李璐璐，陳國忠，吳瑕，袁鐵超，王婕，歐智海，易志忠

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530000； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530000

在腫瘤的發(fā)生中，胃癌因其極高的發(fā)生率和致死率，以及逐漸趨向年輕化，嚴(yán)重威脅人類的健康。2018年，我國胃癌的發(fā)病人數(shù)已占全球總發(fā)病人數(shù)的45%。及時(shí)干預(yù)并阻斷胃癌前病變的進(jìn)展能降低胃癌發(fā)生率，達(dá)到二級預(yù)防效果。因此，研究胃癌前病變進(jìn)展過程，探討胃癌的發(fā)病機(jī)制，建立一個(gè)穩(wěn)定可靠的動(dòng)物胃癌模型成為治療的首要前提。本實(shí)驗(yàn)選擇目前常用的N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(N-Methyl-N′-Nitro-N-Nitrosoguanidine，MNNG)給藥方式和濃度并進(jìn)行改良[1-4]，探討一種新的簡單易行、實(shí)用性強(qiáng)的造模方式。

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF級雄性Wistar大鼠50只，4周齡，體質(zhì)量(50±2) g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，每籠3～4只，室溫25 ℃，每天光照10 h，非造模時(shí)常規(guī)飲食和飲用水飼養(yǎng)。動(dòng)物使用許可證號：SCXK(桂)2009-2003。實(shí)驗(yàn)涉及動(dòng)物的飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與保護(hù)的有關(guān)準(zhǔn)則。

1.2 試劑MNNG(東京化成工業(yè)株式會社，批號：8WF3N-JQ)；含2%氯化鈉的高鹽飼料(南京盛民科研動(dòng)物養(yǎng)殖場，批號：3105231)；40 ng·L-1多聚甲醛通用型組織固定液(北京蘭杰柯科技有限公司，貨號：70081800)；蘇木素染色液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：C0107)；鹽酸乙醇快速分化液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：C0163M)；伊紅染液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：C0109)；中性樹膠(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：ZLI-9555)；水合氯醛(成都市科隆化學(xué)品有限公司，貨號：302-17-0)；二甲苯(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；無水乙醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號：20160908)；體積分?jǐn)?shù)95%乙醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號：20160806)。

1.3 儀器KD-T型生物組織攤烤片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；BX43型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 建立動(dòng)物模型將50只大鼠隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組25只。對照組予生理鹽水灌胃，實(shí)驗(yàn)組以100 g·L-1MNNG為起始濃度，之后每10周增加25%，直到濃度為150 g·L-1的方式灌胃，連續(xù)灌胃40周。對照組正常飼料和頻率喂食，實(shí)驗(yàn)組均以高鹽飼料喂食并配合饑飽失常(饑1天，飽1天)，同時(shí)予常規(guī)飲用水飲用。

2.2 大鼠體質(zhì)量變化在第20周時(shí)分別從各實(shí)驗(yàn)組與對照組中隨機(jī)抽取10只大鼠稱體質(zhì)量。

2.3 收集大鼠胃組織實(shí)驗(yàn)組每日灌胃1次，從第16周時(shí)開始，每隔4周分別從不同組隨機(jī)抽取3只大鼠處死(實(shí)驗(yàn)過程中自行死亡的大鼠也需及時(shí)進(jìn)行尸檢)，至第40周全部處死。暴露并游離胃，將胃切開，首先在腫瘤組織中取標(biāo)本，若無肉眼腫物則分別在胃底、胃體、胃小彎、幽門及十二指腸取材，40 ng·L-1多聚甲醛固定，送病理科進(jìn)行病理組織鑒定，記錄并對比各組胃癌組織的發(fā)生時(shí)間、浸潤侵襲情況及突破黏膜層的程度。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的一般狀態(tài)對照組大鼠飲食正常，體質(zhì)量增加，反應(yīng)靈敏，皮毛光澤。實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)食減少，體質(zhì)量減輕，反應(yīng)遲鈍，皮毛晦暗，嗜睡，蜷縮，無精神。與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠在第20周時(shí)體質(zhì)量極顯著降低(P<0.01)，見表1。

表1 第20周時(shí)大鼠體質(zhì)量比較

3.2 病理結(jié)果當(dāng)胃組織中有不同程度的異型增生、或腸化，或提示胃癌，表示造模成功。實(shí)驗(yàn)組第24周造模成功，病理提示腸化生伴輕度不典型增生；第26周大鼠自行死亡1例，病理提示輕度異型增生伴腸化生。第30周自行死亡1例，病理結(jié)果提示胃癌，其中各組自行死亡大鼠或因死亡時(shí)間過長未送病檢，或病理結(jié)果未提示造模成功的，不納入總計(jì)數(shù)量。實(shí)驗(yàn)組成模情況為胃組織出現(xiàn)重度不典型增生3只、輕度不典型增生3只、腸化生7只、胃癌4只，無效4只，成功率80.95%。實(shí)驗(yàn)組不同周數(shù)的病理演變見圖1～圖5。

