王美娟 吳凌云 郭惠娟 毛林強 張文藝

(常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院 江蘇常州 213164)

0 引言

近年來各類水體富營養(yǎng)化的程度和范圍不斷擴大，針對由此引發(fā)的飲用水安全與生態(tài)環(huán)境惡化等問題[1-2]，在原生態(tài)微生物處理體系中，加入具有高效溶藻功能的微生物菌劑，增強水體的控藻能力，緩解水體富營養(yǎng)化程度，從而改善水質(zhì)[3]。其中干粉菌劑能夠彌補液體菌劑穩(wěn)定性差、不易運輸以及保存時間短等缺點，成為微生物菌劑領(lǐng)域研究熱點。

在干粉菌劑中添加載體，有利于提高菌劑質(zhì)量，使微生物細胞不易流失，并有效屏蔽外界不良環(huán)境因素。由于不同載體對菌體的承載能力與釋放能力不同，選擇正確的載體對干粉菌劑菌體生物量及性能起著至關(guān)重要的作用。優(yōu)良載體中，活性炭具有良好的吸附性能且結(jié)構(gòu)疏松透氣、比表面積大、理化性質(zhì)穩(wěn)定，已被廣泛應(yīng)用于污水處理、土壤修復(fù)、給水凈化等領(lǐng)域[4-6]，是一種良好的載體材料。玉米粉為可再生生物資源，在使用過程中體現(xiàn)出糊化、流變等理化性質(zhì)[7]，可作為微生物菌劑載體。郭健等[8]使用了麥麩、玉米粉、木屑為復(fù)合載體制得降解氯嘧磺隆菌劑，25 ℃下保存40 d，菌劑仍能保持較高的降解效果，證實了玉米粉作為菌劑載體的可行性。小麥粉在原子力顯微鏡下呈現(xiàn)出顆粒狀納米結(jié)構(gòu)形態(tài)，液化后結(jié)構(gòu)多變，不但有直鏈與支鏈結(jié)構(gòu)，還存在環(huán)狀、糜狀等結(jié)構(gòu)[9]，含有豐富的蛋白質(zhì)等物質(zhì)，能有效吸附菌體并為其提供營養(yǎng)物質(zhì)。稻草粉是常見的有機載體，不僅成本低廉，且環(huán)境友好不會造成二次污染。吳金男等[10]的實驗表明稻草粉為吸附載體的菌劑活性較好。

本文以活性炭、玉米粉、小麥粉和稻草粉作為菌劑載體，對溶藻功能菌液體菌劑進行吸附，真空冷凍干燥以制備成干粉菌劑。通過檢測干粉菌劑載體種類、復(fù)合載體比例及長時間存儲過程中粉劑菌群的變化，分析不同載體對溶藻功能菌GHJ成活率、溶藻效果的影響，尋求經(jīng)濟易得、固化效果好的微生物載體，以期為溶藻干粉菌劑的運用及市場投入提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料1.1.1 菌種

實驗所用菌種由課題組前期從太湖自然繁殖的花鲴魚內(nèi)臟(肝、腸等)篩選得到，編號為GHJ(Microbacteriumoleivorans)，于4 ℃環(huán)境中保存[11]。

1.1.2 藻種

實驗藻種為銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa，F(xiàn)ACHB-905)購自武漢水生生物所，活化后接種于BG11培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑與儀器

(1)主要儀器：搖床、離心機、培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、真空冷凍干燥機、島津紫外分光光度計UV-1800等。

(2)試劑：玉米粉、小麥粉、活性炭、稻草粉、牛肉膏、魚粉蛋白胨、瓊脂粉、NaCl等試劑均為分析純或生化純試劑。

1.1.4 培養(yǎng)基

細菌培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；銅綠微囊藻培養(yǎng)采用BG11培養(yǎng)基。

