趙國(guó)政，張 芹，解廷月

(1.山西師范大學(xué)現(xiàn)代文理學(xué)院，山西臨汾 041000;2.南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210023;3.山西大同大學(xué)物理與電子科學(xué)學(xué)院，山西大同 037009)

煙堿類農(nóng)藥有吡蟲(chóng)啉、噻蟲(chóng)啉、噻蟲(chóng)嗪、呋蟲(chóng)胺及烯啶蟲(chóng)胺等，其中，噻蟲(chóng)啉（thiacloprid，圖1）是繼吡蟲(chóng)啉之后拜耳公司開(kāi)發(fā)的又一煙堿類廣譜內(nèi)吸性殺蟲(chóng)劑，對(duì)刺吸式口器害蟲(chóng)具有高效殺蟲(chóng)作用[1?2]。近年來(lái)，由于農(nóng)藥管理監(jiān)督力度不夠，濫用農(nóng)藥現(xiàn)象較嚴(yán)重。因此，迫切需要尋找噻蟲(chóng)啉快速準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)，研究意義重大。

圖1 噻蟲(chóng)啉的分子結(jié)構(gòu)

隨著新型材料石墨烯的問(wèn)世[3]，石墨烯與其它材料制備的復(fù)合物引領(lǐng)了研究熱潮，殼聚糖修飾的石墨烯復(fù)合材料便是其中一種[4]。Yin 等[5]運(yùn)用殼聚糖修飾石墨烯，建構(gòu)了檢測(cè)水樣中鄰苯二酚（CT）、間苯二酚（RS）和對(duì)苯二酚（HQ）的電化學(xué)生物傳感器，具有較寬的線性范圍和較低的檢測(cè)限。Kang 等[6]基于石墨烯?殼聚糖復(fù)合物制備了葡萄糖傳感器，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)葡萄糖的檢測(cè)，展現(xiàn)出了優(yōu)良的檢測(cè)性能。

基于所研制的石墨烯/殼聚糖/噻蟲(chóng)啉電化學(xué)免疫傳感器，結(jié)合噻蟲(chóng)啉抗體與抗原間的特異性競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，采用循環(huán)伏安法（CV）和差分脈沖伏安法（DPV），在K3Fe(CN)6溶液中實(shí)現(xiàn)對(duì)噻蟲(chóng)啉的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CHI852C電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）；噻蟲(chóng)啉抗體（南京曉莊學(xué)院）；噻蟲(chóng)啉（Sigma?Aldrich 公司）；殼聚糖（Sigma?Aldrich 公司）；磷酸緩沖溶液（ThermoFisher公司）；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 免疫傳感器的制備

噻蟲(chóng)啉溶液的制備：稱取0.05 g噻蟲(chóng)啉，溶于10 mL DMF中，配得0.5 g/L噻蟲(chóng)啉溶液，稀釋至0.2 g/L。

將5 mg石墨烯[7]溶解于2.5 mL 殼聚糖溶液，得到石墨烯/殼聚糖分散液。

將電極（GCE）依次在直徑為0.3和0.05μm Al2O3拋光粉上打磨，分別在無(wú)水乙醇?蒸餾水、蒸餾水中各超聲清洗5 min，蒸餾水沖洗，在2 mmol K3Fe(CN)6中掃CV圖，以電勢(shì)差在100 mV以內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)，衡量電極是否打磨完好。將打磨好的電極放在室溫下，晾干。

將4μL 石墨烯/殼聚糖分散液滴涂到電極上，再將2μL 0.2 g/L 噻蟲(chóng)啉溶液滴涂于電極表面，40 ℃烘干。修飾過(guò)的電極浸泡在5%的牛血清白蛋白（BSA）溶液中，37 ℃烘箱中孵育30 min。

1.3 香蕉/西紅柿樣品的前處理

稱取2.000 g 香蕉/西紅柿于10 mL 樣品管中，加入噻蟲(chóng)啉溶液和3 mL 乙腈提取液，超聲振蕩30 min，離心10 min（2 000 r/min），將上清液轉(zhuǎn)移至樣品管。50 ℃氮?dú)獯蹈桑? mL pH=7.4 磷酸緩沖溶液（PBS）加入樣品管，溶解濃縮物。

1.4 電化學(xué)檢測(cè)

工作電極、參比電極與輔助電極分別為石墨烯/殼聚糖/噻蟲(chóng)啉修飾電極、Ag/AgCl 電極與鉑絲電極，運(yùn)用CV探討不同程度修飾電極的電化學(xué)行為。

