崔新剛 孫雅欣 崔曉靜 鄧雁文 孫恩浩 王俊芳 崔紅晶，

（1. 牡丹江醫(yī)學(xué)院，牡丹江 157011；2. 廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東莞 523808；3. 廣東醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，東莞 523808；4. 廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，東莞 523808）

當(dāng)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）細(xì)胞處于生長(zhǎng)、發(fā)育或外環(huán)境干擾細(xì)胞壁完整性的時(shí)候，細(xì)胞壁以高度調(diào)控和極化的方式被重構(gòu)，這一過(guò)程主要被細(xì)胞壁完整性（cell wall integrity，CWI）信號(hào)通路所調(diào)控［1］。細(xì)胞表面感應(yīng)因子Wsc1-3p、Mid2p和Mtl1p把應(yīng)激信號(hào)傳導(dǎo)給小G蛋白（Rho1p），進(jìn)一步激活絲裂原活化蛋白激酶（the mitogen-activated protein kinase，MAPK）/Slt2p信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)CWI信號(hào)通路，上調(diào)靶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞壁重構(gòu)［1］。與經(jīng)典CWI信號(hào)通路相平行，Mpt5p和Ssd1p兩條信號(hào)通路也參與調(diào)控細(xì)胞壁生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后加工。因此，在釀酒酵母細(xì)胞中有3條信號(hào)通路協(xié)同調(diào)控細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和細(xì)胞的完整性［2-3］。

釀酒酵母Tap42p（type 2A associated protein-42kD）位于保守性壽命調(diào)控通路TOR（target of rapamycin）的下游，作為必需蛋白Tap42p參與抑制或激活蛋白磷酸酶的調(diào)控過(guò)程，且直接或間接受TOR調(diào)控轉(zhuǎn)錄［4］。已有研究報(bào)道細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)通路中Ssd1p可恢復(fù)TAP42基因缺失菌株在高溫生長(zhǎng)條件下的生長(zhǎng)活力，提示TAP42可能參與細(xì)胞壁完整性的調(diào)控［5］，但其在細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)中的具體作用仍未知。本實(shí)驗(yàn)觀察TAP42基因?qū)湍讣?xì)胞分裂增殖能力的影響，研究TAP42基因在細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)作用，進(jìn)一步探討Tap42p參與調(diào)控細(xì)胞壁完整性信號(hào)通路的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 Easy Taq DNA聚合酶（貨號(hào)：AP111）、HiFi DNA聚合酶（貨號(hào)：AP131）和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；酵母提取物（貨號(hào)：LP0021）和胰蛋白胨（貨號(hào)：LP0042）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；SD培養(yǎng)基（貨號(hào)：630411）購(gòu)自Clontech公司；熒光增白劑（貨號(hào)：18909）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，按照說(shuō)明書(shū)分別配制成10 μg/mL的工作液。

1.1.2 酵母和載體 釀酒酵母BY4743（MATa/α his3Δ1/his3Δ1 leu2Δ0/leu2Δ0 LYS2/lys2Δ0 met15Δ0/MET15 ura3Δ0/ura3Δ0）和載體 pRS306 為實(shí)驗(yàn)室保存。載體為低拷貝穿梭載體，在大腸桿菌中具有氨芐青霉素抗性，分別帶有Ura營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)簽。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物序列Table 1 Nucleotide sequence of primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 TAP42基因缺失菌株的構(gòu)建與驗(yàn)證 構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行［6］。以載體pRS306為模板，TAP42-F和TAP42-R為引物，PCR擴(kuò)增TAP42基因破壞元件。采用醋酸鋰方法將破壞元件轉(zhuǎn)化進(jìn)野生型酵母細(xì)胞（BY4743），經(jīng)Ura營(yíng)養(yǎng)型缺陷培養(yǎng)基篩選。PCR鑒定陽(yáng)性克隆基因組DNA，鑒定引物分別為T(mén)AP42基因開(kāi)放閱讀框外側(cè)引物（V-TAP42-F/V-TAP42-R），TAP42基因開(kāi)放閱讀框內(nèi)部鑒定引物（TAP42-int-F/TAP42-int-R）以及營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)簽URA3基因內(nèi)部引物和TAP42基因開(kāi)放閱讀框外側(cè)引物（URA-int-F/V-TAP42-R），采用Easy Taq DNA聚合酶，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 生長(zhǎng)曲線 實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行［7-8］。制備300 μL 含酵母細(xì)胞的葡萄糖蛋白胨酵母膏（yeast extract peptone dextrose，YPD）新鮮培養(yǎng)物（含10 μg/mL熒 光 增 白 劑（calcofluorwhite stain，CFW），A600值約為0.04，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；每間隔2 h 全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀（Bioscreen C MB system，F(xiàn)inland）測(cè)定標(biāo)本A600值。根據(jù)吸光度值，計(jì)算酵母菌株的細(xì)胞分裂增殖活性，并繪制生長(zhǎng)曲線圖。3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 點(diǎn)板實(shí)驗(yàn) 取等量的酵母菌株新鮮培養(yǎng)物（A600值約為0.25），無(wú)菌水倍比稀釋?zhuān)?∶10），取3.5 μL稀釋培養(yǎng)物滴入實(shí)驗(yàn)組YPD培養(yǎng)平板（含10 μg/mL CFW）［9］。倒置 30℃培養(yǎng)，從第 2天起每隔12 h觀察菌落形態(tài)，并拍照。3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 定量RT-PCR 將酵母菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集1 mL酵母菌株新鮮培養(yǎng)物（A600值約為2.5），提取酵母細(xì)胞總RNA、制備cDNA，以及實(shí)時(shí)定量PCR方法均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以酵母PRP8基因?yàn)閰⒈?，根?jù)2-ΔΔCT法計(jì)算細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)通路中效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。兩組間的比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TAP42基因缺失菌株的鑒定

