余欣彤，黎桃敏，施文婷，陳偉媚，徐東婷，鄺 敏，程學(xué)仁

（廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244）

野菊花為菊科植物野菊Chrysanthemum indicumL.的干燥頭狀花序，味苦、辛，性寒，主要功效為清熱解毒、瀉火平肝，臨床常用于治療疔瘡癰腫、目赤腫痛、頭痛眩暈[1]等癥。野菊花的化學(xué)成分組成復(fù)雜，含有黃酮類、萜類、揮發(fā)油類、有機(jī)酸類等化合物[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，野菊花具有免疫、抗炎、神經(jīng)保護(hù)、抗菌抗病毒、保護(hù)心血管系統(tǒng)和抗腫瘤等作用[3]。

傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)上常以野菊花的外觀性狀、顏色、氣味等評(píng)價(jià)其質(zhì)量，2020 年版《中國(guó)藥典》“野菊花”項(xiàng)下的含量測(cè)定成分僅限于蒙花苷，但野菊花中其它黃酮類及有機(jī)酸類成分均具有明顯的藥理活性[4-5]。野菊花飲片經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒等生產(chǎn)工序制成配方顆粒后，其有效成分的變化情況和傳遞規(guī)律尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。僅將蒙花苷含量作為野菊花質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)，難以全面反映野菊花配方顆粒的整體質(zhì)量。中藥指紋圖譜可充分體現(xiàn)飲片加工制成配方顆粒整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中化學(xué)成分的改變[6-7]，實(shí)現(xiàn)對(duì)配方顆粒的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)。目前，關(guān)于野菊花HPLC 指紋圖譜研究主要集中在單一藥材、飲片或制劑，缺乏對(duì)野菊花飲片及其配方顆粒HPLC 指紋圖譜相關(guān)性的詳細(xì)研究，且分析方法多局限于相似度評(píng)價(jià)[2,8-9]。本研究通過(guò)建立野菊花飲片及其配方顆粒的HPLC 指紋圖譜，考察飲片及其配方顆粒質(zhì)量的相關(guān)性和差異性，旨在用于野菊花配方顆粒生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制，也為中藥配方顆粒替代傳統(tǒng)飲片的可行性研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters Arc 型高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；XP26 型百萬(wàn)分之一天平、ME204E 型萬(wàn)分之一天平（瑞士梅特勒—托利多公司）；Milli-Q Direct 型超純水系統(tǒng)（德國(guó)Merck 公司）；B-290 型噴霧干燥儀（瑞士BUCHI 公司）；JJ2000B 型百分之一天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；TC-15 型套式恒溫器（海寧市新華醫(yī)療器械廠）；YRE-501 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；DLSB-5/20 型低溫冷卻液循環(huán)水泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試藥與試劑

蒙 花 苷 對(duì) 照 品（ 批 號(hào)：111528-201911）、綠 原 酸 對(duì) 照 品（ 批 號(hào)：110753-202018）、 異 綠原酸A 對(duì)照品（批號(hào)：111782-201807）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；異綠原酸C 對(duì)照品（批號(hào)：wkq20031101）、新綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：wkq19021413）、 隱 綠 原 酸 對(duì) 照 品（ 批 號(hào)：wkq19120203）、 異 綠 原 酸B 對(duì) 照 品（ 批 號(hào)：wkq19012301）對(duì)照品均購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司；甲醇、磷酸、乙腈為色譜級(jí)（德國(guó)Merck公司），水為超純水，其余試劑均為分析純。

13 批野菊花飲片（編號(hào)：Y1-Y13）均經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為菊科植物野菊Chrysanthemum indicumL.的干燥頭狀花序，野菊花配方顆粒樣品（編號(hào)：S1-S13）由13 批飲片一一對(duì)應(yīng)制備，飲片產(chǎn)地、飲片及對(duì)應(yīng)配方顆粒編號(hào)見(jiàn)表1。

表1 樣品信息表Tab. 1 Origin information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以Waters XBridge C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）為色譜柱；以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0 ～ 16 min，5% ～ 24% A；16 ～19 min，24% ～ 29% A；19 ～ 29 min，29% ～ 30% A；29 ～ 34 min，30% ～ 32% A）；流速為1.2 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為326 nm；進(jìn)樣量為10 μL[10]。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 對(duì)照品適量，精密稱定，加14%乙腈配制成混合對(duì)照品母液A；另取蒙花苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇配制成對(duì)照品母液B；將對(duì)照品母液A、B 混合，搖勻，加14%乙腈定容，制成新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、蒙花苷質(zhì)量濃度分別為25.32 μg/ mL、31.32 μg/ mL、25.68 μg/ mL、48.09 μg/ mL、24.23 μg/ mL、25.98 μg/ mL、49.22 μg/ mL 的混合對(duì)照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 野菊花飲片供試品溶液 取野菊花飲片粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.3 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入水50 mL，加熱回流45 min，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)芗?0%甲醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率：200 W，頻率：50 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定重量，用30%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 野菊花配方顆粒供試品溶液 取野菊花配方顆粒適量，研細(xì)，精密稱取0.3 g，置具塞錐形瓶中，精密加入30%甲醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率：200 W，頻率：50 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定重量，用30%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液、空白溶劑、“2.3.1”項(xiàng)下野菊花飲片供試品溶液和“2.3.2”項(xiàng)下野菊花配方顆粒供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。野菊花飲片及其配方顆粒供試品色譜與對(duì)照品色譜在相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰，空白溶劑無(wú)明顯干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC 色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of specific test

