李晉南，張圓圓，范澤，吳迪，王連生

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江省水生動物病害與免疫重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150070）

精氨酸（Arg）作為功能性氨基酸在機體的各種生理活動中起重要作用，如促進蛋白質(zhì)代謝、提高機體的免疫力、促進激素的分泌、提高繁殖力等，此外還是多種活性物質(zhì)的前體[1-3]。Arg 是魚的必需氨基酸。不同魚對精氨酸的需求量為1.0%～3.1%，相當(dāng)于日糧蛋白的3.8%～8.1%[4]。Chen 等[5]認為，建鯉（Cyprinus carpio var.Jian）對精氨酸的需求為日糧蛋白質(zhì)的5.29%。Arg 在哺乳動物中的研究較多[6,7]；飼料中添加精氨酸可以提高魚的增重率，降低餌料系數(shù)，提高蛋白質(zhì)效率[8-10]。

精氨酸具有多種生理功能，尤其是在促進機體的抗氧化和免疫功能方面受到了廣泛關(guān)注[11]。精氨酸可以提高大鼠的抗氧化酶活性，降低丙二醛含量，減少氧化應(yīng)激對機體的損傷[12]。目前，關(guān)于飼料中精氨酸水平對鯉幼魚腸道功能及抗氧化能力影響的研究報道尚不多見。松浦鏡鯉是在德國鏡鯉選育系（F4）的基礎(chǔ)上選育出的具有很高經(jīng)濟價值的新品種。本研究通過在飼料中添加不同水平的精氨酸，研究其對松浦鏡鯉生長性能及腸道健康的影響，以期為精氨酸在配合飼料中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗用松浦鏡鯉初始體質(zhì)量為（6.84±0.02）g，來自中國水產(chǎn)科學(xué)院黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭實驗站。

L-精氨酸購自Sigma，純度≥98.5%。實驗飼料蛋白源為魚粉和酪蛋白，脂肪源為魚油和豆油，精氨酸添加水平為0%（A0）、0.6%（A0.6）、1.2%（A1.2）、1.8%（A1.8）和2.4%（A2.4）；用甘氨酸調(diào)節(jié)氮平衡，配制5 種蛋白質(zhì)含量為32.24%、脂肪含量為6.12%的等氮等能飼料。將配制并混勻后的飼料加入魚油和豆油，再次混勻過篩后，加適量的水制成顆粒飼料。實驗飼料配方及營養(yǎng)組成見表1[13]。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)組成（干重）Tab.1 Ingredients and approximate composition in the basal diets（air-dry basis）/%

1.2 方法

選擇規(guī)格一致，體質(zhì)健壯的松浦鏡鯉360 尾，預(yù)飼14 d 后隨機分為5 組，每組4 個重復(fù)，每個重復(fù)18 尾，飼養(yǎng)在室內(nèi)體積為200 L 的控溫循環(huán)水族箱中，24 h 不間斷供氧，分別飼喂上述含精氨酸的5種飼料8 周。實驗水溫為（23±1）℃，溶解氧濃度＞5 mg/L，氨氮＜0.02 mg/L，pH7.05～7.20，每周換去水族箱內(nèi)2/3 水，注入已曝氣的水。每天8:00、12:00 和17:00 定時投喂3 次，以飽食無殘餌為準(zhǔn)，每日清除缸內(nèi)糞便，記錄魚攝食和死亡情況。

養(yǎng)殖實驗結(jié)束時，停食12 h，稱量末重，統(tǒng)計存活數(shù)。每缸隨機取3 尾魚，經(jīng)M-222 麻醉后，稱量體質(zhì)量和體長，迅速在冰盤中解剖，取出腸道后測量腸質(zhì)量和腸長。分別取0.5 cm 的前腸、中腸和后腸組織段固定于Bouin 氏液中，保存在4℃冰箱中，用于后續(xù)腸道組織結(jié)構(gòu)分析。剩余的各腸段樣品分裝于密封袋中，保存于-40℃冰箱中，用于測定消化酶活性和抗氧化指標(biāo)。

腸道消化酶的測定：將前中后腸的組織樣品用0.86%生理鹽水制成10%的組織勻漿液，離心取上清液后，分裝于1.5 mL 離心管存于-20℃冰箱中備用[13]。

淀粉酶和脂肪酶活性采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，按說明書測定。利用福林-酚（Folin-phenol）法測定蛋白酶活性，考馬斯亮藍法測定組織中蛋白含量[13]。

腸道抗氧化指標(biāo)的測定：超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、一氧化氮合酶（NOS）活性與谷胱甘肽（GSH）、總抗氧化能力（T-AOC）及丙二醛（MDA）含量均采用南京建成試劑盒，參照試劑盒說明書測定。

腸道組織結(jié)構(gòu)的測定與觀察：腸道組織樣品從Bouin 氏液取出后，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片機切成厚度為5 μm 切片、HE 染色制成腸道組織切片。在帶有拍照系統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡下（Leica MD 4000B）觀察并拍照，用Motic Images Plus 2.0 軟件對每個腸段的皺襞高度、絨毛寬度和肌層厚度等指標(biāo)進行測量，每張切片測量10 個以上，取其平均值進行分析。

