陳白燁 林博 王學(xué)明

1福建省婦幼保健院整形外科，福州 350000；2福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，福州 350000

創(chuàng)面的修復(fù)包括炎性反應(yīng)期、肉芽形成期、肉芽改建期等，該過程復(fù)雜而有序，是由多種細(xì)胞完成的，其中皮膚成纖維細(xì)胞是其中的重要組成部分［1-2］。研究證實，成纖維細(xì)胞的增值、凋亡、氧化應(yīng)激等參與創(chuàng)面的修復(fù)過程；而抑制成纖維細(xì)胞的氧化應(yīng)激及凋亡，促進(jìn)其增殖可以顯著促進(jìn)創(chuàng)面的愈合［3-4］。

以往研究中證實，虎杖苷可以顯著促進(jìn)大鼠創(chuàng)傷皮膚愈合［2］，但機(jī)制尚不清楚；虎杖苷可以改善膿毒癥大鼠器官損傷中細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)［5-6］。因此，2021 年1 月至4 月，本研究探討虎杖苷對脂多糖（LPS）介導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 人皮膚成纖維細(xì)胞購于上海賽佰慷生物科技有限公司；丙二醛（MDA）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒及細(xì)胞增殖檢測試劑盒（CCK-8）購于上海碧云天生物科技有限公司。腫瘤壞死因子（TNF）-α 及白介素（IL）-6 酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）試劑盒購于Abclonal 生物科技有限公司。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記測定法［terminal dexynucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL］凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人皮膚成纖維細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，在37 ℃及5% CO2下培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至融合度達(dá)80%以上后傳代。參照文獻(xiàn)［7］，以5 mg/L LPS 刺激皮膚成纖維細(xì)胞建立實驗?zāi)Ｐ?，培養(yǎng)72 h后檢測相關(guān)指標(biāo)。

細(xì)胞隨機(jī)分為4 組：正常對照組細(xì)胞接受正常培養(yǎng)處理；藥物對照組細(xì)胞接受 50 μmol/L 虎杖苷處理［8］；實驗組細(xì)胞接受5 mg/L LPS 處理；治療組細(xì)胞接受5μg/ml LPS 及50μmol/L虎杖苷處理。

1.3 MDA 含量測定 收集細(xì)胞并裂解，參照說明書配置試劑盒工作液，95 ℃水浴反應(yīng)60 min，酶標(biāo)儀檢測532 nm吸光值。

1.4 SOD 檢測 收集細(xì)胞并裂解，參照說明配置試劑盒工作液，37 ℃孵育20 min，酶標(biāo)儀檢測560 nm處吸光值。

1.5 細(xì)胞活力檢測 按照實驗設(shè)計收集各組細(xì)胞至96 孔板，每孔加入 10 μl CCK-8 工作液，孵育 2 h 后酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值。

1.6 凋亡細(xì)胞檢測 細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定，1%Triton X-100 通透，3% H2O2封閉后，與試劑盒中工作液（按說明配置）避光反應(yīng)60 min，以hoechst 標(biāo)記細(xì)胞核，F(xiàn)ITC 二抗標(biāo)記TUNEL 陽性細(xì)胞，在熒光顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞凋亡率。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)液炎癥因子檢測 取細(xì)胞培養(yǎng)液，離心后取上清，參照說明書方法，ELISA 檢測TNF-α 及IL-6水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較使用單因素方差分析（one-way ANOVA）和LSD 多重比較法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 虎杖苷對成纖維細(xì)胞活力及凋亡的影響 與正常對照組比較，實驗組細(xì)胞活力顯著下降，凋亡率顯著增加（均P＜0.05）；與實驗組比較，治療組細(xì)胞活力顯著增加，凋亡率顯著下降（均P＜0.05）。見表1。

表1 虎杖苷對成纖維細(xì)胞活力及凋亡的影響（%，）

表1 虎杖苷對成纖維細(xì)胞活力及凋亡的影響（%，）

注：正常對照組細(xì)胞不接受任何處理；藥物對照組細(xì)胞接受50μmol/L虎杖苷處理；實驗組細(xì)胞接受5 mg/L脂多糖處理；治療組細(xì)胞接受5 mg/L 脂多糖及50 μmol/L 虎杖苷處理；與對照組比較，aP＜0.05；與實驗組比較，bP＜0.05

細(xì)胞凋亡0.50±0.02 0.70±0.02 12.70±0.11a 7.50±0.08ab 3 870.51＜0.01正常對照組藥物對照組實驗組治療組F值P值6 6 6 6 100.00±2.30 101.00±2.50 78.00±5.90a 89.00±7.50ab 33.62＜0.01組別n 細(xì)胞活力

2.2 虎杖苷對成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與正常對照組比較，實驗組細(xì)胞SOD 含量顯著下降，MDA 含量顯著增加（均P＜0.05）；與實驗組比較，治療組細(xì)胞SOD 含量顯著增加，MDA含量顯著下降（均P＜0.05）。見表2。

