熊亮斌 孫吉 劉顯舟 屈占國 計雨情 徐一新 王風清

（1. 上海健康醫(yī)學院協(xié)同科研中心/藥學院，上海 201318；2. 華東理工大學生物工程學院，上海 200237）

甾體藥物是僅次于抗生素的第二大類藥物，具有抗炎、抗過敏、抗病毒和神經(jīng)保護［1］等眾多突出功效。目前，市售甾體藥物達400余種，銷售額超1 000億美元，約占全球醫(yī)藥總銷售額的10%，我國是甾體原料藥及制劑的主要供應國，產(chǎn)量占世界1/3以上［2］。利用分枝桿菌等微生物代謝轉(zhuǎn)化低值的植物甾醇（油脂加工廢料、造紙廢料等的回收提取物）［3］，獲得甾體藥物中間體的過程，是現(xiàn)行甾體藥物生產(chǎn)工藝的基礎步驟。通過對分枝桿菌內(nèi)源甾醇代謝途徑的阻斷，可獲得一系列具有重要價值的甾體藥物中間體轉(zhuǎn)化菌株，如C19甾體（雄甾-4-烯-3，17-二酮，AD；寶丹酮，BD；9α-羥基化-雄甾 -4-烯 -3，17-二酮，9-OHAD）［4-5］和 C22 甾體（22-羥基 -23，24-去甲膽甾 -1，4-二烯 -3-酮，4-HBC）［6］等。隨后，結(jié)合化學及微生物轉(zhuǎn)化，可獲得包括腎上腺皮質(zhì)激素、孕激素等幾乎所有種類的臨床用甾體藥物［7］。

分枝桿菌可利用甾醇作為生長及生理代謝唯一的碳和能量來源［8-9］。通常，野生型分枝桿菌可完全降解甾醇，此過程無明顯的中間代謝物積累［8-9］。當阻斷甾醇代謝途徑后，對甾醇底物的不完全降解，將導致9-OHAD等中間代謝物的大量積累。鑒于此類中間產(chǎn)物可能存在的細胞毒性，此時，轉(zhuǎn)化菌株的呼吸、生長及生理代謝將發(fā)生一系列的適應性反應，以應對不利的細胞內(nèi)外環(huán)境［10］。然而，聚焦于分枝桿菌轉(zhuǎn)化甾醇過程的中心代謝途徑相關(guān)研究尚有欠缺，有必要針對性探究此過程的內(nèi)在調(diào)節(jié)機制。

前期研究發(fā)現(xiàn)，分枝桿菌的SigD因子可能是參與甾醇代謝調(diào)節(jié)的負調(diào)控因子，刪除該基因?qū)⒁痃薮纪緩疥P(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，從而在一定程度上增強菌體對甾醇的轉(zhuǎn)化和目標產(chǎn)物積累［11-12］。此外，甾醇代謝途徑缺陷型的分枝桿菌，在以甾醇為唯一碳源時，無法正常生長；而當同時存在葡萄糖和甾醇時，其細胞生長和代謝甾醇的能力均可迅速恢復，此現(xiàn)象表明分枝桿菌生理代謝調(diào)控機制的復雜性。本研究選取可轉(zhuǎn)化甾醇積累9-OHAD的工程菌株，利用轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)合qRT-PCR技術(shù)，分析中心代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，通過測定在甾醇轉(zhuǎn)化過程的糖代謝速率變化趨勢，初步揭示分枝桿菌的適應性代謝調(diào)節(jié)規(guī)律，以期為后續(xù)工程菌株的升級改造提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株質(zhì)粒及引物 本研究所涉及的菌株及質(zhì)粒如表1所示。新金分枝桿菌Mycobacterium neoaurum ATCC 25795（Mn）購自美國國家菌種保藏中心。9-OHAD初始生產(chǎn)菌株（MnΔkstD1）均由本實驗室姚抗等［4］構(gòu)建。用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化擴增的大腸桿菌Escherichia coli DH5α購自天根生化科技（北京）有限公司。本研究用于構(gòu)建自殺質(zhì)粒的p2NIL及pGOAL19質(zhì)粒，為英國傳染病研究所的T. Parish博士惠贈。本研究使用的引物如表2所示。

