熊蕾蕾，張松林，張向峰，張志英，靳秀紅

（鄭州大學附屬兒童醫(yī)院、河南省兒童醫(yī)院、鄭州兒童醫(yī)院南院區(qū)呼吸科，鄭州450000）

哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，在過去幾十年來，兒童哮喘的發(fā)病率呈顯著上升趨勢[1]。氣道上皮是呼吸道的第一道屏障，受到刺激后可引發(fā)Th2型反應，誘導IgE型速發(fā)型變態(tài)反應，IgE可誘導嗜酸粒細胞和肥大細胞脫顆粒，釋放炎癥介質，引起氣道慢性炎癥反應和氣道重塑[2]。白細胞介素（IL）-33是Th2型反應中強大的炎癥因子，在哮喘中發(fā)揮重要作用[3]。T細胞介導的免疫紊亂在哮喘中發(fā)揮一定作用，其中包括Th1型細胞產生的干擾素（IFN-γ）。哮喘是免疫因素、基因因素和環(huán)境因素等相互作用造成的，Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）在免疫性和炎癥性疾病中扮演重要角色，且與哮喘的發(fā)生、發(fā)展密切相關[4]。有研究顯示，TLR4可促進炎癥因子的釋放，抑制TLR4信號通路的轉導和相關炎癥因子的表達[5-6]。R848是一種咪唑喹啉，可通過TLR7/TLR8 MyD88依賴性信號通路活化免疫細胞。TLR7通過刺激MyD88途徑激活APC，從而導致促炎因子、趨化因子、Ⅰ型干擾素（IFN）及共刺激分子的上調[7]。在大鼠中，R848已顯示出抑制炎癥反應并消除氣道重塑的作用[8]。在本研究中作者通過收集哮喘急性發(fā)作期患兒外周血，分離培養(yǎng)外周血單個核細胞（PBMC），檢測R848刺激PBMC后對IFN-γ、IL-33和IgE水平的影響，為哮喘的治療提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2018年6月—2020年5月接受治療的急性發(fā)作期哮喘患者125例，男55例，女70例，年齡4～12歲，及同時期來院就診的臨床緩解期哮喘患者30例，男13例，女17例，年齡3～10歲。納入標準：（1）急性發(fā)作期哮喘患者和臨床緩解期哮喘患者的診斷符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》[9]。（2）近3個月未使用免疫抑制劑和糖皮質激素。排除標準：（1）近1個月有呼吸道感染史或合并其他炎癥性疾病。（2）合并免疫系統(tǒng)性疾病。（3）合并過敏性鼻炎。（4）合并血液系統(tǒng)性疾病。（5）合并腫瘤。本研究經過醫(yī)院倫理委員會批準，家屬知情并簽署知情同意書。

1.2 外周血PBMC分離 抽取急性發(fā)作期哮喘患者和臨床緩解期哮喘患者的外周靜脈血5 mL，肝素抗凝，加入5 mL Hank′s進行稀釋，利用Ficoll進行梯度離心（常溫，2 000 r/min，20 min），吸取分離液與血漿間的白膜層。加入3 mL PBS溶液混合均勻，1 500 r/min離心10 min，吸去上清。加入2 mL紅細胞裂解液，在室溫下孵育5 min，裂解紅細胞，1 500 r/min離心5 min，吸去裂解液。加入3 mL PBS溶液混合均勻，1 500 r/min離心5 min，吸去上清。用RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞進行培養(yǎng)，待細胞傳2代后凍存待用。

1.3 qRT-PCR檢測急性加重期患者PBMC中TLR7/8 mRNA的相對表達水平 Trizol提取PBMC的總RNA，依據(jù)反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，進行PCR檢測TLR7/8 mRNA的相對表達水平。TLR7上游引物序列為5′-GACCGGTCAAGTCCCAGTGTAGAAC-3′，下游引物序列為5′-TTACTGACTTCATGGCATGTACGGT-3′，TLR8上游引物序列為5′-TACGGGGATCGGCCTTGACTCGCCT-3′，下游引物序列為5′-CCTGGAAATGCGACTGAATGGTTGC-3′，磷酸甘油醛脫氫酶為內參，上游引物序列為5′-GGTACGGTCCGTACGTGATGCCGTAG-3′，下游引物序列為5′-CCGTAGTTGCTAGCTGAATGTGATGC-3′。PCR反應條件為95℃預變性2 min，再變性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸35 s，總共40個循環(huán)，72℃延伸10 min，利用2-ΔΔCt計算TLR7/8 mRNA的相對表達水平。

