黃玉喜 程順利 赫玲玲 肖進(jìn)彬 任秋鶴 彭子涵 周振 方玉美

（河南省高新技術(shù)實業(yè)有限公司，鄭州 450002）

鉻（chromium）是一種常見的化工原料，在制革、鉻鹽生產(chǎn)、不繡鋼加工及油漆和涂料制造業(yè)等工業(yè)生產(chǎn)中使用極其廣泛［1］。我國作為世界上鉻鹽產(chǎn)量大國，在從事生產(chǎn)活動的同時也產(chǎn)生了大量的含鉻廢渣和廢液，造成了土壤及水資源的重金屬污染［2］。鉻在自然環(huán)境中有Cr（VI）和Cr（III）2種穩(wěn)定價態(tài)。Cr（VI）是強氧化劑，具有較強的毒性，可引發(fā)生物誘變、癌變。由于Cr（VI）具有較高的遷移能力，導(dǎo)致其極易對土壤、地表水及地下水造成污染［3］。Cr（III）的毒性遠(yuǎn)小于Cr（VI），且有研究表明，適量的Cr（III）對人體健康有益，有利于胰島素發(fā)揮作用，維持正常糖代謝，促進(jìn)造血功能［4］。當(dāng)環(huán)境pH＞5時，Cr（III）則會形成灰綠色的氫氧化鉻沉淀，進(jìn)而大大降低了其遷移能力［5-6］。因此，目前國內(nèi)外常用的應(yīng)對鉻污染手段大致可分為兩類，一類是直接去除Cr（VI）；另一類是將Cr（VI）轉(zhuǎn)化為Cr（III），使鉻以沉淀物的形式穩(wěn)定存在。

在解決鉻污染問題上，國內(nèi)外使用的研究方法以物理法和化學(xué)法居多。Selvi等［7］通過活性炭吸附法得到在酸性條件下，當(dāng)活性炭粒徑為125-250 μm時，對 Cr（VI）的吸附量可達(dá) 3.46 mg/g。Cavaco等［8］使用離子交換法，有效去除了電鍍鉻工業(yè)廢水中殘留的Cr（VI）。劉芳［9］指出在重金屬還原沉淀的過程中pH的控制極其重要，其采用還原沉淀法探究了幾種常用還原劑在還原Cr（VI）過程中的最適pH，簡化了工藝流程，降低了還原成本。Frenzel等［10］通過電化學(xué)法，使用碳?xì)蛛姌O高效地還原了低濃度的鉻酸鈉溶液，且研究表明，該方法對鉻酸鹽的還原成本較常規(guī)化學(xué)法節(jié)省30%。虞少嵚等［11］利用電絮凝法，使含鉻廢水中總鉻和Cr（VI）的去除率均提升到了99.5%，并通過周期轉(zhuǎn)向手段解決電極鈍化問題的同時大大降低了反應(yīng)的電能消耗。盡管如此，傳統(tǒng)的物理法及化學(xué)法在解決鉻污染的過程中始終無法徹底解決能耗高及二次污染等技術(shù)難題。

隨著微生物學(xué)研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)某些微生物在自身防御機制的作用下出現(xiàn)Cr（VI）的耐受性，且在其生長代謝過程中可以將Cr（VI）還原 Cr（III）［12］。微生物還原 Cr（VI）由于具有節(jié)約能源和無二次污染等特點而逐漸在解決鉻污染問題上得到了應(yīng)用。Romanenko等［13］在1977年首次分離得到具有Cr（VI）還原能力的脫色桿菌（Bac.Dechromaticans）。 隨 后 越 來 越 多 的 具 有 Cr（VI）還原能力的細(xì)菌類微生物如Bacillus cereus S5.4，Bacillus cereus等，及真菌類微生物如Aspergillus niger、Rhizopus sp.等被陸續(xù)報道出來［14-17］。但是未見有關(guān)于寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas sp.）和膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）還原 Cr（VI）的相關(guān)報道，且報道的微生物多見還原能力較低。