注：A：(HE染色，×100)；B：(HE染色，×200)；C：(HE染色，×400)圖1 正常組大鼠胃組織16～20周形態(tài)學(xué)變化

圖2 實(shí)驗(yàn)組胃組織24～26周(腸化生)病理損傷變化(HE染色，×200)

圖3 實(shí)驗(yàn)組胃組織28～30周(輕度不典型增生)病理損傷變化(HE染色，×400)

圖4 實(shí)驗(yàn)組胃組織28～30周(重度不典型增生)病理損傷變化(HE染色，×200)

圖5 實(shí)驗(yàn)組胃組織30～40周(胃癌)病理損傷變化(HE染色，×200)

3.3 兩組大鼠存活情況統(tǒng)計(jì)對照組存活22只，存活率88.0%；自行死亡3只，死亡率12%。實(shí)驗(yàn)組存活19只，存活率76.0%；自行死亡6只，死亡率24%。見表2。

表2 兩組大鼠存活情況統(tǒng)計(jì)

4 討論

研究認(rèn)為，胃癌典型發(fā)展順序是：慢性炎癥-萎縮性胃炎-萎縮性胃炎伴腸化生-異型增生-胃癌[5-6]，這一過程與多因素作用相關(guān)。造模時(shí)需參考這些因素并應(yīng)用。目前大鼠胃癌造模尚無公認(rèn)的造模方法，盡管MNNG試劑已被廣泛應(yīng)用，但給藥方式、時(shí)間和濃度的差異會導(dǎo)致誘發(fā)率低且周期較長，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ綇?fù)雜，操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)成本較高，難以達(dá)到預(yù)期的效果。而MNNG單因素誘發(fā)胃癌造模成功率較低，因此常配合高鹽食物、酒精[7-8]、幽門螺桿菌[9]等多種復(fù)合因素的干預(yù)以提高效率。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)組模擬胃癌形成的過程，僅將高鹽飼料及饑飽失常作為危險(xiǎn)因素在大鼠胃癌造模中聯(lián)合應(yīng)用，簡化實(shí)驗(yàn)。

研究認(rèn)為，高鹽可以破壞胃黏膜屏障[10-11]，使得胃黏膜處于損傷-修復(fù)-再損傷的循環(huán)，炎癥細(xì)胞浸潤，對腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移均有促進(jìn)作用，誘導(dǎo)胃組織的異型增生。長期飲食不規(guī)律也是誘發(fā)胃癌的高危因素[12]，會造成胃蠕動(dòng)及排空的失衡，增加MNNG及高鹽飼料與胃黏膜接觸時(shí)間，進(jìn)一步損傷保護(hù)屏障。已知MNNG使用方式有自由飲用和灌胃兩種模式，在前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MNNG藥物采用自由飲用方式干預(yù)，受大鼠的個(gè)體差異(如食欲、情緒、環(huán)境等)影響較大，實(shí)際攝入量無法把控，難以達(dá)到理想濃度，使得造模拖延。因此，實(shí)驗(yàn)組采用灌胃模式，盡可能保證藥物攝入。結(jié)合目前已報(bào)道的文獻(xiàn)[13-16]，MNNG給藥濃度和時(shí)間無明確定論，多數(shù)實(shí)驗(yàn)將MNNG濃度設(shè)在100～200 ng·L-1，飲用MNNG 20～40周可成功造模，灌胃MNNG在10～30周可成功造模，但造模成功率無法保證，且造模成功節(jié)點(diǎn)無明確闡釋，對大鼠死亡率并無確切描述。在設(shè)計(jì)本次實(shí)驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)組采用以100 ng·L-1為起始濃度，之后每10周增加25%的梯度濃度造模，采用循序漸進(jìn)的方法。

研究顯示[17]，低濃度MNNG灌胃造模時(shí)間較長，成功率低，其原因不排除隨著大鼠周數(shù)的增長，大鼠出現(xiàn)耐藥情況，低濃度不再敏感，且低濃度MNNG灌胃后大鼠胃組織病理變化以腸化生為主，無法得到理想的胃癌病變模型。高濃度MNNG持續(xù)灌胃可建立大鼠胃癌模型，但對大鼠刺激較大，死亡率非常高，胃組織容易出現(xiàn)黏膜發(fā)生突變，進(jìn)展過程隱匿且迅速，胃癌的發(fā)病模式無法體現(xiàn)上述人類典型模式[18]。當(dāng)胃黏膜病變進(jìn)展過快，對實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集時(shí)間的掌握和靈活度要求更高，實(shí)驗(yàn)難度系數(shù)增大。因此本研究目的是探討如何簡化實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用梯度灌胃MNNG，是否既能保證攝入濃度，盡可能減少大鼠死亡率，又能獲得良好連續(xù)的造模效果，這也是本課題的意義所在。

