于曉霞，吳 華，邊 艷，鄭明楠，樸明姬，朱 虹，高弼虎

(大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院腎內(nèi)科，遼寧大連 116001)

局灶節(jié)段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)是全球范圍內(nèi)終末期腎臟病的重要病因之一[1]。病理主要表現(xiàn)為局灶、節(jié)段腎小球硬化及小管間質(zhì)纖維化，以蛋白尿或腎病綜合征為主要特征。FSGS為難治性腎病綜合征的主要病理類型，對激素治療不敏感，預(yù)后不佳，多數(shù)患者5～10年后進(jìn)展為終末期腎臟病[2]，因此，迫切需要有效的治療手段。

黃芪是我國傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)益脾腎、益氣升陽、行氣利水等功效，已被廣泛用于治療慢性腎臟病。黃芪甲苷是黃芪的主要藥理活性成分之一，具有抗炎、抗免疫、抗凝等作用[3-4]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能從多種途徑減少足細(xì)胞損傷，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[5-6]。因此，本研究通過眼球后注射阿霉素建立FSGS小鼠模型，通過觀察黃芪甲苷對其尿蛋白的影響，初步探討了黃芪甲苷對FSGS小鼠的保護(hù)作用，旨在為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

健康SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠30只，體重(20.62±2.41)g，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001]。在大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(遼)2018-0005]。采用抽簽法分為對照組、模型組和黃芪甲苷組，每組10只。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的條例執(zhí)行。

1.2 藥物及試劑

阿霉素注射粉劑購自北京索萊寶科技有限公司(批號(hào)：D8740)，異氟烷購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(批號(hào)：B2028066)，戊巴比妥那購自美國Sigma公司(批號(hào)：P3761)，尿清蛋白/肌酐(albumin to creatinine,ACR)檢測試劑盒購自南京建成有限公司(批號(hào)：20190722)。

1.3 儀器

全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus公司 AUA640)、光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司 CX41)、切片機(jī)(德國徠卡公司 UC7)、低溫離心機(jī)(德國Sigma公司 8K)等。

1.4 方法

1.4.1模型制備及給藥

(1)FSGS模型組：經(jīng)眼球后注射阿霉素(10 mg/kg)建立實(shí)驗(yàn)FSGS小鼠模型。術(shù)前及注射阿霉素后第1周(實(shí)驗(yàn)第1周)開始留取尿液，模型組小鼠ACR與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)為造模成功。(2)對照組：眼球后注射與阿霉素同等劑量生理鹽水。(3)黃芪甲苷組：造模方法同模型組相同。參照文獻(xiàn)[7]報(bào)道的劑量，實(shí)驗(yàn)第2周開始每天給予黃芪甲苷40 mg·kg-1·d-1(用1%羧甲基纖維素鈉溶解)灌胃，共8周。對照組及FSGS模型組均給予含1%羧甲基纖維素鈉的生理鹽水灌胃。

1.4.2ACR檢測

造模前，實(shí)驗(yàn)第1、10周末分別收集各組小鼠尿液，低速低溫離心，去除沉渣，按試劑盒說明書采用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定小鼠尿清蛋白和肌酐，計(jì)算ACR。

1.4.3生化指標(biāo)檢測

第10周末用3%戊巴比妥那麻醉各組小鼠后心臟穿刺采血，血液標(biāo)本置于含抗凝劑乙二胺四乙酸的離心管中，離心取上清液置于-20 ℃冰箱保存，使用全自動(dòng)生化分析儀測定總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density liptein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol,HDL-C)等。使用全自動(dòng)血凝分析儀檢測凝血酶原時(shí)間(prothrombin,PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)、纖維蛋白原(fibrinogen,Fg)等。

1.4.4腎臟取材及病理學(xué)檢查

10周末將各組小鼠麻醉后處死，取左側(cè)腎臟用磷酸鹽緩沖溶液沖洗后去除包膜，左腎經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h，75%～100%乙醇逐步脫水，浸蠟，石蠟包埋，連續(xù)切片(厚度2 μm)，行過碘酸雪夫反應(yīng)染色(PAS)，光鏡觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變。