本研究以寡養(yǎng)單胞菌和膠凍樣芽孢桿菌為研究對象，探索其對Cr（VI）的還原能力及還原特性，以期填充可還原Cr（VI）的微生物種類研究空白，豐富微生物法解決鉻污染理論體系。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用菌種為購于北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司的寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas sp.）和購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心的膠凍樣芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）；試驗所用藥品包括：重鉻酸鉀（K2Cr2O7，純度≥99.8%）、二苯碳酰二肼、丙酮、硫酸和磷酸。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、酵母浸粉5.0 g、H2O 1 L，pH使用1 mol/L的NaOH調(diào)至7.0左右。固體培養(yǎng)基再按1.5%-2.0%的比例加入瓊脂粉，121℃高溫滅菌 30 min［18］。

菌懸液的制備：在超凈工作臺中，將保存的寡養(yǎng)單胞菌和膠凍樣芽孢桿菌分別接種到液體LB培養(yǎng)基中后，置于恒溫30℃、轉(zhuǎn)速150 r/min的搖床中，分別培養(yǎng)24和18 h進(jìn)入對數(shù)生長期。

1.2 方法

1.2.1 不同Cr（VI）濃度對菌株生長的影響 向液體LB培養(yǎng)基中加入不同劑量的重鉻酸鉀儲備液，配制梯度Cr（VI）濃度的培養(yǎng)基：50、100、200、400、600、800和1 000 mg/L。將2株對數(shù)生長期的微生物以10%的接種量接種至含Cr（VI）培養(yǎng)基，置于恒溫30℃、轉(zhuǎn)速150 r/min的搖床中連續(xù)培養(yǎng)，每12 h取樣一次，檢測其中培養(yǎng)液在600 nm出的吸光值及Cr（VI）的濃度。根據(jù)Cr（VI）對其的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），考察其對 Cr（VI）的耐受能力［19］。

1.2.2 菌株對Cr（VI）還原量測試 將對數(shù)生長期的2株菌株以10%的接種量，分別接種入Cr（VI）濃 度 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140和150 mg/L的LB培養(yǎng)基，置于恒溫30℃、轉(zhuǎn)速150 r/min的搖床中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)72 h，根據(jù)其對Cr（VI）的最大還原量，考察其可最大程度還原Cr（VI）的濃度值。

1.2.3 不同初始pH和電子供體對菌株還原Cr（VI）的影響 向液體LB培養(yǎng)基中加入重鉻酸鉀儲備液，配制含有50 mg/L Cr（VI）的液體LB培養(yǎng)基，使用1 mol/L NaOH溶液分別調(diào)節(jié)不同培養(yǎng)基的初始pH為5、6、7、8和 9，在恒溫 30℃、轉(zhuǎn)速150 r/min的搖床中連續(xù)培養(yǎng)72 h，每12 h檢測一次培養(yǎng)液中Cr（VI）的濃度。

參考在其他種類微生物研究進(jìn)展中對微生物還原Cr（VI）能力提升較好的電子供體種類［20-21］，將菌株以10%的接種量接種在含有乙酸鈉、乳酸鈉、葡萄糖（COD=50 mg/L）的液體LB培養(yǎng)基中，在恒溫30℃、轉(zhuǎn)速150 r/min的搖床中連續(xù)培養(yǎng)72 h，每12 h檢測一次培養(yǎng)液中Cr（VI）的濃度。培養(yǎng)基中均含有 50 mg/L 的 Cr（VI），pH=8。

以上試驗每個處理設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.4 檢測分析方法 采用二苯碳酰二肼分光光度法（GB/T 7467-1987）測定培養(yǎng)基中的Cr（VI）濃度。將樣品搖勻后，取5 mL懸濁液，其中3 mL用于OD值的測定，另外2 mL置于離心管中，4 000 r/min離心10 min后，取上清液進(jìn)行Cr（VI）濃度的測定。