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以10 號(hào)峰蒙花苷為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 值，結(jié)果均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取野菊花配方顆粒（S6）適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法平行制備野菊花配方顆粒供試品溶液6 份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以10 號(hào)峰蒙花苷為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 值，結(jié)果均小于3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取野菊花配方顆粒（S6）適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備野菊花配方顆粒供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h 測(cè)定，以10 號(hào)峰蒙花苷為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值，結(jié)果均小于3%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 圖譜的分析與評(píng)價(jià)

2.5.1 指紋圖譜的建立 按“2.3.1”和“2.3.2”項(xiàng)下方法分別制備13 批野菊花飲片及其配方顆粒供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”對(duì)色譜圖進(jìn)行匹配，分別得到野菊花飲片及其配方顆粒的指紋圖譜共有模式，同時(shí)分別生成野菊花飲片及其配方顆粒的對(duì)照?qǐng)D譜，見(jiàn)圖2-圖4。野菊花飲片及其配方顆粒的指紋圖譜共確定了10 個(gè)共有峰，通過(guò)與對(duì)照品對(duì)比，確定1 號(hào)峰為新綠原酸，2 號(hào)峰為綠原酸、3 號(hào)峰為隱綠原酸、6 號(hào)峰為異綠原酸B、7 號(hào)峰為異綠原酸A、8 號(hào)峰為異綠原酸C、10 號(hào)峰為蒙花苷。

圖2 野菊花飲片HPLC 指紋圖譜Fig. 2 HPLC fingerprint of Chrysanthemi Indici Flos pieces

圖3 野菊花配方顆粒HPLC 指紋圖譜Fig. 3 HPLC fingerprint of Chrysanthemi Indici Flos formula granules

圖4 野菊花飲片及配方顆粒的對(duì)照指紋圖譜Fig. 4 Reference map of Chrysanthemi Indici Flos pieces and formula granules

2.5.2 相似度評(píng)價(jià) 將同批次的野菊花飲片及其配方顆粒的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果顯示同批次野菊花飲片及其配方顆粒的指紋圖譜的相似度范圍為0.886 ～ 0.956，表明野菊花飲片及其配方顆粒具有較好的相似性，野菊花配方顆粒的生產(chǎn)工藝較穩(wěn)定。分別將不同批次的野菊花飲片及其配方顆粒的指紋圖譜與相應(yīng)的對(duì)照指紋圖譜相比較，結(jié)果見(jiàn)表2。不同批次野菊花飲片和配方顆粒的指紋圖譜與相應(yīng)的對(duì)照?qǐng)D譜的相似度范圍分別為0.968 ～ 0.999和0.867 ～ 0.999。將13 批野菊花飲片及其配方顆粒的對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果見(jiàn)表3。野菊花飲片的10 個(gè)共有峰在野菊花配方顆粒中均有所體現(xiàn)，野菊花飲片及其配方顆粒的對(duì)照指紋圖譜的相似度達(dá)到0.90 以上，表明野菊花飲片及其配方顆粒在化學(xué)成分種類上具有一致性，野菊花配方顆粒的質(zhì)量較穩(wěn)定。

表2 13 批野菊花飲片及其配方顆粒相似度結(jié)果Tab. 2 Results of similarity of 13 batches of Chrysanthemi Indici Flos pieces and formula granules

表3 野菊花飲片及其配方顆粒相似度結(jié)果Tab. 3 Results of similarity between Chrysanthemi Indici Flos pieces and formula granules

2.6 共有峰的相關(guān)性研究

不同批次野菊花飲片的HPLC 指紋圖譜中各共有峰的“峰面積/取樣量”值有所差異，這與不同批次野菊花飲片的質(zhì)量差異有關(guān)，也進(jìn)一步造成不同批次野菊花配方顆粒的HPLC 指紋圖譜中各共有峰的“峰面積/取樣量”值差異較大。說(shuō)明為了確保野菊花配方顆粒質(zhì)量的穩(wěn)定性，應(yīng)嚴(yán)格把關(guān)野菊花飲片的質(zhì)量。采用SPSS 20.0 軟件分別對(duì)13 批野菊花飲片及其配方顆粒的HPLC 指紋圖譜中各共有峰的“峰面積/取樣量”值進(jìn)行雙變量相關(guān)分析[11]，結(jié)果顯示野菊花飲片及其配方顆粒的10 個(gè)共有峰均具有極顯著正相關(guān)性，除峰4 和異綠原酸A 外，其余各共有峰的相關(guān)系數(shù)范圍為0.85 ～ 0.96，其中，新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的相關(guān)系數(shù)均大于0.90。