表1 本研究涉及的菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究涉及的引物Table 2 Primers used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母提取物 5 g/L?；九囵B(yǎng)基：NH4NO32 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，檸檬酸鐵銨 0.05 g/L，pH 7.5。種子培養(yǎng)基：甘油 20 g/L，檸檬酸 2.0 g/L，NH4NO32.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，檸檬酸鐵銨 0.05 g/L，pH 7.5。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，檸檬酸2 g/L，NH4NO32 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，檸檬酸鐵銨0.05 g/L，pH 7.5。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 大腸桿菌DH5α接種于5 mL LB培養(yǎng)基，37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)，按需求加入卡那霉素（50 μg/mL）或潮霉素（50 μg/mL）。分枝桿菌的培養(yǎng)：首先，取甘油菌或挑取單克隆，接種于5 mL LB培養(yǎng)基，30℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600= 1.2-1.8；隨后，按1∶10（V/V）接種于30 mL種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600= 1.2-1.8。如需進行表型鑒定，可取種子培養(yǎng)液，按1∶10（V/V）接種于基本培養(yǎng)基，再添加無菌葡萄糖、膽固醇或植物甾醇。如需進行甾醇轉(zhuǎn)化測定，則取種子培養(yǎng)液，按1∶10（V/V）接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，同時添加無菌植物甾醇。

1.2.2 kstD1敲除菌株的構(gòu)建 本菌株由姚抗等［4］構(gòu)建，大致流程如下：（1）引物設計（表2）。在M.neoaurum ATCC 25795基 因 組（GenBank Accession No. NZ_JMDW00000000.1）查找定位kstD1基因的位 置（GenBank：NZ_JMDW01000019.1 Region：123054…121522，1 533 bp），分別設計上游同源臂引物D-kstD1-UF & D-kstD1-UR，下游同源臂引物D-kstD1-DF & D-kstD1-DR。（2）同源臂擴增。利用高保真PrimerSTAR Max DNA聚合酶（寶生物工程有限公司），以新金分枝桿菌Mn總基因組為模板，進行PCR擴增；隨后，采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收，獲得上下游同源臂。（3）同源臂及p2NIL質(zhì)粒酶切。分別利用Hind III & Pst I或Pst I & Kpn I雙內(nèi)切酶體系，對上下游同源臂純化產(chǎn)物進行酶切；同時，利用Hind III & Kpn I酶切p2NIL質(zhì)粒提取物。（4）構(gòu)建p2NIL-同源臂重組質(zhì)粒。利用T4 DNA連接酶連接p2NIL及上下游同源臂的酶切產(chǎn)物，獲得重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，以D-kstD1-UF & D-kstD1-DR驗證獲得陽性克隆。（5）構(gòu)建pGOAL19-同源臂重組質(zhì)粒。利用Pac I酶切pGOAL19質(zhì)粒提取物，凝膠電泳回收分子量較大的酶切條帶（7 949 bp）；同時，利用Pac I酶切p2NIL-同源臂重組質(zhì)粒提取物，純化回收；隨后，利用T4 DNA連接酶連接，獲得自殺質(zhì)粒p19-kstD1，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，篩選獲得陽性克隆，即為可用于kstD1基因刪除的自殺質(zhì)粒。采用電轉(zhuǎn)化的方式，將自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)入分枝桿菌感受態(tài)細胞，通過兩步篩選獲得kstD1基因缺失的菌株［13］。