1.4 ELISA實驗檢測IFN-γ、IL-33和IgE的水平 不同濃度R848（0 mg/L、0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L）刺激急性發(fā)作期PBMC細胞（隨機抽取10例患者的PBMC細胞）24 h后檢測IFN-γ、IL-33和IgE的水平。根據(jù)試劑盒說明進行以下操作：利用鼠抗人IFN-γ、IL-33和IgE抗體包被ELISA板，放置4℃冰箱中過夜，用PBS溶液（含有0.5 ml/LTween20）洗滌1次，再加入PBS溶液洗滌1次，然后放置室溫靜置1 h。向ELISA板中加入不同稀釋濃度的IFN-γ、IL-33和IgE標準品及待檢測的樣品，放置室溫2 h。加入對應的生物素標記的鼠抗人IFN-γ、IL-33和IgE抗體，放置室溫1 h。加入底物顯色在室溫下避光放置30 min，最終加入100 ml/L的硫酸終止顯色，用酶標儀檢測IFN-γ、IL-33和IgE的含量。

1.5 統(tǒng)計學處理 利用SPSS21.0軟件行統(tǒng)計分析，經過正態(tài)性檢測，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間的兩兩比較采用SNK-q檢驗。非正態(tài)分布資料以中位數(shù)（四分位間距）表示，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗。Pearson進行相關性檢測，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 急性發(fā)作期患者外周血中PBMC分泌IFN-γ、IL-33和IgE的水平 急性發(fā)作哮喘患者外周血中PBMC分泌IFN-γ的水平低于臨床緩解期，分泌IL-33和IgE的水平高于臨床緩解期（均P<0.05）。急性發(fā)作期患者外周血中TLR7/8 mRNA相對表達水平低于臨床緩解期（P<0.05），見表1。

表1 兩組外周血中PBMC分泌IFN-γ、IL-33和IgE的水平[±s，M（P25，P75）]Tab 1 Thelevelsof IFN-γ，IL-33 and IgE secreted by PBMC in peripheral blood of two groups[±s，M（P25，P75）]

表1 兩組外周血中PBMC分泌IFN-γ、IL-33和IgE的水平[±s，M（P25，P75）]Tab 1 Thelevelsof IFN-γ，IL-33 and IgE secreted by PBMC in peripheral blood of two groups[±s，M（P25，P75）]

注：IL-33：白細胞介素-33；IFN-γ：干擾素-γ；TLR7：Toll樣受體7；TLR8：Toll樣受體8

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2.2 急性發(fā)作期患者外周血中IL-33、IFN-γ和IgE水平與TLR7/8 mRNA相對表達水平相關性分析 急性發(fā)作期患者外周血中IL-33水平與TLR7/8 mRNA相對表達水平呈負相關（r=-0.887，P<0.001；r=-0.910，P<0.001），IFN-γ水平與TLR7/8 mRNA相對表達水平呈正相關（r=0.818，P<0.001；r=0.808，P<0.001），IgE水平與TLR7/8 mRNA相對表達水平呈負相關（r=-0.850，P<0.001；r=-0.838，P<0.001），見圖1。

圖1 IL-33、IFN-γ和IgE水平與TLR7/8 mRNA相對表達水平相關性分析Fig 1 Correlation analysisbetween IL-33,IFN-γand IgElevelswith therelativeexpression levelsof TLR7/8 mRNA

2.3 不同濃度R848刺激急性發(fā)作期患者PBMC分泌IFN-γ、IL-33和IgE的水平比較 R848刺激急性發(fā)作期患者PBMC細胞后，IL-33和IgE水平在R848 1 mg/L時降低，至R848 10 mg/L后趨于平穩(wěn)（F=56.231、42.310，均P<0.001）。IFN-γ水平在R848 0.1 mg/L時逐漸升高，至R848 10 mg/L后趨于平穩(wěn)（F=62.352，P<0.001），見圖2。

圖2 不同濃度R848刺激急性發(fā)作期患者PBMC分泌IFN-γ、IL-33和IgE的水平比較Fig 2 Comparison of thelevelsof IFN-γ,IL-33and IgEsecreted by PBMCof patientswithdifferent concentrationsof R848in theacutestage

2.4 R848刺激急性發(fā)作期患者PBMC分泌IFNγ、IL-33和IgE的動態(tài)觀察 R848 10 mg/L刺激急性發(fā)作期PBMC 6~48 h，IL-33和IgE水平在12 h時降低，至36 h后趨于平穩(wěn)（F=32.658、36.521，均P<0.001），IFN-γ在12 h時增加，至36 h后趨于平穩(wěn)（F=42.321，P<0.001），見圖3。