表2 虎杖苷對成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響（）

表2 虎杖苷對成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響（）

注：正常對照組細(xì)胞不接受任何處理；藥物對照組細(xì)胞接受50 μmol/L 虎杖苷處理；實驗組細(xì)胞接受5 mg/L 脂多糖處理；治療組細(xì)胞接受5 mg/L脂多糖及50μmol/L 虎杖苷處理；MDA 為丙二醛，SOD 為超氧化物歧化酶；與對照組比較，aP＜0.05；與實驗組比較，bP＜0.05

MDA［nmol/（mg·pr）］1.54±0.18 1.49±0.14 3.38±0.29a 2.18±0.19ab組別正常對照組藥物對照組實驗組治療組n 6 6 6 6 SOD［U/（mg·pr）］22.4±1.8 23.5±2.1 11.5±1.3a 19.1±2.2ab 124.56＜0.01 F值P值54.95＜0.01

2.3 虎杖苷對成纖維細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響 與正常對照組比較，實驗組細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α 及IL-6 含量顯著增加（均P＜0.05）；與實驗組比較，治療組細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α及IL-6含量顯著下降（均P＜0.05）。見表3。

表3 虎杖苷對成纖維細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響（ng/L，）

表3 虎杖苷對成纖維細(xì)胞炎性反應(yīng)的影響（ng/L，）

注：正常對照組細(xì)胞不接受任何處理；藥物對照組細(xì)胞接受50 μmol/L 虎杖苷處理；實驗組細(xì)胞接受5 mg/L 脂多糖處理；治療組細(xì)胞接受 5 mg/ml 脂多糖及 50 μmol/L 虎杖苷處理；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α，IL-6 為白介素-6；與對照組比較，aP＜0.05；與實驗組比較，bP＜0.05

IL-6 38.4±3.1 35.9±2.8 784.4±49.6a 518.5±42.2ab 905.06＜0.01組別正常對照組藥物對照組實驗組治療組F值P值n6 6 6 6 TNF-α 53.5±4.6 63.2±6.5 483.5±38.4a 283.6±25.3ab 622.64＜0.01

3 討 論

創(chuàng)面愈合過程主要包括炎癥期、增殖期和修復(fù)期3 個時期［2］。炎性反應(yīng)通過影響創(chuàng)面細(xì)胞增殖及創(chuàng)面重塑，在創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮重要作。大量研究證實，炎性反應(yīng)通過影響成纖維細(xì)胞的活動，介導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生等多方面延緩創(chuàng)面愈合。王永祥和王春燕［9］證實，LPS抑制成纖維細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其釋放炎癥因子。萬立等［10］報道，LPS 通過抑制成纖維細(xì)胞增殖，導(dǎo)致燒傷創(chuàng)面瘢痕愈合或不愈合。因此，在許多研究中，主要通過LPS 刺激成纖維細(xì)胞，建立創(chuàng)面愈合炎癥期細(xì)胞模型［7］。本研究通過LPS 刺激皮膚成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與上述研究相符的研究結(jié)果，證實LPS 可以顯著抑制成纖維細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)大量炎癥因子產(chǎn)生，包括TNF-α 及IL-6。而在創(chuàng)面愈合過程中，炎癥因子通過影響細(xì)胞分化，活化炎癥細(xì)胞，抑制內(nèi)皮細(xì)胞及血管生成，從而導(dǎo)致瘢痕愈合或延緩創(chuàng)面愈合［11］。

大量研究證實，細(xì)胞凋亡參與了創(chuàng)面的愈合［3，12］。有研究報道，在炎癥因子刺激下，內(nèi)皮祖細(xì)胞動員減少，血管生成能力下降，成纖維細(xì)胞凋亡增加，遷移和增殖能力下降，進(jìn)而導(dǎo)致創(chuàng)面愈合延緩，而通過對細(xì)胞分型發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞的凋亡更加明顯［13］。研究證實，氧化應(yīng)激參與皮膚的衰老及創(chuàng)面的愈合，抑制氧化應(yīng)激可以顯著促進(jìn)創(chuàng)面愈合［4，14］。大量研究還證實，氧化應(yīng)激是介導(dǎo)炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的重要因素［15-16］，其可能通過誘導(dǎo)炎癥因子釋放及細(xì)胞凋亡參與創(chuàng)面愈合。本研究證實，LPS 可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激水平增加。在我們以往的研究中證實，虎杖苷可以顯著促進(jìn)大鼠創(chuàng)面愈合［2］，但機(jī)制尚未闡述清楚。在本研究中，我們證實虎杖苷可以顯著減輕成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

綜上，本研究推測虎杖苷可能通過抑制成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)及凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合，但其作用靶點及機(jī)制仍需進(jìn)一步的探討。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。