1.2 實驗方法

1.2.1 單一載體菌劑對菌體穩(wěn)定性的影響

為了控制實驗過程中的單一變量，選取體積分數(shù)為10%的蔗糖溶液作為菌劑保護劑，玉米粉、小麥粉、活性炭、稻草粉作菌劑載體，考察不同載體對菌體的存活率的影響。取100 mL經(jīng)20 h發(fā)酵的GHJ菌種子液，加入5 g載體、5 mL保護劑制成105 mL液體菌劑，于120 r/min轉(zhuǎn)速、25 ℃條件下培養(yǎng)約18 h，取1 mL液體菌劑，平板計數(shù)，記錄菌劑中原有的菌體數(shù)量。剩余液體菌劑經(jīng)-40 ℃～-30 ℃真空冷凍干燥48 h，制成溶藻干粉菌劑，配置成與原來液體菌劑相同體積的菌液，平板計數(shù)，計算經(jīng)冷凍干燥后溶藻菌的成活率，計算公式見式(1)：

(1)

1.2.2 單一載體菌劑對溶藻效果的影響

為了考察4種載體制成的不同干粉菌劑對銅綠微囊藻的溶藻效果，取干粉菌劑1 g加入1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)進行活化，將活化24 h的菌劑按菌藻體積比為1∶12投加至相應(yīng)體積的銅綠微囊藻中。采用乙醇提取分光光度計法每24 h測定其葉綠素a(Chla)含量并計算溶藻率(見式(2))，通過Chla含量變化表征溶藻效果。

(2)

1.2.3 溶藻菌劑的SEM圖像分析

將制備好的溶藻干粉菌劑進行鍍金導(dǎo)電處理后，使用電子掃描顯微鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.4 復(fù)合載體菌劑對菌體穩(wěn)定性的影響

將各類載體制成復(fù)合載體，考察復(fù)合載體對菌體存活率的影響。采用Design-expert進行響應(yīng)面設(shè)計實驗方案及分析。

1.2.5 存儲時間對菌劑群落結(jié)構(gòu)變化分析

使用單一載體制備溶藻干粉菌劑存儲于真空密封的鋁箔袋中，置于25 ℃、避光的環(huán)境中保存30 d，將其送往上海天昊生物科技有限公司完成高通量測序，分析長時間存儲對干粉菌劑群落結(jié)構(gòu)的影響。

1.2.6 存儲時間對菌體穩(wěn)定性的影響

使用PBS緩沖溶液將保存了15 d與30 d后的溶藻干粉菌劑進行活化，梯度稀釋、平板計數(shù)保存了15 d與30 d后的干粉菌劑活菌數(shù)，分析其存儲穩(wěn)定性。

1.2.7 存儲時間對菌劑溶藻效果的影響

使用PBS緩沖溶液將保存了15 d與30 d后的溶藻干粉菌劑進行活化，以菌藻體積比為1∶12投加銅綠微囊藻液中，每24 h取樣測定其Chla含量并計算溶藻率，分析存儲時間對菌劑溶藻效果的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶藻菌劑的SEM圖像分析

電子顯微鏡下觀察溶藻干粉菌劑的微觀形態(tài)如圖1所示。添加玉米粉后，由于玉米粉分子間靠氫鍵結(jié)合而排列緊密，間隙很小，即使是水分子也難以滲透進入玉米粉分子，菌體的吸附量有限(圖1(a))；小麥粉加入菌劑中后，小麥粉呈現(xiàn)球狀，粉末細膩，介質(zhì)表面承載了大量菌體，不難看出小麥粉對GHJ菌的吸附能力較好(圖1(b))；活性炭的微孔結(jié)構(gòu)發(fā)達，功能菌不僅能附著在活性炭的表面，其微孔結(jié)構(gòu)中也能附著大量菌體，是十分理想的菌劑載體(圖1(c))；稻草粉做載體時，稻草粉表面凹凸不平，纖維結(jié)構(gòu)較為細長，載體結(jié)構(gòu)幾乎為一個整體，GHJ菌體分散地附著在其表面，附著量較少(圖1(d))。

