PLGA-NPs混懸液的脫水速度及皺縮程度，因而THP-PLGA-NPs混懸液制備成凍干粉后穩(wěn)定性得到較大改善。

本研究分別采用不同質(zhì)量濃度的乳糖、蔗糖、甘露醇等制備THP-PLGA-NPs的凍干粉。并以凍干粉外觀、色澤和分散時(shí)間為指標(biāo)最終篩選出6%甘露醇作為THP-PLGA-NPs凍干劑時(shí)效果最佳。這可能是在凍干過程中的升華期或解析期時(shí)，甘露醇分子結(jié)構(gòu)中的OH?可與PLGA納米粒表面形成氫鍵[21-22]，在逐漸脫水過程中與水分子進(jìn)行同步交換，最大程度發(fā)揮了保護(hù)作用。

體外釋藥研究結(jié)果顯示，制備的THP-PLGA- NPs體外釋藥分為快速釋藥期和緩慢釋藥期?？焖籴屗庪A段可能是由于未包裹進(jìn)入納米粒的游離藥物所致。另外，分散于納米粒表面乳化層、淺表層或表層的藥物放出去需克服的屏障較少，因而釋藥相對容易，最終出現(xiàn)了快速釋藥期。緩慢釋藥期可能是由于包裹于PLGA納米粒內(nèi)部的藥物釋藥出去需克服的屏障相對較多，因而出現(xiàn)了緩慢釋藥期。這種包含快速釋藥期和緩慢釋藥期對藥物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)的影響還需進(jìn)一步研究。本研究成功制備了粒徑約為200 nm的THP-PLGA-NPs，由于載體的包裹作用有助于提高THP的體內(nèi)穩(wěn)定性，也為提高藥物的生物利用度、改變體內(nèi)組織分布、降低藥物毒副作用、增強(qiáng)藥效等奠定了基礎(chǔ)[8,23-24]。接下來將開展藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)等評價(jià)，后續(xù)將作進(jìn)一步的科研報(bào)道。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典[S].一部.2020: 145-146.

[2] 王安鑄, 馬曉昌.延胡索乙素的研究進(jìn)展 [J].中華中醫(yī)藥雜志, 2020, 35(4): 1927-1929.

[3] 于定榮, 翁小剛, 王本曉, 等.延胡索、白芷炮制配伍對元胡止痛方中延胡索乙素、歐前胡素含量以及鎮(zhèn)痛作用的影響 [J].中草藥, 2021, 52(8): 2306-2312.

[4] 趙芳, 楊云漢, 趙雪秋, 等.延胡索乙素與β-環(huán)糊精及其衍生物的包合行為研究 [J].中草藥, 2018, 49(15): 3609-3618.

[5] 李陽杰, 周敬.延胡索乙素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備及其藥動(dòng)學(xué)行為 [J].中成藥, 2019, 41(12): 2990-2993.

[6] 梁卓, 孫藝丹, 王銳利, 等.延胡索乙素在不同溶劑中平衡溶解度及其油水分配系數(shù)的測定 [J].中國藥物與臨床, 2012, 12(8): 984-986.

[7] 邵敬寶, 王群星, 石楠, 等.延胡索總生物堿的急性毒性及其鎮(zhèn)痛作用研究 [J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 43(10): 1156-1161.

[8] 高彩芳, 夏加璇, 朱穎, 等.納米技術(shù)在改善中藥有效成分成藥性中的應(yīng)用 [J].中草藥, 2018, 49(12): 2754-2762.

[9] 李潔麗, 鄭春麗, 劉建平, 等.多柔比星PLGA納米粒的處方工藝優(yōu)化及體外釋藥行為研究 [J].藥學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 48(5): 759-766.

[10] 王嬰, 李木生, 吳瑞嬋, 等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化青藤堿聚乳酸-羥基乙酸納米粒的制備工藝 [J].中藥新藥與臨床藥理, 2017, 28(2): 232-237.

[11] 管慶霞, 夏昭睿, 王艷宏, 等.包載馬錢子堿聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米粒處方工藝優(yōu)化及其特性研究 [J].中草藥, 2021, 52(4): 951-961.

[12] 陳堅(jiān)平, 方玉嬋, 申樓.熊果酸-PLGA納米粒的工藝研究及其表征 [J].中藥材, 2016, 39(10): 2315-2317.

[13] Ren?ber S, Ayd?n Kose F, Karavana S Y.Dexamethasone loaded PLGA nanoparticles for potential local treatment of oral precancerous lesions [J]., 2020, 25(2): 149-158.