掃描電鏡樣品制備方法：取1 mL懸濁液置于離心管中4 000 r/min離心10 min，棄上清液后用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，反復(fù)清洗2次，進(jìn)行固定、漂洗、脫水、干燥后，取適量樣品，進(jìn)行離子濺射儀噴金，隨后放入掃描電鏡（SEM，JSM-6510）樣品臺觀察重鉻酸鉀脅迫前后的菌體的形貌變化，并拍照記錄［22］。

使用X射線光電子能譜儀（XPS，K-alpha 250Xi）進(jìn)行能譜分析，試驗參數(shù)：X射線激發(fā)源為單色Al Kα（hv=1 486.6 eV），功率150 W，X射線分析區(qū)域為400 μm，能量分析器固定透過能為30 eV［23-24］。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 相關(guān)計算公式如下：

式 中 ：ω 為 Cr（VI）的 去 除 率 ；v為 Cr（VI）的還原速率，mg/（L·h）；C0為初始 Cr（VI）的濃度，mg/L；Ct為t時刻Cr（VI）的濃度，mg/L；Δt為還原反應(yīng)時間，h。使用Image J軟件測量微生物長度及直徑。相關(guān)數(shù)據(jù)分析使用SPSS 25.0和Origin 8.0軟件處理完成。

2 結(jié)果

2.1 最小抑菌濃度

通過對Cr（VI）的還原能力的檢測，結(jié)果表明，2株微生物的生長活性均隨Cr（VI）濃度的升高而呈降低趨勢（圖1），寡養(yǎng)單胞菌在Cr（VI）濃度小于400 mg/L時生長沒有影響，且400 mg/L的Cr（VI）濃度脅迫下尚能存活，但是，當(dāng)Cr（VI）濃度超過400 mg/L時，其生長則受到明顯的抑制作用（圖1-A）。膠凍樣芽孢桿菌在Cr（VI）濃度小于200 mg/L時生長沒有影響，且200 mg/L的Cr（VI）濃度脅迫下尚能存活，但是，當(dāng)Cr（VI）濃度超過200 mg/L時，其生長則受到明顯的抑制作用（圖1-B）。由此推測，寡養(yǎng)單胞菌和膠凍樣芽孢桿菌的MIC分別為400和200 mg/L，寡養(yǎng)單胞菌對Cr（VI）的耐受性顯著高于膠凍樣芽孢桿菌（P＜0.05）。

圖1 不同Cr（VI）濃度對微生物生長的影響Fig.1 Effect of different Cr（VI）concentration on the growth of microorganisms

2.2 最大還原量與可完全還原Cr（VI）的最大濃度

兩株微生物對Cr（VI）的還原量均隨著初始Cr（VI）濃度的升高呈現(xiàn)先增加再減少的趨勢。寡養(yǎng)單胞菌在初始Cr（VI）濃度為110 mg/L時，72 h內(nèi)其還原量達(dá)到最大，為60.7 mg/L，Cr（VI）去除率為55.2%（圖2-A）。

圖2 兩株微生物對Cr（VI）的最大還原量Fig.2 Maximum reduction of Cr（VI）by two species of microorganisms

膠凍樣芽孢桿菌在初始Cr（VI）濃度為80 mg/L時，72 h內(nèi)其還原量達(dá)到最大，為28.1 mg/L，Cr（VI）去除率為35.1%（圖2-B）。寡養(yǎng)單胞菌對Cr（VI）的最大還原量顯著大于膠凍樣芽孢桿菌（P＜0.05）。初始Cr（VI）濃度的升高一定程度上降低了微生物的活性，進(jìn)而減弱了其還原Cr（VI）的能力。

由圖3可知，2種微生物在低濃度可實現(xiàn)完全還原Cr（VI），隨初始Cr（VI）濃度的升高開始出現(xiàn)Cr（VI）的剩余。寡養(yǎng)單胞菌可完全還原的最大Cr（VI）濃度區(qū)間為40-50 mg/L，膠凍樣芽孢桿菌可完全還原Cr（VI）的最大濃度區(qū)間為10-20 mg/L，為探究2株微生物可完全還原的Cr（VI）最大濃度，在上述濃度區(qū)間內(nèi)設(shè)置梯度濃度分別接種2菌種，連續(xù)培養(yǎng)72 h，每12 h取樣一次，最終得到2株微生物可完全還原Cr（VI）的最大濃度（圖 4）。