2.7 HPLC 指紋圖譜的相關(guān)性研究

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)13 批野菊花飲片及其配方顆粒各共有峰的“峰面積/取樣量”值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理后進(jìn)行主成分分析，計(jì)算得特征根和貢獻(xiàn)率，結(jié)果見(jiàn)表4。第一個(gè)因子的特征根為9.076，累積方差貢獻(xiàn)率為90.756%，表明第一個(gè)因子能基本反映全部原始變量的信息。13 批野菊花飲片及其配方顆粒的各成分因子載荷矩陣，見(jiàn)表5。

表4 主成分分析方差總解釋Tab. 4 Principal component analysis variance total interpretation

表5 各成分因子載荷矩陣Tab. 5 Factor load matrix of each component

以提取的主成分進(jìn)行綜合評(píng)分計(jì)算，計(jì)算主成分1 的表達(dá)式F1，F(xiàn)1=α1X1+α2X2+……+αiXm（特征向量α由成分矩陣中的第i 列因子載荷q 除以特征值λ 的算術(shù)平方根所得，X為原始指標(biāo)）[12]，主成分1 得分系數(shù)Ci為主成分1 的方差貢獻(xiàn)率，得到綜合評(píng)分函數(shù)F=F1× 0.907 56，野菊花飲片及其配方顆粒綜合評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表6。野菊花飲片及其配方顆粒的HPLC 指紋圖譜的綜合評(píng)分變化趨勢(shì)基本一致。以13 批野菊花飲片及其配方顆粒得HPLC 指紋圖譜的綜合評(píng)分為變量，采用SPSS 20.0 軟件對(duì)其進(jìn)行雙變量相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)為0.89（P＜0.01），表明野菊花飲片及其配方顆粒的HPLC 指紋圖譜具有明顯的正相關(guān)關(guān)系。

表6 13 批野菊花飲片及其配方顆粒的HPLC 指紋圖譜綜合評(píng)分結(jié)果Tab. 6 Results of HPLC fingerprint comprehensive score of 13 batches of Chrysanthemi Indici Flos pieces and formula granules

3 討論

本研究分析了13 批野菊花飲片及13 批配方顆粒的HPLC 指紋圖譜，從相似度結(jié)果來(lái)看，野菊花配方顆粒的10 個(gè)共有峰在野菊花飲片中均可追溯，并未出現(xiàn)主要化學(xué)成分的丟失，表明野菊花飲片經(jīng)加工制成配方顆粒后，其主要化學(xué)成分具有一致性。同批次野菊花飲片與其配方顆粒的相似度較高，除了野菊花配方顆粒（S2）外，不同批次野菊花飲片及其配方顆粒與相應(yīng)的指紋圖譜的相似度均大于0.95。野菊花飲片的對(duì)照指紋圖譜與野菊花配方顆粒的對(duì)照指紋圖譜相比，相似度為0.912，表明野菊花飲片及其配方顆粒之間具有良好的相關(guān)性，野菊花配方顆粒可作為野菊花飲片的補(bǔ)充應(yīng)用于臨床。從野菊花飲片及其配方顆粒各共有峰“峰面積/取樣量”值的雙變量分析結(jié)果來(lái)看，野菊花飲片及其配方顆粒的主要化學(xué)成分具有極顯著正相關(guān)關(guān)系，但13 批野菊花飲片及其配方顆粒的綠原酸類成分的相關(guān)系數(shù)具有差異性，新綠原酸、綠原酸與隱綠原酸的相關(guān)系數(shù)比異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 的相關(guān)系數(shù)大，可能與提取過(guò)程中野菊花飲片中部分酚酸類成分發(fā)生降解和轉(zhuǎn)化有關(guān)[2]。

2021 年國(guó)家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》中，指出中藥材、中藥飲片、中間體、中藥配方顆粒特征圖譜或指紋圖譜應(yīng)具相關(guān)性，并具有明確的量質(zhì)傳遞規(guī)律[13]。研究結(jié)果也表明野菊花飲片及其配方顆粒的內(nèi)在質(zhì)量具有正相關(guān)關(guān)系。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)原料藥的質(zhì)量控制，在保證中藥飲片質(zhì)量的前提下，更好地確保中藥配方顆粒質(zhì)量的穩(wěn)定可控。

4 結(jié)論

本研究采用HPLC 法測(cè)定野菊花飲片及其配方顆粒的指紋圖譜，測(cè)定方法具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)和雙變量相關(guān)性分析法對(duì)指紋圖譜的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，可以較全面地評(píng)價(jià)野菊花飲片及其配方顆?；瘜W(xué)成分的質(zhì)量相關(guān)性。結(jié)果顯示，野菊花飲片及其配方顆粒的主要化學(xué)成分基本相同，其內(nèi)在質(zhì)量具有正相關(guān)關(guān)系，可為野菊花飲片及其配方顆粒的質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。