(a)玉米粉菌劑

2.2 單一載體菌劑對溶藻菌體穩(wěn)定性的影響

不同載體對菌體活菌數(shù)和成活率的影響如圖2所示。從圖2可以看到：活性炭作為載體供溶藻菌GHJ附著時的溶藻菌GHJ成活率最高，為145.53%；稻草粉做載體時成活率僅為55.95%；玉米粉載體GHJ菌成活率達到了72.86%；小麥粉作為載體使得溶藻菌GHJ成活率達到134.69%。其中，活性炭菌劑與小麥粉菌劑活菌數(shù)分別為1.44×109CFU/mL、1.65×109CFU/mL，均高于冷凍干燥前液體菌劑中的活菌數(shù)。

圖2 不同載體對菌體活菌數(shù)和成活率的影響

4種載體中，活性炭的多孔結(jié)構(gòu)吸附效果顯著，在冷凍干燥過程中，蔗糖保護劑的作用下，溶藻菌GHJ成活率效果最好。菌體能夠快速附著在活性炭的吸附點位，在溶解菌劑時，活菌體能容易地從活性炭中釋放出來，這可能與活性炭發(fā)達的微孔結(jié)構(gòu)有關(guān)，具有空腔與通道結(jié)構(gòu)，更適合菌體的吸附、存活與增殖。邊雪等[12]研究證明YBN13菌株可選用活性炭做載體制備菌劑，其菌劑活菌數(shù)能達到《農(nóng)用微生物菌劑》(GB 20287—2006)中的活菌數(shù)目要求?？梢詫⒒钚蕴孔鳛楹罄m(xù)研究中GHJ菌株的附著載體，使得菌劑成活率大大增加。

2.3 單一載體菌劑對溶藻效果的影響

選取玉米粉、小麥粉、活性炭與稻草粉做單一載體制成干粉菌劑后投加到銅綠微囊藻液中，粉劑的控藻效果如圖3所示。空白組Chla含量在實驗范圍內(nèi)保持平穩(wěn)增長趨勢，玉米粉實驗組Chla含量在溶藻的第2 d、第4 d有微小上升的趨勢，其余都整體呈下降趨勢，溶藻率第8 d溶藻率為86.25%，Chla含量為9.28 mg/m3，說明溶藻菌GHJ在玉米粉做載體經(jīng)冷凍干燥制成干粉菌劑后溶藻菌的抑藻效果較好。

圖3 單一載體對溶藻效果的影響

小麥粉實驗組Chla含量在溶藻的前2 d，Chla含量下降的并不明顯，還有略微上升的趨勢，可能是溶藻菌并未完全活化或是活化后受環(huán)境影響較大，溶藻活性較弱。溶藻實驗進行到第5 d Chla含量下降較為明顯，溶藻率上升較大，第8 d溶藻率為92.04%，Chla含量為5.37 mg/m3，溶藻效果顯著。

當(dāng)活性炭作為單一載體制備干粉菌劑時，實驗組的Chla含量在溶藻前4 d呈下降趨勢，第5 d是略有上升，然后繼續(xù)下降直至第8 d，此時溶藻率為92.23%，Chla含量為5.24 mg/m3，溶藻反應(yīng)基本完成，由于在溶藻過程中同時也存在藻類生長的情況，因而存在溶藻過程中Chla含量短暫上升的現(xiàn)象。

稻草粉做載體制成干粉菌劑后投加到銅綠微囊藻液中，實驗組Chla含量在溶藻第2 d、第4 d略有上升，原因可能為溶藻菌的溶藻速率低于銅綠微囊藻的生長速率，從而導(dǎo)致Chla含量上升。第5 d后Chla含量快速下降，第8 d溶藻率為86.18%，Chla含量為9.33 mg/m3。