1.3 統(tǒng)計分析方法

根據(jù)實驗魚初體質(zhì)量、末體質(zhì)量、體長、腸質(zhì)量和腸長，計算特定生長率（specific growth rate，SGR）、腸體指數(shù)（Intestinal somatic index，ISI）和腸長指數(shù)（Intestinal length index，ILI）。

特定生長率（SGR）=（Ln末體質(zhì)量－Ln初體質(zhì)量）×100/天數(shù);

腸體指數(shù)（ISI）=腸質(zhì)量/體質(zhì)量×100%；

腸長指數(shù)（ILI）=腸長/體長×100%。

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，利用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和Duncan’s 多重比較，顯著性水平P 為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料精氨酸水平對松浦鏡鯉幼魚生長性能的影響

由表2 可知，添加精氨酸各組松浦鏡鯉的末體質(zhì)量（FBW）和特定生長率（SGR）顯著高于對照組（P＜0.05）；A1.2 組和A1.8 組腸體指數(shù)顯著高于A0組（P＜0.05）；A1.8 和A2.4 組的腸長指數(shù)顯著高于A0 組（P＜0.05）。

表2 攝食不同精氨酸水平飼料的松浦鏡鯉的生長性能Tab.2 Growth performance of juvenile Songpu mirror carp fed diets containing various levels of arginine

2.2 飼料精氨酸水平對松浦鏡鯉幼魚腸道消化酶活性的影響

由表3 可知：飼料中添加精氨酸對中腸蛋白酶活性沒有顯著影響（P＞0.05），添加2.4%精氨酸組前腸蛋白酶活性顯著高于A0、A0.6 和A1.2 組（P＜0.05），A1.8 和A2.4 組后腸蛋白酶活性顯著高于A0 組（P＜0.05）；飼料中添加精氨酸對后腸脂肪酶活性沒有顯著影響（P＞0.05），A1.8 和A2.4 組前腸和中腸脂肪酶活性顯著高于A0 組（P＜0.05）；飼料中添加精氨酸對前腸和后腸淀粉酶活性沒有顯著影響（P＞0.05），A1.8 組中腸淀粉酶活性顯著高于A0 組（P＜0.05）。

表3 攝食不同精氨酸水平飼料的松浦鏡鯉腸道消化酶的活性Tab.3 Intestine digestive enzyme activities of juvenile Songpu mirror carp fed diets containing various levels of arginine

2.3 飼料精氨酸水平對松浦鏡鯉幼魚腸道抗氧化能力的影響

由表4 可知，A1.2 組松浦鏡鯉前腸和中腸CAT活性顯著高于A0 組（P＜0.05），而后腸CAT 活性各組間沒有顯著差異（P＞0.05）。A2.4 組前腸T-AOC顯著高于其他各組（P＜0.05），且其后腸T-AOC 顯著高于A0 組（P＜0.05），A1.8 組中腸T-AOC 顯著高于A0 組和A0.6 組（P＜0.05）。各實驗組間MDA 含量差異不顯著（P＞0.05）。A2.4 組前腸SOD 活性顯著高于其他各組（P＜0.05），其中腸SOD 活性顯著高于對照組（P＜0.05），各添加組后腸SOD 活性顯著高于對照組（P＜0.05）。A1.8 和A2.4 組前腸GSH 含量顯著高于對照組（P＜0.05），A2.4 組中腸GSH 含量顯著高于A0、A0.6 和A1.2 組（P＜0.05），A1.2、A1.8 和A2.4 組后腸GSH 含量顯著高于A0 組（P＜0.05）。A2.4 組前腸和中腸NOS 活性顯著高于其他各組（P＜0.05），各添加組后腸NOS 活性顯著高于對照組（P＜0.05）。

表4 攝食不同精氨酸水平飼料的松浦鏡鯉的腸道抗氧化能力Tab.4 Intestine digestive antioxidant capacity of juvenile Songpu mirror carp fed diets containing various levels of arginine

2.4 飼料精氨酸水平對松浦鏡鯉腸道形態(tài)的影響

飼料中添加精氨酸顯著影響了腸道的皺襞高度，腸絨毛寬度和肌層厚度。由圖1 可知：添加精氨酸顯著增加了松浦鏡鯉前腸皺襞高度（P＜0.05），與A0 組相比，添加1.8%和2.4%精氨酸顯著提高了中腸和后腸的皺襞高度（P＜0.05）。各組前腸和后腸絨毛寬度差異不顯著（P＞0.05），與A0 組相比，添加1.8%和2.4%精氨酸顯著增加了中腸的絨毛寬度（P＜0.05）。前腸肌層厚度各實驗組間差異不顯著（P＞0.05），A1.2 組中腸肌層厚度顯著高于其他各組（P＜0.05），A1.8 組后腸肌層厚度顯著高于A0 組（P＜0.05）。