破壞元件轉(zhuǎn)化野生型酵母細(xì)胞（BY4743），PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆酵母細(xì)胞基因組DNA，結(jié)果顯示：引物V-TAP42-F和V-TAP42-R所擴(kuò)增片段大小為1 678 bp；引物TAP42-int-F和TAP42-int-R所擴(kuò)增片段為164 bp；引物URA-int-F和V-TAP42-R所擴(kuò)增片段為712 bp，結(jié)果與預(yù)期大小一致（圖1）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TAP42基因缺失菌株（BY4743 tap42Δ）構(gòu)建成功。

圖1 TAP42基因缺失酵母菌株的驗(yàn)證圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products on verifying the TAP42 deletion strain

2.2 TAP42基因缺失菌株的分裂增殖能力

通過(guò)點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)和全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀檢測(cè)酵母細(xì)胞增殖能力，研究TAP42基因缺失對(duì)酵母細(xì)胞分裂增殖能力的影響。結(jié)果顯示：與BY4743菌株比較，tap42Δ菌株形成的較小克隆，細(xì)胞增殖活力較差（圖2-A）；與BY4743菌株平均約12 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期比較，tap42Δ菌株平均約18 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞增殖活力較差，提示缺失TAP42基因抑制酵母細(xì)胞分裂增殖能力（圖2-B）。以上結(jié)果說(shuō)明缺失TAP42基因減弱酵母細(xì)胞的分裂增殖能力。

圖2 酵母細(xì)胞的分裂增殖能力Fig. 2 Cell proliferation ability of the yeast strains

2.3 TAP42基因缺失酵母菌株的細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)抗性

為進(jìn)一步研究tap42Δ菌株在細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)中的作用，本實(shí)驗(yàn)觀察在含細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)劑培養(yǎng)條件下的細(xì)胞克隆形成能力和生長(zhǎng)活力。結(jié)果顯示：在YPD培養(yǎng)基條件下，與BY4743菌株的克隆形成能力和細(xì)胞增殖活力比較，tap42Δ菌株的分裂增殖能力明顯減弱；在細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)（含10 μg/mL CFW）條件下，與BY4743菌株的克隆大小比較，tap42Δ菌株的克隆形成能力無(wú)明顯差異（圖3-A），兩菌株的生長(zhǎng)均受到抑制，與BY4743菌株平均約20 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期比較，tap42Δ菌株平均約21 h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞增殖活力無(wú)明顯差異（圖3-B）。以上結(jié)果說(shuō)明缺失TAP42基因增強(qiáng)酵母細(xì)胞對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)的抵抗性。

圖3 酵母菌株的細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)抗性Fig.3 Resistance to the cell wall stress response of the yeast strains

2.4 細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)通路中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平

為研究tap42Δ菌株參與細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)通路的可能機(jī)制，本研究采用定量qRT-PCR檢測(cè)參與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和完整性調(diào)控通路中轉(zhuǎn)錄因子SWI4、SWI6、MPT5和SSD1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：在正常生理?xiàng)l件下，與BY4743比較，tap42Δ菌株中SWI4、SWI6、MPT5和SSD1基因表達(dá)明顯升高；在細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)條件下，與BY4743比較，tap42Δ菌株中SWI4基因表達(dá)上調(diào)，MPT5基因表達(dá)下調(diào)（圖4）。因此，缺失TAP42能誘導(dǎo)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)通路中轉(zhuǎn)錄因子SWI4、SWI6、MPT5和SSD1的表達(dá)水平。

圖4 酵母菌株中 SWI4、SWI6、MPT5 和 SSD1 基因定量表達(dá)水平應(yīng)激反應(yīng)抗性Fig.4 Expression levels of SWI4, SWI6, MPT5 and SSD genes in yeast strains