2.4 復(fù)合載體對菌體成活率的影響

將各類載體制成復(fù)合菌劑，運用響應(yīng)面法考察復(fù)合載體對菌體存活率的影響。實驗設(shè)計4個實驗因素(A，玉米粉含量；B，活性炭含量；C，小麥粉含量；D，稻草粉含量)，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果確定每個因素5個水平，共進行15組實驗。實驗設(shè)計因素及水平見表1。每組復(fù)合載體制備的冷凍干燥前、后菌劑如圖4—圖5所示。

表1 復(fù)合載體實驗方案設(shè)計(實際)

圖4 冷凍干燥前液體菌劑

圖5 冷凍干燥48 h干粉菌劑

以菌體成活率為響應(yīng)值，通過CCD設(shè)計的玉米粉含量、活性炭含量、小麥粉含量、稻草粉含量4因素5水平實驗，得到15組實驗數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 復(fù)合載體實驗數(shù)據(jù)

成活率最高為單一活性炭載體菌劑140.22%，最低為單一稻草粉菌劑55.94%，各種復(fù)合載體菌劑菌體的成活率范圍為57.82%～137.81%。由此可見：復(fù)合載體制成的干粉菌劑中溶藻菌成活率均低于單獨投加活性炭做載體時干粉菌劑的溶藻菌成活率，推測原因為小麥粉與玉米粉顆粒細小，可大面積接觸溶藻菌株，但與微孔結(jié)構(gòu)發(fā)達的活性炭相比，比表面積小于活性炭；此外溶藻細菌GHJ難以附著在纖維豐富的稻草粉載體上，冷凍干燥后菌體損失嚴重。在復(fù)合載體中，活性炭所占比例減少，因此粉劑中功能菌活菌數(shù)減少，成活率降低。

使用Design expert對表2進行多元回歸分析，得到回歸方程：

Y=72.93A+132.00B+140.22C+55.94D-43.37AB-12.05AC-26.49AD+6.77BC+2.81BD-22.23CD+333.10ABC+401.35ABD+189.46ACD+574.57BCD

回歸系數(shù)模型及方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知：回歸系數(shù)模型P=0.002 0(P<0.01)，表明回歸模型顯著；相關(guān)系數(shù)R2=0.974 9(R2>0.9)，表明模型與實際的擬合度較好，該回歸模型可以較好地分析預(yù)測復(fù)合載體制備干粉菌劑菌體的存活情況。

表3 回歸系數(shù)模型及方差分析結(jié)果

2.5 溶藻干粉菌劑的存儲穩(wěn)定性2.5.1 存儲時間對菌體穩(wěn)定性的影響

菌劑的存儲穩(wěn)定性將直接影響菌劑的使用效果，在常溫避光、真空密閉的環(huán)境中保存15、30 d后的4種菌劑菌體成活率如圖6所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，4種菌劑中活菌數(shù)隨著存儲時間的延長而減少，15 d時稻草粉菌劑、玉米粉菌劑、小麥粉菌劑以及活性炭菌劑的成活率分別為80.52%、84.21%、83.83%、78.24%，活性炭菌劑的成活率均低于其余3種載體菌劑，主要是其余3種載體材料均為生物材料，富含纖維、蛋白質(zhì)等有機物，能夠為溶藻菌提供碳源、氮源等能量以維持菌株自身生長與繁殖。而存儲30 d后，活性炭菌劑的活菌數(shù)仍有23.23×108CFU/mL，成活率為63.47%，高于稻草粉菌劑成活率42.01%、玉米粉菌劑成活率39.17%與小麥粉菌劑成活率57.42%，推測在常溫條件下功能菌的新陳代謝較快，此時稻草粉、玉米粉、小麥粉中的營養(yǎng)物質(zhì)幾乎被消耗殆盡，菌株分泌某些代謝產(chǎn)物引起生存環(huán)境發(fā)生變化，直至超過菌體的耐受范圍菌體逐漸死亡，同時雜菌的污染與功能菌株競爭養(yǎng)分也會使得溶藻菌GHJ活菌數(shù)減少。王曄[13]也通過實驗證明以麥麩為載體的菌劑保存10 d后活菌數(shù)快速下降的原因是菌體利用麥麩產(chǎn)生了堿性物質(zhì)，使得菌劑環(huán)境的pH值增加從而導(dǎo)致菌體大量死亡。