圖1 飼料中精氨酸水平對松浦鏡鯉腸道形態(tài)的影響Fig.1 Effects of dietary arginine levels on the intestinal morphology of Songpu mirror carp

3 討論

精氨酸參與體內(nèi)蛋白質(zhì)和多胺的合成，可以提高魚類的生長性能[8-10,14-16]。本實驗中，飼料中添加0.6%以上的精氨酸，顯著提高了松浦鏡鯉幼魚的末質(zhì)量和SGR，但各添加組間差異不顯著，說明飼料中添加0.6%左右的精氨酸便可以顯著提高松浦鏡鯉幼魚的生長性能，過量的精氨酸對松浦鏡鯉的生長沒有顯著的促進作用。對黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）[17]和尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus L.）[8]的研究表明，其生長性能隨著飼料精氨酸水平的進一步增加而呈下降趨勢，其可能是存在精氨酸與賴氨酸的拮抗作用。

鯉無胃，腸道是消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要場所。機體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力以腸道中的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性來衡量[18]。精氨酸及其代謝產(chǎn)物能提高腸道中消化酶活性，提高魚類的生長速度[16,19]。對建鯉的研究表明，飼料中精氨酸水平對淀粉酶活性無顯著影響，但顯著提高了蛋白酶和脂肪酶活性[5]。Zhou 等[19]對黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）幼魚的研究表明，精氨酸可以提高魚體前腸和中腸胰蛋白酶活性，以及前腸淀粉酶活性。對仿刺參（Apostichopus japonicus）的研究表明[20]，飼料精氨酸水平可以顯著影響腸道蛋白酶的活性，而對脂肪酶和淀粉酶活性影響不顯著。飼料中添加精氨酸顯著提高了雜交鱘（Acipenser schrrenckii ♀×A.baeri ♂）前腸蛋白酶和淀粉酶活性[21]。對黃顙魚幼魚的研究表明，適宜水平的精氨酸可以提高胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性及肝臟淀粉酶活性[21]。本研究同樣表明，精氨酸能夠通過提高松浦鏡鯉腸道的消化酶活性，從而提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。

SOD、CAT 及GSH 是生物體內(nèi)廣泛存在的抗氧化酶，可以有效清除活性氧自由基以保護機體組織免受損傷[22,23]。MDA 是脂肪氧化的終產(chǎn)物之一，能夠反映機體細胞受損傷程度[24]?？偪寡趸芰Γ═-AOC）與機體的健康程度密切相關(guān)。本實驗中，飼料中添加適宜水平的精氨酸增加了松浦鏡鯉幼魚腸道T-AOC、SOD 和CAT 活性，提高了GSH 含量和腸道的抗氧化能力。這一結(jié)果與吳俊光等在鱘魚上的研究結(jié)果一致[25]。飼料中精氨酸水平能顯著提高斑點叉尾（Ictalurus punctatus）肝臟中SOD活力[26]。精氨酸是體內(nèi)多胺、一氧化氮等活性物質(zhì)合成的前體，其能夠在NOS 的催化下生成一氧化氮（NO），而NO 具有殺菌和抑菌作用，可以清除機體內(nèi)的氧自由基[27]，提高抗氧化酶的活性。封福鮮等[28]的研究表明，瓦氏黃顙魚（Pelteobagrus vachelli）血清NOS 活性隨Arg 水平的升高而升高。在本實驗中，隨著飼料中精氨酸水平的增加，腸道NOS 活性顯著增高，進一步增強了魚體的免疫力。

影響魚類消化吸收能力的不僅僅是腸道消化酶活性，腸道本身形態(tài)結(jié)構(gòu)及發(fā)育情況同樣影響魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[29]，其中影響魚類腸道消化吸收能力的重要指標(biāo)包括腸道皺襞的高度、密度及排列狀態(tài)等[30,31]。精氨酸能顯著提高雜交鱘幼魚前腸的皺襞高度、絨毛高度和肌層厚度，以及中腸的皺襞高度[20]。在美國紅魚（Sciaenops ocellatus）和雜交條紋鱸（Morone chrysops×Morone saxatilis）的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[16,32]。隨精氨酸添加水平的升高，斜帶石斑魚（Epinephelus malabaricus）前中后腸的肌層厚度、皺襞高度均升高[33]。本實驗得到了相似的結(jié)果，適宜水平的精氨酸對松浦鏡鯉腸道皺襞高度、絨毛寬度和基層厚度都有顯著的改善。這說明精氨酸可以通過促進腸道的發(fā)育，提高腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，從而促進魚體的生長。此外有研究表明，精氨酸可以增加腸道重量[34,35]，這與本實驗結(jié)果一致，進一步說明了精氨酸可以促進腸道的健康發(fā)育。

綜上，精氨酸可以顯著提高松浦鏡鯉腸道的消化吸收功能及腸道的發(fā)育，適宜的添加水平為1.8%～2.4%。