3 討論

本研究采用一步基因置換法，基于基因同源重組的原理［10-11］，在二倍體酵母細(xì)胞BY4743菌株中敲除TAP42單倍體基因，保留另一單倍體基因在酵母細(xì)胞中的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺失TAP42基因減弱酵母細(xì)胞分裂增殖能力，提示Tap42p對(duì)酵母細(xì)胞的正常分裂增殖來(lái)說(shuō)是必需的，推測(cè)Tap42p參與酵母細(xì)胞分裂增殖能力的調(diào)控。已有文獻(xiàn)報(bào)道Tap42p以不依賴TOR功能的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂增殖能力，進(jìn)而調(diào)控果蠅生存活力；敲除Tap42蛋白的果蠅誘導(dǎo)JNK信號(hào)通路，激活Caspase信號(hào)通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［12］。以上結(jié)果均說(shuō)明TAP42基因參與單細(xì)胞真核生物釀酒酵母和多細(xì)胞真核生物分裂增殖能力的調(diào)控。

釀酒酵母Tap42p是TOR壽命調(diào)控信號(hào)通路中下游靶蛋白之一，TOR激酶與蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）、PP2A樣催化亞基Sit4和Pph21/22之間競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)控Tap42p磷酸化或非磷酸化的活性形式［3］。因此，TOR激酶可直接或間接地調(diào)控Tap42p的功能，使其在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)［5，13］、自噬作用［14-15］和生長(zhǎng)發(fā)育［16-17］等生物過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

本研究通過(guò)觀察tap42Δ菌株在細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)條件下的細(xì)胞分裂增殖能力，研究Tap42蛋白在細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)劑處理后的BY4743和tap42Δ酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)均受到抑制，但tap42Δ酵母細(xì)胞增殖活力與野生型酵母細(xì)胞接近，提示tap42Δ菌株對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)有一定的抗性。我們推測(cè)可能原因是單倍體TAP42基因轉(zhuǎn)錄本在調(diào)控tap42Δ菌株細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和細(xì)胞完整性方面具有重要的代償性功能；也可能與Tap42p具有兩種活性形式，協(xié)同調(diào)控細(xì)胞活性相關(guān)，磷酸化Tap42p作為PP2A磷酸酶活性的抑制劑，而非磷酸化Tap42p作為其激活劑，分別通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子Msn2/4、Gln3和Rtg1/3信號(hào)通路誘導(dǎo)核內(nèi)靶基因的上調(diào)表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程，進(jìn)而改善細(xì)胞應(yīng)激適應(yīng)能力［13］。本研究進(jìn)一步也發(fā)現(xiàn)缺失TAP42基因誘導(dǎo)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)通路中轉(zhuǎn)錄因子SWI4、SWI6、MPT5和SSD1表達(dá)上調(diào)，推測(cè)上調(diào)保護(hù)性CWI、Mpt5和Ssd1信號(hào)通路賦予tap42Δ菌株對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)的抵抗性，可能原因與上調(diào)的信號(hào)通路協(xié)同調(diào)控細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和細(xì)胞完整性，參與細(xì)胞壁重塑功能，抵抗細(xì)胞壁應(yīng)激損傷相關(guān)。已有研究報(bào)道SSD1基因恢復(fù)tap42Δ菌株在高溫生長(zhǎng)條件下的存活力［5］，也提示上調(diào)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)通路中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的水平能改善tap42Δ菌株在熱應(yīng)激條件的存活能力，這一研究結(jié)論也佐證了本研究關(guān)于上調(diào)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)通路的活性賦予tap42Δ菌株對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)抗性的推測(cè)。

酵母細(xì)胞壁是一種堅(jiān)固而富有彈性的結(jié)構(gòu)，對(duì)維持細(xì)胞形狀和完整性及促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外物理化學(xué)環(huán)境發(fā)生變換時(shí)，可能誘導(dǎo)經(jīng)典細(xì)胞壁完整性（CWI）信號(hào)通路中蛋白激酶C-絲裂原活化蛋白激酶（PKC-MAPK）的激活，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Rlm1p、Swi4/6p和Skn7p的表達(dá)水平，參與下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［2］，進(jìn)一步調(diào)控β-葡聚糖和細(xì)胞壁相關(guān)成分，參與細(xì)胞壁重構(gòu)，賦予細(xì)胞應(yīng)激抵抗能力［1，18］。在調(diào)控細(xì)胞壁重構(gòu)這一過(guò)程中，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子Mpt5p和Ssd1p，以不依賴MAPK/Slt2p方式參與細(xì)胞壁生物合成方面的調(diào)控，或通過(guò)間接機(jī)制改善細(xì)胞壁完整性［2-4］。綜上，本研究結(jié)果推測(cè)缺失TAP42基因誘導(dǎo)SWI4、SWI6、MPT5和SSD1保護(hù)性信號(hào)通路上調(diào)可能賦予菌株對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)的抵抗性，但具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過(guò)構(gòu)建TAP42基因缺失酵母菌株研究其克隆形成能力和細(xì)胞分裂增殖能力，以及在細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)中的作用，結(jié)果表明缺失TAP42基因減弱酵母細(xì)胞分裂增殖能力，形成較小克隆。研究結(jié)果推測(cè)上調(diào)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)通路中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平能增強(qiáng)TAP42基因缺失酵母菌株對(duì)細(xì)胞壁應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)劑的抵抗性，但具體作用和作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。