[14] Allavena P, Palmioli A, Avigni R,.PLGA based nanoparticles for the monocyte-mediated anti-tumor drug delivery system [J]., 2020, 16(2): 212-223.

[15] 謝青璇, 李小芳, 謝龍, 等.Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化大黃素/小檗堿-殼聚糖雙載藥納米粒的處方工藝研究 [J].中草藥, 2021, 52(6): 1614-1622.

[16] 顏潔, 關(guān)志宇, 朱衛(wèi)豐, 等.Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化自組裝法制備葛根素殼聚糖/海藻酸鈉口服納米粒的處方與工藝研究 [J].中草藥, 2019, 50(23): 5706-5713.

[17] 李晴宇, 葉曉莉, 陳玲, 等.姜黃素PLGA納米粒的制備及制劑學(xué)性質(zhì)分析 [J].實(shí)用藥物與臨床, 2016, 19(6): 753-757.

[18] 郝海軍, 屈戰(zhàn)果, 范明松.隱丹參酮納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備及藥動(dòng)學(xué)研究 [J].中成藥, 2020, 42(4): 831-835.

[19] 李超英, 侯世祥, 陽長明, 等.葫蘆素毫微粒凍干針劑的研究 [J].中國中藥雜志, 2001, 26(5): 315-317.

[20] 吳超群, 李小芳, 牟倩倩, 等.甘草總黃酮納米混懸劑凍干粉的表征及穩(wěn)定性考察 [J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2018, 24(2): 29-33.

[21] 胡瑞瑞, 張家梁, 郝海軍.葫蘆素B磷脂復(fù)合物納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備 [J].中成藥, 2019, 41(11): 2571-2576.

[22] 毛艷婷, 馬姝麗, 白朝輝, 等.木犀草素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體及其凍干粉的制備和體外釋藥研究 [J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2020, 40(23): 2423-2429.

[23] 李曉婷, 決利利, 郝海軍, 等.隱丹參酮納米混懸劑的制備及其抗腫瘤活性 [J].中成藥, 2021, 43(1): 6-10.

[24] 劉會(huì)珍, 董丹丹, 范明松.不同厚樸酚制劑的制備、表征及其在SD大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為比較 [J].中草藥, 2020, 51(17): 4442-4448.

Formulation optimization of THP-PLGA nanoparticles by Box-Behnken design-response surface method andrelease study

YIN Yuan-yuan1, GENG Yan-na1, FAN Ming-song2

1.Huaihe Hospital of Henan University, Kaifeng 475000, China 2.Technique Center, Shanghai Leiyunshang Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai 201401, China

To optimize the formulation of tetrahydropalmatine (THP) poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanoparticles (THP-PLGA-NPs) by Box-Behnken design-response surface method (BBD-RSM), and carry outevaluation.Nanoprecipitation method was used to prepare THP-PLGA-NPs.Encapsulation efficiency, drug loading, polydispersity index (PDI) and particle size were used as evaluation index, single factor investigation method combined with BBD-RSM to investigate the optimal prescriptions of THP-PLGA-NPs.THP-PLGA-NPs were prepared into lyophilized powder using mannitol as freeze-dried protectors.The optimal formulation was characterized andrelease experiments were also carried out.The optimal formulation: PLGA dosage was 491.8 mg, oil-water volume ratio was 1∶5.2 and surfactant concentration was 1.12%.Envelopment efficiency, drug loading and particle size of THP-PLGA-NPS were (185.07 ± 1.06)%, (4.73 ± 0.21)% and (181.32 ± 7.14) nm, respectively.The results were close to that of predicted values.The drug releasehad obvious sustained-release characteristics, and the release process conformed to the Higuchi model:M/M= 0.112 41/2+ 0.078 0,= 0.987 9.It is feasible to apply BBD-RSM for the formulation optimization of THP-PLGA-NPS, and the optimized PLGA nanoparticles have slow-release effects.

tetrahydropalmatine; PLGA nanoparticles; nanoprecipitation method; prescription optimization; Box-Behnken design- response surface method; sustained-release characteristics;release

R283.6

A

0253 - 2670(2021)22 - 6806 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.005

2021-05-14

國家重大新藥創(chuàng)制（2018ZX09210090-002-009）；上海市科委項(xiàng)目（21S21903400）

尹元元（1988—），女，碩士，從事中藥學(xué)研究。Tel: (0371)23906791 E-mail: yinyuan1102@126.com

通信作者：范明松（1973—），男，博士，從事藥物研發(fā)工作。Tel: (021)51583466 E-mail: msfan007@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]