1.4.5計(jì)算腎小球硬化指數(shù)(GSI)

取各組小鼠包埋好的腎臟石蠟標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片(厚度2 μm)，行蘇木精-伊紅染色，并應(yīng)用半定量法評(píng)估腎小球硬化程度[8]。腎小球硬化的定義為腎小球毛細(xì)血管腔塌陷和(或)玻璃樣變性，每張切片觀察大于或等于30個(gè)腎小球，依據(jù)腎小球硬化面積占腎小球比例分為0～4級(jí)：(1)0級(jí)為腎小球基本正常；(2)1級(jí)為腎小球硬化面積小于25%；(3)2級(jí)為腎小球硬化面積占25%～<50%；(4)3級(jí)為腎小球硬化面積占50%～75%；(5)4級(jí)為腎小球硬化面積大于75%。GSI=[(1N1+2N2+3N3+4N4)/每張切片腎小球總數(shù)]×100%，N1、N2、N3、N4分別為1、2、3、4級(jí)腎小球硬化個(gè)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 生存情況

對照組小鼠在實(shí)驗(yàn)中未出現(xiàn)死亡；模型組小鼠于注射阿霉素后第2天死亡1只，第5周死亡1只；黃芪甲苷組小鼠于實(shí)驗(yàn)第3周死亡1只。

2.2 ACR變化

各組小鼠造模前ACR比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組和黃芪甲苷組小鼠造模后第1周末ACR均較對照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示造模成功。與對照組比較，模型組小鼠第10周末ACR明顯增加，黃芪甲苷治療后小鼠ACR水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較。

2.3 3組小鼠血脂水平比較

與對照組比較，模型組小鼠第10周末TC、TG、LDL-C水平均明顯增加，HDL-C 水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；黃芪甲苷組小鼠TC、TG、LDL-C水平均較模型組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，HDL-C水平略升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組小鼠血脂水平比較

2.4 3組小鼠凝血功能比較

與對照組比較，模型組小鼠第10周末PT、APTT明顯縮短，F(xiàn)g明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；黃芪甲苷組小鼠Fg較對照組略升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，黃芪甲苷組小鼠PT、APTT明顯延長，F(xiàn)g明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠凝血功能比較

2.5 腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察

對照組小鼠腎小球偶見局灶、節(jié)段性腎小球系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生，偶見腎小球局灶、節(jié)段性硬化，小管間質(zhì)未見明顯異常。模型組小鼠可見彌漫腎小球系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增多，多個(gè)腎小球局灶、節(jié)段性硬化，腎間質(zhì)可見灶狀單個(gè)核細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，部分腎小管上皮細(xì)胞脫落。黃芪甲苷組小鼠腎小球見輕度系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生，部分腎小球可見局灶、節(jié)段性硬化，腎小管及腎間質(zhì)未見明顯病理改變，見圖2。

2.6 3組小鼠GSI比較

對照組小鼠腎小球毛細(xì)血管袢開放良好，每個(gè)系膜區(qū)不超過3個(gè)系膜細(xì)胞，偶見腎小球硬化。與對照組比較，模型組小鼠腎小球硬化數(shù)量明顯升高，GSI明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；黃芪甲苷組小鼠可見部分腎小球硬化，GSI較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

A：對照組；B：模型組；C：黃芪甲苷組。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與模型組比較。

3 討 論

FSGS是難治性腎病綜合征和終末期腎病的常見原因。目前，原發(fā)性FSGS雖然有大量的治療手段，如糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑/受體拮抗劑等，但很多患者對糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療反應(yīng)不佳，導(dǎo)致疾病進(jìn)展出現(xiàn)腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，最終發(fā)展至ESRD，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[9-10]。近年來，隨著中醫(yī)藥的優(yōu)勢逐漸被重視，中西醫(yī)結(jié)合治療腎小球疾病已在臨床廣泛應(yīng)用。中醫(yī)認(rèn)為，F(xiàn)SGS屬本虛標(biāo)實(shí)，腎虛為主，常將其歸屬于“腎風(fēng)”“尿血”等范疇[11]。呂靜等[12]認(rèn)為，F(xiàn)SGS病變初期病機(jī)為腎絡(luò)虛滯，病變后期病機(jī)轉(zhuǎn)為腎絡(luò)瘀阻，治療方面應(yīng)以益氣化瘀療法為治則。作為補(bǔ)氣中藥的代表，黃芪性甘，微溫，歸脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)氣健脾、升陽舉陷、益胃固表、利尿消腫、托毒生肌等功效，已被廣泛用于治療各類腎臟疾病[12-13]。黃芪甲苷作為黃芪的主要活性成分，其藥效也被大量的臨床觀察所證實(shí)，因此，本研究觀察了黃芪甲苷對FSGS模型小鼠尿蛋白等指標(biāo)的影響。