圖3 R848刺激急性發(fā)作期PBMC分泌IFN-γ、IL-33和IgE的動態(tài)觀察Fig 3 Thedynamic observation of R848 stimulatesthesecretion of IFN-γ,IL-33and IgEfrom PBMCin theacutestage

3 討論

過敏性哮喘是一種影響氣道的異質性疾病，其特征是涉及多種細胞和體液介質的慢性炎癥反應。典型的哮喘性氣道炎癥是由IgE依賴性肥大細胞脫粒引發(fā)的，并可誘導Th2型細胞因子分泌。這種慢性炎癥反應被認為是氣道重塑的根本原因，其特征是上皮下基層纖維化，杯狀細胞和平滑肌增生[10]。目前哮喘的管理策略一是使用支氣管擴張劑（短效和長效2型激動劑）作用于急性加重期和延長緩解時間，二是吸入皮質類固醇以最大程度減少哮喘發(fā)作，現(xiàn)已證明控制炎癥是治療哮喘的有效方法[11]。TLR可介導病原體相關分子模式識別，在先天和適應性免疫中都起著至關重要的作用[12-13]。這些廣泛表達的蛋白質是第一個參與對環(huán)境刺激產生免疫應答的分子，該過程由細胞激活和刺激細胞因子產生介導。已有研究顯示TLR2和TLR4的多態(tài)性與哮喘的發(fā)病相關[14]，致敏的炎癥性單核細胞中TLR信號的激活可通過促進Th1相關細胞因子的表達，減弱卵清蛋白誘導的過敏性哮喘[15]。

R848已被證明可誘導從嚙齒類到靈長類的許多物種中多種細胞因子的表達[16]。有研究顯示在急性哮喘小鼠模型中，R848治療可以預防肺部疾病的發(fā)展，包括氣道高反應性和嗜酸性粒細胞增多[17]。對BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠哮喘模型的研究發(fā)現(xiàn)，R848均表現(xiàn)出抑制急性炎癥反應的作用[18-19]。鑒于R848治療可以預防幾種遺傳多樣的小鼠品系與過敏原激發(fā)有關的急性炎癥反應，筆者推測該化合物也可以抑制人哮喘的急性炎癥反應。因此本研究收集急性發(fā)作期哮喘患者的外周血，分離培養(yǎng)PBMC。經過一系列實驗檢測顯示，急性發(fā)作哮喘患者外周血中PBMC分泌IFN-γ的水平較低，分泌IL-33和IgE的水平較高，IFN-γ與TLR7/8 mRNA水平呈正相關，IL-33和IgE與IFN-γ及TLR7/8 mRNA水平呈負相關。提示IL-33、IgE和IFN-γ與TLR7/8密切相關，TLR7/8可能通過調控IL-33、IgE和IFN-γ水平參與哮喘的發(fā)生和發(fā)展。R848處理PBMC后可呈劑量依賴性和時間依賴性的抑制IL-33和IgE的分泌，促進IFN-γ的分泌，發(fā)揮抗炎作用。有研究顯示TLR7配體可刺激CD4+淋巴細胞和巨噬細胞共培養(yǎng)物中Th1細胞因子IL-12、IFN-γ和IFN-α的產生[20]。對人類細胞的研究表明，R848可以直接誘導效應記憶CD4+T細胞增殖并上調IFN-γ生成[21]。Shen等[22]研究顯示，TLR7/8配體R848以劑量依賴的方式抑制鼠脾細胞中抗CD40和IL-4介導的IgE和IgG1的產生，R848對脾細胞抗CD40和IL-4誘導的IgE合成的抑制作用似乎是由至少3種不同的機制介導的。首先，R848抑制了抗CD40和IL-4刺激的脾細胞中B細胞的增殖和分裂。其次，R848促進了IFN-γ和IL-12的產生，而這部分是抑制IgE產生的原因。第三，R848對B細胞具有直接的抑制IgE產生的作用。以上結果均顯示，R847對哮喘的炎癥反應有一定的抑制作用。

綜上所述，本研究結果顯示R848可調節(jié)急性發(fā)作期哮喘患者PBMC分泌的IL-33、IgE和IFN-γ水平，發(fā)揮抗炎作用。但具體的作用機制、對于預防慢性氣道重塑的影響還有待進一步研究。