2.5.2 存儲時間對菌劑溶藻效果的影響

圖7與圖8分別表示了不同載體菌劑經(jīng)15、30 d保存后處理銅綠微囊藻的溶藻效果。其中以活性炭為載體的溶藻菌劑由于其吸水性強，制備成菌劑后初始活菌數(shù)較多，保存15 d與30 d后溶藻率分別能達到80.05%、71.37%。以稻草粉、玉米粉和小麥粉為載體的菌劑在保存時間為15 d時仍具有良好的溶藻效果，在8 d的溶藻過程中基本可以將銅綠微囊藻去除75%以上，但隨著保存時間延長至30 d，這3種材料為載體的菌劑溶藻效果也隨之下降?？偟膩碚f，經(jīng)過一段保存時間的溶藻干粉菌劑與新制成的菌劑相比，溶藻率均有所下降，其原因是隨著保存時間的增加4種載體菌劑的活菌數(shù)減少，菌劑受雜菌污染后菌效降低。

圖6 存儲時間對活菌數(shù)和成活率的影響

圖7 15 d保存下對溶藻效果的影響

圖8 30 d保存下對溶藻效果的影響

綜上所述，當(dāng)活性炭作為菌劑載體時，存儲30 d后溶藻干粉菌劑不僅成活率最高，溶藻效果也最好，活性炭比表面積大能夠提供一個合適的環(huán)境供菌株吸附與固定，同時可以給予一定的碳源滿足菌株生命活動以維持較好的活性。

2.6 干粉菌劑群落結(jié)構(gòu)變化分析2.6.1 OTU聚類分析

溶藻菌GHJ制成干粉菌劑，保存在常溫避光的環(huán)境中30 d，此過程通常伴隨著功能菌菌體的死亡與雜菌的污染、增殖等問題，導(dǎo)致干粉菌劑中菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化?；诟咄繙y序，對不同載體成份的干粉菌劑菌種多樣性進行分析，計算菌群豐富度指數(shù)，辨別操作分類單元(OTU)，將大于97%的序列相似度劃為同一個OTU，逐條和數(shù)據(jù)庫中基因序列比對。

在以稻草粉做載體的干粉菌劑中，菌劑中的OTU共6種，分布于6個門、6個菌綱、6個菌目、6個菌科、6個菌數(shù)和4個菌種間；在以玉米粉做載體的干粉菌劑中，菌劑中的OTU共5種，分布于5個門、5個菌綱、5個菌目、5個菌科、5個菌數(shù)和5個菌種間；在以小麥粉做載體的干粉菌劑中，菌劑中的OTU共15種，分布于13個門、13個菌綱、12個菌目、13個菌科、11個菌數(shù)和11個菌種間；在以活性炭做載體的干粉菌劑中，菌劑中的OTU共3種，分布于3個門、3個菌綱、3個菌目、3個菌科、3個菌數(shù)和3個菌種間。

2.6.2 多樣性指數(shù)分析

干粉菌劑樣本中的豐富度和多樣性用Alpha多樣性指數(shù)進行評估。每個樣品的覆蓋率、SACE指數(shù)、Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)可以評估樣品中物種的測序深度、豐富度、多樣性[14]。由表4可知：4種載體制備的干粉菌劑樣品種微生物的覆蓋率均高于90%，樣品序列在高通量測序時基本都已測出，說明此次高通量測序結(jié)果可以反映樣品的真實情況。SACE數(shù)值越大，代表物種總數(shù)越多，因此可判定小麥粉做載體時，物種最多，稻草粉、玉米粉次之，活性炭最少，說明活性炭菌劑在30 d的保存過程中，受雜菌污染程度最小。Shannon指數(shù)用來描述種群的個體出現(xiàn)的紊亂和不確定性，Shannon值越大，物種多樣性就越高?；钚蕴烤鷦┲蠸hannon指數(shù)明顯低于其他3種載體菌劑，表明活性炭中細菌群落多樣性低于稻草粉、玉米粉和小麥粉。Simpson指數(shù)用來估算樣本中微生物的多樣性，指隨機取樣兩個個體屬于不同種的概率，Simpson值越大，群落多樣性越低。4種載體中Simpson值由大到小為活性炭>玉米粉>稻草粉>小麥粉，也直接證明了當(dāng)活性炭做載體供溶藻菌附著后，菌劑保存能力較好，干粉菌劑中菌群結(jié)構(gòu)變化不大，不易變質(zhì)。