1.2.3 轉(zhuǎn)化能力評估［11］按1.2.1方法準備種子培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，測試kstD1基因缺失菌株轉(zhuǎn)化甾醇積累9-OHAD的能力。培養(yǎng)條件為30℃，220 r/min，培養(yǎng)時間120 h，每隔24 h取樣500 μL。待取樣完畢，以500 μL乙酸乙酯振蕩萃取，12 000× g，離心10 min。取上層萃取液，可用于薄層色譜法（TLC）分析；展開劑為石油醚∶乙酸乙酯 =6∶4，跑板后風干，以20%稀硫酸噴淋表面，隨后置于105℃烘箱，顯色約6-8 min。高效液相色譜（HPLC）分析：取上層萃取液，置于1.5 mL離心管風干，加入HPLC級甲醇重溶，12 000 × g，離心10 min，以0.22 μm微孔濾膜過濾，即可用于HPLC分析。HPLC參數(shù)如下：色譜柱Agilent XDB-C18（250 mm × 4.6 mm），進樣體積10 μL，流動相為甲醇∶水 = 8∶2，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長254 nm。

1.2.4 RNA提取、轉(zhuǎn)錄組測序及qRT-PCR分析［11］分枝桿菌總RNA的提取步驟按FastRNA Pro Blue RNA試劑盒，及FastPrep-24 樣品處理系統(tǒng)（MP Biomedicals，美國）說明書進行。利用FastQuant cDNA試劑盒（天根生化科技有限公司，北京），對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄；采用Quant one step qRTPCR Kit（SYBR Green）（天根生化科技有限公司，北京）進行qRT-PCR分析實驗。菌株發(fā)酵轉(zhuǎn)化條件下培養(yǎng)24 h取樣，收集約含1010個細胞的培養(yǎng)液（OD600= 1.0，細胞濃度約為1 × 109cells/mL，此時取10 mL培養(yǎng)液，細胞數(shù)約為1010個；若OD600= 2.0，則需取5 mL培養(yǎng)液，細胞數(shù)約為1010個，依此類推），4 000×g，4℃離心15 min，收集菌體。隨后，按試劑盒說明書步驟，進行破菌，提取總RNA，去除cDNA，反轉(zhuǎn)錄，送上海華大基因科技有限公司測序，或開展qRT-PCR分析。

1.2.5 葡萄糖含量的測定 按葡萄糖含量檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說明書要求，稍加調(diào)整測定培養(yǎng)液殘留葡萄糖濃度。取培養(yǎng)液1 mL，離心收集上清，按20 μL樣品液，20 μL試劑一、160 μL試劑二和試劑三的混合液（即用即配，1∶1比例混合）配制測定體系；同時，設置陽性對照和陰性對照，此外，利用試劑盒中的葡萄糖標準品配制標準曲線測定孔。隨后，將混合液放入37℃靜置孵育15 min，于505 nm波長讀取吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 缺失kstD1基因的9-OHAD初始生產(chǎn)菌株構(gòu)建結(jié)果

基于同源重組無標記刪除技術(shù)，利用目的基因上游同源臂正向引物D-kstD1-UF和下游同源臂反向引物D-kstD1-DR，進行PCR擴增驗證。結(jié)果如圖1-A所示，標記為Mn的泳道則為未發(fā)生同源重組的原始菌株P(guān)CR擴增結(jié)果，而標記為MnΔk1的泳道即為缺失kstD1基因的分枝桿菌菌株P(guān)CR擴增結(jié)果。隨后，采用發(fā)酵轉(zhuǎn)化評估顯示，所獲得的MnΔk1菌株，具有轉(zhuǎn)化甾醇積累9-OHAD中間產(chǎn)物的能力（圖 1-B）。

圖1 刪除kstD1基因的分枝桿菌PCR驗證及轉(zhuǎn)化甾醇結(jié)果Fig. 1 Effect of deleting kstD1 on the Mycobacterium PCR verification and biotransformation of sterols