2 結(jié)果與討論

2.1 免疫傳感器檢測(cè)噻蟲(chóng)啉的原理

原理如圖2 所示:①石墨烯/殼聚糖/噻蟲(chóng)啉電極浸入噻蟲(chóng)啉抗體和游離噻蟲(chóng)啉的孵育液時(shí)，固定在電極上的噻蟲(chóng)啉、溶液中游離的噻蟲(chóng)啉分別競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合噻蟲(chóng)啉抗體；②噻蟲(chóng)啉和噻蟲(chóng)啉抗體之間存在特定的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，從而使抗體在電極上發(fā)生吸附；③所形成的抗體?抗原復(fù)合物致使電極產(chǎn)生位阻，降低峰值電流。基于電化學(xué)信號(hào)的差異，實(shí)現(xiàn)噻蟲(chóng)啉的定量檢測(cè)。

圖2 石墨烯/殼聚糖/噻蟲(chóng)啉修飾電極的免疫傳感器檢測(cè)噻蟲(chóng)啉原理

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

DPV 法確定孵育液中免疫反應(yīng)的時(shí)間。將一定體積的抗體依次孵育0，10，20，30 和40 min，PBS 沖洗。由圖3 可知，對(duì)于石墨烯/殼聚糖/噻蟲(chóng)啉修飾電極的DPV 峰電流隨孵育時(shí)間的變化趨勢(shì)，前20 min，電流值快速下降，20～40 min范圍內(nèi)，下降幅度較小。孵育時(shí)間再增加電流值降低很少。因此，選擇20 min作為免疫反應(yīng)的時(shí)間。

圖3 不同孵育時(shí)間下的DPV峰值電流

孵育液中抗體濃度的優(yōu)化。圖4 展示了不同抗體濃度與DPV 峰值電流的對(duì)應(yīng)關(guān)系。從圖中可知，抗體體積由0 μL 到5 μL 時(shí)，DPV 峰值電流顯著下降。隨著抗體體積的繼續(xù)增加，5～15μL 之間，電流值變化很小。因此，選擇5μL作為反應(yīng)的抗體體積。

圖4 不同抗體含量下的DPV峰值電流

2.3 噻蟲(chóng)啉的檢測(cè)

孵育液體積總量為50μL，是含一系列不同濃度噻蟲(chóng)啉溶液、PBS及相同濃度噻蟲(chóng)啉抗體的溶液。圖5 展示了石墨烯/殼聚糖/噻蟲(chóng)啉電極在不同濃度孵育液中的DPV 曲線。從圖中可知，DPV 峰值電流隨噻蟲(chóng)啉在孵育液中的濃度增加而增大。定義修飾電極在含5 μL 抗體的PBS 緩沖溶液孵育后對(duì)應(yīng)的響應(yīng)電流為I0，在含有游離噻蟲(chóng)啉的孵育液孵育后對(duì)應(yīng)的響應(yīng)電流為Ix，電流變化ΔI（ΔI=Ix?I0）與噻蟲(chóng)啉濃度在500～6 000 μg/L 范圍內(nèi)成正比，檢出限為0.4 μg/L。

圖5 不同濃度孵育液中石墨烯/殼聚糖/噻蟲(chóng)啉電極的DPV電流

2.4 重復(fù)性與穩(wěn)定性

對(duì)石墨烯/殼聚糖/噻蟲(chóng)啉免疫傳感器重復(fù)6次，DPV 掃描，峰值電流變化的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.5%，說(shuō)明傳感器具有較好的實(shí)驗(yàn)重復(fù)性。

將石墨烯/殼聚糖/噻蟲(chóng)啉免疫傳感器存放于空氣中，DPV 掃描，峰值電流5 d 內(nèi)下降值低于5.8%，說(shuō)明傳感器具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 香蕉樣品的分析

對(duì)3 種加入不同量噻蟲(chóng)啉溶液的香蕉樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度檢測(cè)3 次，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線，噻蟲(chóng)啉的回收率為93.2%～ 102.4%，平均為98.2%，見(jiàn)表1。

表1 香蕉樣品加標(biāo)處理檢測(cè)噻蟲(chóng)啉實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 西紅柿樣品的分析

對(duì)3 種加入不同量噻蟲(chóng)啉溶液的西紅柿樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度檢測(cè)3 次，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線，噻蟲(chóng)啉的回收率為97.4%～ 103.9%，平均為100.3%，見(jiàn)表2。

表2 西紅柿樣品加標(biāo)處理檢測(cè)噻蟲(chóng)啉實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

制備的新型石墨烯/殼聚糖/噻蟲(chóng)啉電化學(xué)免疫傳感器，能將石墨烯材料優(yōu)異的導(dǎo)電性能和較大的比表面積、殼聚糖的吸附特性和對(duì)石墨烯良好的分散效果進(jìn)行結(jié)合，與抗原（噻蟲(chóng)啉）共同修飾于玻碳電極上，實(shí)現(xiàn)對(duì)噻蟲(chóng)啉的檢測(cè)。響應(yīng)電流的降低與噻蟲(chóng)啉在500～ 6 000 mg/L 范圍內(nèi)成正比，檢測(cè)限為0.4 g/L。此免疫傳感器用于香蕉和西紅柿中噻蟲(chóng)啉的檢測(cè)具有良好的回收率。