圖4 可完全降解最大Cr（VI）濃度Fig.4 Maximum Cr（VI）concentration that can be completely degraded

在反應(yīng)72 h內(nèi)，寡養(yǎng)單胞菌可完全還原的最大Cr（VI）濃度為45.5 mg/L，膠凍樣芽孢桿菌可完全還原的最大Cr（VI）濃度為18.5 mg/L。對Cr（VI）完全還原的意義在于，對重金屬污染處理的徹底性。根據(jù)我國污水的排放標(biāo)準(zhǔn)Cr（VI）濃度需小于0.5 mg/L，因此，寡養(yǎng)單胞菌可完全解決50 mg/L以下的Cr（VI）污染。

在還原速率方面，反應(yīng)48 h內(nèi)，寡養(yǎng)單胞菌對Cr（VI）的去除率達(dá)88.1%，還原速率為0.84 mg/（L·h），膠凍樣芽孢桿菌對Cr（VI）的去除率為70.9%，還原速率為0.28 mg/（L·h）。反應(yīng)48 h內(nèi)寡養(yǎng)單胞菌的還原速率遠(yuǎn)大于膠凍樣芽孢桿菌，48-72 h間2菌種的還原速率相當(dāng)，均為0.22 mg/（L·h）。

2.3 初始pH對微生物還原Cr（VI）的影響

設(shè)置初始pH分別為5、6、7、8和9，將2菌種按照10%的接種量，分別接種入Cr（VI）濃度50 mg/L的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)72 h，每12 h取樣一次，得到各初始pH條件下微生物對Cr（VI）的去除率（圖5）。

圖5 初始pH對微生物還原Cr（VI）的影響Fig.5 Effect of initial pH on the reduction of Cr（VI）by microorganisms

初始pH對寡養(yǎng)單胞菌和膠凍樣芽孢桿菌還原Cr（VI）的影響從優(yōu)至劣依次均為 ：pH 8＞pH 7＞pH 9＞pH 6＞pH 5。其中，寡養(yǎng)單胞菌還原 Cr（VI）的最適pH為8，反應(yīng)72 h內(nèi)對Cr（VI）的去除率達(dá)到了98.1%。膠凍樣芽孢桿菌還原Cr（VI）的最適pH為7-8，反應(yīng)72 h內(nèi)對Cr（VI）的去除率為49.2%，在pH 8的環(huán)境下，反應(yīng)前12 h膠凍樣芽孢桿菌的去除率與寡養(yǎng)單胞菌相當(dāng)，隨后去除率始終低于寡養(yǎng)單胞菌。

2.4 不同電子供體對還原速率的影響

通過在反應(yīng)體系中分別加入乙酸鈉、乳酸鈉、葡萄糖（COD=50 mg/L），考察不同電子供體對微生物還原Cr（VI）的影響（圖6）。

圖6 不同電子供體對微生物還原Cr（VI）的影響Fig.6 Effect of different electron donors on the reduction of Cr（VI）by microorganisms

寡養(yǎng)單胞菌在乙酸鈉和乳酸鈉的作用下還原效率得到了顯著提升，僅60 h就達(dá)到了100%的去除率，葡萄糖則表現(xiàn)出抑制作用。在膠凍樣芽孢桿菌在還原Cr（VI）的過程中，乳酸鈉和葡萄糖表現(xiàn)出促進(jìn)作用，在葡萄糖和乳酸鈉的分別作用下，反應(yīng)72 h內(nèi)膠凍樣芽孢桿菌對50 mg/L的Cr（VI）去除率從49.2%分別提升至61.9%和73.2%，表明乙酸鈉和乳酸鈉可作為寡養(yǎng)單胞菌還原Cr（VI）的優(yōu)質(zhì)碳源，葡萄糖和乳酸鈉可作為膠凍樣芽孢桿菌還原Cr（VI）的優(yōu)質(zhì)碳源。