2.2 中心代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄分析

為研究分枝桿菌在代謝甾醇積累甾體藥物中間體時，轉(zhuǎn)化菌株的糖酵解、磷酸戊糖等中心代謝途徑的響應調(diào)節(jié)機制。利用上述步驟獲得具有代表性的9-OHAD轉(zhuǎn)化菌株MnΔk1，在添加1 g/L甾醇底物的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化24 h，分析測定其與野生型菌株的轉(zhuǎn)錄差異情況。

結(jié)果顯示，（1）在野生型菌株添加甾醇時，如采用轉(zhuǎn)錄上調(diào)或下調(diào)2倍為閾值（Log2值≥1或≤-1），分別有琥珀酸脫氫酶復合體D亞基的編碼基因sdhD（2.63），琥珀酸脫氫酶復合體C亞基sdhC（2.52），琥珀酰輔酶A合成酶β亞基sucC（1.25）和果糖-1，6-二磷酸酶glpX（1.13）等出現(xiàn)明顯的轉(zhuǎn)錄上調(diào)；另有6-磷酸果糖激酶pfkB（-2.85），烏頭酸酶acn（-1.15），檸檬酸合酶citA（-1.14）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶zwf（-1.12）等出現(xiàn)顯著的轉(zhuǎn)錄下調(diào)（圖2-A）。（2）當MnΔk1菌株轉(zhuǎn)化甾醇積累9-OHAD產(chǎn)物時，我們注意到琥珀酰輔酶A合成酶α亞基sucD，琥珀酸脫氫酶復合體A亞基sdhA，琥珀酸脫氫酶復合體B亞基sdhB，蘋果酸合酶glcB等基因的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)進一步上調(diào)，相對野生型菌株，分別提高2.10、1.48、1.29和1.17（圖2-B）。上述結(jié)果表明，缺失kstD1的分枝桿菌菌株在轉(zhuǎn)化甾醇積累9-OHAD過程中，中心代謝途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)規(guī)律性轉(zhuǎn)錄擾動。

圖2 分枝桿菌轉(zhuǎn)化甾醇過程中心代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄對比分析Fig. 2 Transcriptional comparisons of genes related in central metabolism pathways during the sterol transformation in Mycobacterium

2.3 中心代謝限速步驟關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的qRTPCR驗證

為確認MnΔk1菌株在轉(zhuǎn)化甾醇積累甾體藥物中間體的過程中，中心代謝限速步驟關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢，隨后按發(fā)酵轉(zhuǎn)化條件培養(yǎng)菌體，于24 h取樣提取總RNA，根據(jù)16s rRNA序列設計內(nèi)參引物，分析了中心代謝途徑關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平變化。

結(jié)果如圖3所示，除未定位到的關(guān)鍵基因之外，在9-OHAD生產(chǎn)菌株MnΔk1中，糖酵解途徑的6-磷酸果糖激酶pfkB基因（下調(diào)1.96倍），丙酮酸激酶pyk基因（下調(diào)1.49倍）；磷酸戊糖途徑的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶zwf基因（下調(diào)3.57倍），6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶gntZ基因（下調(diào)2.43倍）；三羧酸循環(huán)的檸檬酸合酶citA基因（下調(diào)2.5倍），異檸檬酸脫氫酶icd2基因（下調(diào)1.78倍），酮戊二酸脫氫酶kdg基因（下調(diào)1.92倍）等限速步驟關(guān)鍵基因，均出現(xiàn)了較為明顯的轉(zhuǎn)錄下調(diào)。

圖3 中心代謝關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄的qRT-PCR分析結(jié)果Fig 3 qRT-PCR analysis of key genes in central metabolism

2.4 甾醇轉(zhuǎn)化過程中葡萄糖代謝速率的變化測定

為評估轉(zhuǎn)化甾醇過程中分枝桿菌對葡萄糖的代謝情況，我們測定了單位濕重菌體的葡萄糖消耗速率。結(jié)果如圖4所示，相對野生型Mn菌株，MnΔk1菌株對葡萄糖的利用速率分別低64.9%（24 h）和19.8%（48 h）。隨著轉(zhuǎn)化時間的延長，在發(fā)酵體系中，葡萄糖消耗殆盡，葡萄糖代謝速率逐漸趨于零。