本研究實(shí)驗(yàn)組成功率可達(dá)到80.95%，成功率較高，整個(gè)過程完整、連續(xù)，第16周可見大鼠胃黏膜有大量淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤，20周胃底腺可見萎縮并減少，黏膜變薄，24周可見輕度不典型增生伴腸腺化生，28周可見胃腺體重度不典型增生，30周可見早癌組織，黏膜層連續(xù)完整，第32周可見浸潤到肌層，第36周胃癌突破到漿膜層，清晰呈現(xiàn)從胃炎發(fā)展到胃癌的不同階段。實(shí)驗(yàn)組存活率為76%，與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與其他同類型實(shí)驗(yàn)比較，存活率更高[19]。實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)大鼠死亡的因素大多為灌胃操作導(dǎo)致的機(jī)械性損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組與對照組存活率無明顯差異，提示實(shí)驗(yàn)組遞進(jìn)MNNG濃度灌胃并不會造成大鼠死亡率的增加，優(yōu)于其他類型MNNG誘導(dǎo)胃癌模型[3-4]。本研究實(shí)驗(yàn)組前期采用低劑量MNNG大鼠逐漸適應(yīng)，后期隨著大鼠周齡增大并遞增給藥劑量，在一定程度上可改善大鼠耐藥情況，讓大鼠在耐受的情況下保證盡可能多的攝入MNNG，也能減輕因劑量突然變化對其的刺激影響，減少大鼠死亡率。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠的死亡主要發(fā)生在后期，此時(shí)大鼠進(jìn)食減少，體質(zhì)量迅速下降，解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)食管和胃黏膜潮紅、大量散在糜爛病灶和活動(dòng)性潰瘍，腸脹氣明顯，考慮除了灌胃引起的機(jī)械性損傷外，可能與高濃度MNNG毒性增大引起的急性黏膜損傷相關(guān)。

胃癌前病變是胃癌發(fā)生的重要節(jié)點(diǎn)，這一階段的早期診斷和干預(yù)是胃癌防控的關(guān)鍵，截?cái)嗌踔聊孓D(zhuǎn)胃癌前病變的發(fā)展成了目前研究的熱點(diǎn)，而建立一個(gè)高效可行的胃癌前病變模型，尤為關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)組造模過程穩(wěn)定完整，可為研究癌前病變各個(gè)階段特征、探討藥物干預(yù)的時(shí)機(jī)及指導(dǎo)抗腫瘤治療提供優(yōu)良的模型。造模方式簡單易行，對實(shí)驗(yàn)設(shè)備及操作要求較低，與人類的病理發(fā)病情況相符，保證造模的真實(shí)性和實(shí)用性，便于推廣。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示36周是理想的造模周期，若要獲取胃癌前病變的模型，可靈活提前至24周；若要造模時(shí)間更短，可調(diào)整遞增濃度的時(shí)間區(qū)間，不建議再提高遞增的濃度。

使用MNNG誘導(dǎo)胃癌的造模方式，并不斷尋找MNNG最佳濃度以獲得最好的效果。研究發(fā)現(xiàn)，不同月齡大鼠其臟器系數(shù)、組織學(xué)異常及疾病的發(fā)生與年齡呈現(xiàn)出相關(guān)性，因此課題組認(rèn)為，隨著大鼠周數(shù)的改變設(shè)置時(shí)間和濃度區(qū)間，更能保證造模的質(zhì)和量，減少藥物的浪費(fèi)與污染[20]。但如何根據(jù)不同月齡大鼠生理病理差異設(shè)計(jì)出更精準(zhǔn)的區(qū)間，仍然需要大量的后期摸索，各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該根據(jù)自身?xiàng)l件不斷設(shè)計(jì)并積累研究數(shù)據(jù)，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，以供參考。

采用MNNG梯度濃度結(jié)合復(fù)合因素的方法，可成功建立理想的大鼠胃癌模型，此法誘發(fā)率高、周期短、實(shí)驗(yàn)簡單、費(fèi)用低，在大鼠胃癌造模方式中，尤其是在觀察胃癌前病變的發(fā)生和發(fā)展方面，更具優(yōu)勢。