本研究采用注射阿霉素的方法建立FSGS小鼠模型，也是目前常用的模擬人類FSGS的動(dòng)物模型。阿霉素是一種強(qiáng)效的細(xì)胞毒類抗腫瘤藥，可同時(shí)抑制細(xì)胞DNA、RNA合成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對腎小球臟層上皮細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞均具有明顯毒性損傷，最終導(dǎo)致FSGS。本研究給予阿霉素球后靜脈注射后模型組小鼠病理學(xué)檢查可見多個(gè)腎小球局灶節(jié)段性硬化，支持造模成功。

FSGS的主要臨床特征為大量蛋白尿。蛋白尿既是慢性腎臟病的始動(dòng)因素又是慢性腎臟病的加重因素，因此，積極防治蛋白尿一直是FSGS研究的重點(diǎn)。目前認(rèn)為，24 h尿蛋白定量或過夜時(shí)段尿清蛋白排泄率是診斷蛋白尿的金標(biāo)準(zhǔn)，但上述2種檢查不僅耗時(shí)耗力，而且尿液留取及測量的準(zhǔn)確性較難保障。ACR是分別檢測尿液中微量清蛋白和肌酐含量，計(jì)算二者比值來反映清蛋白的排泄情況，ACR具有很好的穩(wěn)定性，檢測結(jié)果與尿清蛋白排泄率具有一致性，而且留取方便，是一項(xiàng)簡單、快捷、準(zhǔn)確反映尿微量清蛋白排泄的指標(biāo)[14]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠ACR水平較對照組明顯升高，應(yīng)用黃芪甲苷治療后ACR水平明顯下降，腎臟的病理損傷程度及GSI均明顯降低。表明黃芪甲苷治療具有降低FSGS小鼠尿蛋白，并減輕腎臟病理損傷的作用，與HE等[15]研究結(jié)果一致。

1982年MOORHEAD等[16]首次提出，高脂血癥是腎小球硬化發(fā)生、發(fā)展的獨(dú)立致病因素。低密度脂蛋白升高是高脂血癥的重要表現(xiàn)，而在體內(nèi)氧化低密度脂蛋白是低密度脂蛋白的氧化修飾形式，氧化低密度脂蛋白可通過引起脂質(zhì)積累、炎性反應(yīng)等直接或間接損傷足細(xì)胞，導(dǎo)致FSGS的發(fā)生。本研究也發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C水平均明顯高于對照組，而黃芪甲苷治療可一定程度降低FSGS小鼠的血脂水平。

凝血是機(jī)體重要的生理過程，目前，大量臨床資料已證實(shí)，凝血與纖溶功能平衡紊亂是腎小球硬化及間質(zhì)纖維化病變發(fā)展過程中的重要病理生理改變。PT、APTT分別反映外源性凝血系統(tǒng)和內(nèi)源性凝血系統(tǒng)功能狀況，F(xiàn)g是血漿中含量最高的凝血因子，其水平增高提示血液處于高凝狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠PT、APTT明顯縮短而Fg明顯升高，提示FSGS小鼠血液處于高凝狀態(tài)，黃芪甲苷可延長FSGS小鼠PT及APTT，降低Fg，改善模型小鼠的高凝狀態(tài)。

綜上所述，黃芪甲苷可降低FSGS小鼠尿蛋白水平，減輕腎臟病理損傷，降低其血脂水平，同時(shí)還能改善模型小鼠的高凝狀態(tài)，為黃芪甲苷進(jìn)一步在臨床合理應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。