圖4 分枝桿菌轉(zhuǎn)化甾醇過程的葡萄糖代謝速率變化Fig. 4 Metabolic rate of glucose during the sterol bioconversion in Mycobacterium

3 討論

分枝桿菌遭遇不良的外環(huán)境時，菌體內(nèi)的眾多調(diào)控基因可迅速響應pH、溶氧、離子濃度等壓力脅迫，通過調(diào)整自身的營養(yǎng)代謝或表面結(jié)構(gòu)等，以適應外環(huán)境的劇烈變化［14-17］。例如，酸性環(huán)境可使分枝桿菌生長明顯減緩，而如果對其中的雙組分調(diào)控系統(tǒng)PhoP-PhoR進行功能刪除，菌體內(nèi)部發(fā)生代謝重構(gòu)，又可部分恢復正常的生理代謝功能［18］。分枝桿菌代謝甾醇獲得甾體藥物中間體的反應過程，關(guān)鍵限速步驟在于菌體內(nèi)源代謝途徑對底物的轉(zhuǎn)化效率。通過強化途徑關(guān)鍵酶基因的表達，理論上可改善菌體對底物的轉(zhuǎn)化［11，19］。然而，由于甾體中間產(chǎn)物可能存在的細胞毒性，大量積累甾體藥物中間體的過程，正是形成負反饋抑制菌體生理代謝的不利因素之一［10］，菌體很可能通過減弱呼吸代謝等一系列適應性調(diào)節(jié)機制，以降低對外環(huán)境物質(zhì)和能量的交換，然而此類適應性調(diào)節(jié)機制很可能對底物轉(zhuǎn)化速率產(chǎn)生負面影響，從而降低了目標產(chǎn)物的積累效率。

本研究集中分析了9-OHAD的轉(zhuǎn)化菌株MnΔk1，在代謝甾醇積累中間體過程的中心代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄差異變化。結(jié)果顯示，在菌株轉(zhuǎn)化甾醇積累9-OHAD中間體的中前期，糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑和三羧酸循環(huán)限速步驟的關(guān)鍵基因，出現(xiàn)普遍的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，表明在葡萄糖和甾醇同時存在的轉(zhuǎn)化階段，MnΔk1菌株對前者的利用很可能受其內(nèi)在調(diào)控機制作用而受到一定程度的抑制。此階段，菌體很可能通過抑制中心代謝途徑的效率，降低細胞的基礎代謝，以減弱甾體藥物相關(guān)中間體積累對細胞造成的壓力（圖5）。隨后，通過對葡萄糖消耗速率的測定，在發(fā)酵轉(zhuǎn)化的前期，MnΔk1菌株對葡萄糖的平均消耗速率明顯低于Mn菌株；而在轉(zhuǎn)化階段的中后期，由于葡萄糖消耗殆盡，菌體對葡萄糖的消耗速率也逐漸趨于接近，說明在復合碳源條件下，分枝桿菌很可能存在一些適應性調(diào)控機制，以應對胞外不斷變化的復雜外環(huán)境。

圖5 分枝桿菌甾醇代謝與中心代謝途徑的關(guān)聯(lián)簡圖Fig. 5 Schematic diagram of sterol metabolism pathway and central metabolism pathway in Mycobacterium

4 結(jié)論

本研究以新金色分枝桿菌Mycobacterium neoaurum ATCC 25795為研究對象，通過同源重組刪除kstD1基因，獲得可轉(zhuǎn)化甾醇積累甾體藥物中間體9-OHAD的工程菌株。分枝桿菌在轉(zhuǎn)化積累目標甾藥中間體時，中心代謝途徑限速步驟的關(guān)鍵基因在轉(zhuǎn)錄水平受到明顯的抑制性調(diào)控，揭示了分枝桿菌轉(zhuǎn)化甾醇過程的適應性調(diào)節(jié)機制。