2.5 寡養(yǎng)單胞菌還原Cr（VI）前、后的SEM分析

選擇還原能力較強的寡養(yǎng)單胞菌，對其還原Cr（VI）前、后的形貌進(jìn)行掃描電鏡觀察（圖7），使用Image J軟件測量微生物長度為（3.77±0.19）μm，直徑為（1.29±0.07）μm，反應(yīng)前后細(xì)菌大小并未發(fā)生明顯變化。還原反應(yīng)前微生物體呈柱狀、表面光滑、邊緣規(guī)則；還原反應(yīng)后微生物周圍包裹有一層膜狀物質(zhì)。

圖7 寡養(yǎng)單胞菌還原Cr（VI）前、后形貌掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron microscopy before and after reduction of Cr（VI）by Stenotrophomonas sp.

2.6 寡養(yǎng)單胞菌還原Cr（VI）的X射線光電子能譜分析

為探究寡養(yǎng)單胞菌還原Cr（VI）的產(chǎn)物組成，采用高性能X射線光電子能譜儀對其還原產(chǎn)物進(jìn)行表征分析（圖8）。圖8-A為寡養(yǎng)單胞菌還原產(chǎn)物的XPS全譜圖，圖中出現(xiàn)典型的C、O、Cr等元素的俄歇譜線和C1s、O1s、Cr2p軌道的特征峰。Cr2p軌道峰顯示（圖8-B），結(jié)合能576-579 eV處和結(jié)合能586-589 eV處可見2個明顯的出峰，分別為Cr2p3/2軌道和Cr2p1/2軌道。根據(jù)XPS標(biāo)準(zhǔn)能譜手冊可知，Cr2p3/2軌道處的出峰由Cr（VI）在（578.0±0.1）eV處的出峰和Cr（III）在（576.6±0.1）eV處的出峰疊加而成，Cr2p1/2軌道的結(jié)合能比Cr2p3/2軌道高9.9 eV左右。由此可知，菌體表面同時存在Cr（VI）和Cr（Ⅲ），由于不同出峰的面積表示不同價態(tài)Cr的相對含量，由圖8-b可知，菌體表面的Cr（Ⅲ）含量高于Cr（VI）。

圖8 寡養(yǎng)單胞菌還原產(chǎn)物的XPS全譜圖和Cr2p軌道峰Fig.8 Full range XPS spectra and spectra of Cr2p for the reduction products of Stenotrophomonas sp.

3 討論

微生物對Cr（VI）的耐受能力是對Cr（VI）還原能力的最基本條件，而對Cr（VI）的還原量及還原的完全性直接決定了其在實際應(yīng)用中的價值。據(jù)以往文獻(xiàn)報道，對Cr（VI）耐受性較高的微生物在Cr（VI）脅迫下的MIC多處在400-800 mg/L，Pal等［25］對從土壤中分離得到的34株土壤微生物檢測，發(fā)現(xiàn)在Cr（VI）脅迫下的MIC為400-800 mg/L的微生物有27株；劉奎艷等［26］分離得到的土壤微生物在Cr（VI）脅迫下的MIC為500 mg/L。但多數(shù)微生物都難以實現(xiàn)對Cr（VI）的完全還原，如Pal分離的bacillus sphaericus AND303可完全還原的Cr（VI）濃度小于10 mg/L。寡養(yǎng)單胞菌和膠凍樣芽孢桿菌在Cr（VI）脅迫下的MIC分別為400和200 mg/L，表明寡養(yǎng)單胞菌可在高濃度的Cr（VI）污染條件下生存，而膠凍樣芽孢桿菌僅可在中高濃度的Cr（VI）污染條件下生存。還原能力方面，寡養(yǎng)單胞菌和膠凍樣芽孢桿菌可完全還原45.5和18.5 mg/L的Cr（VI），這一性能優(yōu)于文獻(xiàn)報道的耐鹽菌Staphylococcus sp.YZ-1 和 Bacillus cereus CC-1［18］。因此，寡養(yǎng)單胞菌和膠凍樣芽孢桿菌可在高濃度和中高濃度的Cr（VI）污染治理中發(fā)揮積極作用。