表4 Alpha多樣性分析

2.6.3 干粉菌劑微生物群落結(jié)構(gòu)門與屬的變化

4種不同載體制備的菌劑經(jīng)30 d存儲后菌群的組成(門水平)如圖9所示。從圖9中可以看出：放線菌門(Actinobacteria)為此次溶藻干粉菌劑中的優(yōu)勢類群，第二大優(yōu)勢類群為厚壁菌門(Firmicutes)。其中，在稻草粉做載體的菌劑中，放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度為85.71%，厚壁菌門(Firmicutes)為14.28%，變形菌門(Proteobacteria)占0.01%。玉米粉做載體的干粉菌劑群落組成中，Actinobacteria占89.88%，F(xiàn)irmicutes占10.06%，Proteobacteria占0.06%。小麥粉做載體的干粉菌劑群落組成中，Actinobacteria占8.45%，F(xiàn)irmicutes占79.85%，Proteobacteria占10.36%。Unassigned占0.74%，Cyanobacteria/chloroplast占0.6%。活性炭做載體的干粉菌劑群落組成中Actinobacteria占90.69%，F(xiàn)irmicutes占9.29%，Proteobacteria占0.02%。由此推斷，當(dāng)干粉菌劑在常溫避光情況下長時間存儲后，小麥粉由于吸水性強，存儲時間越長，干粉菌劑中水分越大，易生霉變質(zhì)，被其他雜菌污染。

圖9 4種載體菌劑微生物群落結(jié)構(gòu)分布圖(門水平)

不同載體種類溶藻干粉菌劑的細菌類群屬(屬水平)變化差異見圖10。溶藻干粉菌劑中功能菌GHJ鑒定為Microbacteriumoleivorans，屬于微桿菌屬(Microbacteriumsp.)。4種菌劑中Microbacterium為菌劑中的優(yōu)勢種，在稻草粉菌劑、活性炭菌劑及玉米粉菌劑中含量最豐富，而小麥粉菌劑中功能菌所在屬的相對豐度卻很低，Bacillus的豐度較高，為小麥粉菌劑最主要的優(yōu)勢類群。此外小麥粉菌劑中還存在Comamonas、Pseudomonas、Acinetobacter、Streptophyta等類群，表明小麥粉菌劑受雜菌污染程度較重，溶藻功能菌生長受到限制。

圖10 4種載體菌劑微生物群落結(jié)構(gòu)分布圖(屬水平)

3 結(jié)論

(1)通過比較不同載體及其制備溶藻干粉菌劑的性能，確認活性炭對功能菌的吸附與釋放能力均較好，最適于用作菌株GHJ干粉菌劑載體，菌劑中功能菌的成活率高，溶藻效果好。

(2)采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化復(fù)合載體比例，確認復(fù)合載體菌劑低于活性炭作為單一載體的干粉菌劑的溶藻菌成活率，因此復(fù)合載體對菌株GHJ保存作用并不明顯。

(3)活性炭制備的溶藻干粉菌劑常溫避光保存30 d后，發(fā)現(xiàn)功能菌成活率最高，溶藻效果最好，且菌劑中物種豐富度少，群落多樣性低，由此推斷活性炭載體菌劑不易變質(zhì)，受雜菌污染程度低，保存較好。