寡養(yǎng)單胞菌還原Cr（VI）的最適pH為8，反應(yīng)72 h內(nèi)對50 mg/L的Cr（VI）的去除率達(dá)到了98.1%，杜艷影等［22］在厭氧體系中研究的S.oneidensis MR-1還原50 mg/L的Cr（VI），在反應(yīng)第7天時的還原率為88%，寡養(yǎng)單胞菌較之表現(xiàn)出更優(yōu)異的還原能力。另外，寡養(yǎng)單胞菌和膠凍樣芽孢桿菌均在弱堿性條件下表現(xiàn)出較好的還原性，滿足細(xì)菌在弱堿性環(huán)境中生長狀況更好的特點，也表明這2株微生物的還原酶在弱堿性環(huán)境中活性最高。微生物在生長代謝過程中，一方面可以利用有機質(zhì)增強自身活性；另一方面可以從有機質(zhì)中獲取電子以促進(jìn)其對Cr（VI）的還原作用，因此，合理控制碳源對提升微生物對Cr（VI）還原效率意義重大［27］。本研究以乙酸鈉、乳酸鈉和葡萄糖分別作為電子供體進(jìn)行還原能力測試，結(jié)果表明乙酸鈉和乳酸鈉可提升寡養(yǎng)單胞菌的還原能力，葡萄糖和乳酸鈉可提升膠凍樣芽孢桿菌的還原能力。本結(jié)果與郝孔利等［28］對Pichia guilliermondii ZJH-1的研究相一致。乙酸鈉作用不明顯，推測是由于乙酸作為小分子有機酸會降低溶液的pH，從而抑制了微生物的活性［20］。

本研究通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)寡養(yǎng)單胞菌在還原Cr（VI）后，細(xì)胞膜表面包裹有一層膜狀物質(zhì)，朱文杰等［29］在研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，推測是微生物的Cr（VI）還原酶位于細(xì)胞膜上。研究表明，微生物機體合成的胞外多糖既可以起到保護(hù)機體的作用，也可以吸附Cr（VI）［30］。另外，為了避免較高毒性的Cr（VI）侵害機體，Cr（VI）的還原過程可能多在微生物表面進(jìn)行［14］。因此，推測寡養(yǎng)單胞菌的還原過程中包含一定程度的吸附作用。研究發(fā)現(xiàn)，元素的不同價態(tài)離子相應(yīng)的結(jié)合能有所差異，因此可根據(jù)其結(jié)合能分析元素的價態(tài)［22，24，31］。對還原Cr［29］（VI）后的寡養(yǎng)單胞菌進(jìn)行XPS分析，結(jié)果顯示寡養(yǎng)單胞菌同時存在Cr（VI）和Cr（Ⅲ），且Cr（Ⅲ）含量高于Cr（VI），表明寡養(yǎng)單胞菌還原Cr（VI）的過程同時包含吸附作用和還原作用，并且還原作用起主要作用，吸附作用起次要作用。

4 結(jié)論

寡養(yǎng)單胞菌可有效降解Cr（VI），降解過程包括還原和吸附作用，其中還原作用為主要作用。另外，寡養(yǎng)單胞菌和膠凍樣芽孢桿菌均可在中高濃度Cr（VI）中保持較高的活性及較強的Cr（VI）解毒性，在偏弱堿性環(huán)境下同時施加適量的電子供體還可以有效提高其還原能力。因此，寡養(yǎng)單胞菌和膠凍樣芽孢桿菌可作為修復(fù)重金屬Cr（VI）污染的優(yōu)質(zhì)菌種，在解決鉻污染問題中發(fā)揮重要作用。