黃艷，周其洋，高庭，童星,2*

(1.佛山市海天(高明)調(diào)味食品有限公司，廣東 佛山 528511；2.佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000)

米醋是以大米為原料，經(jīng)過液化、糖化、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵等工藝制備而成的調(diào)味品。含有豐富的氨基酸、有機(jī)酸、維生素及礦物質(zhì)，營養(yǎng)豐富。米醋品質(zhì)的好壞，除與醋酸菌有關(guān)外，還與米酒息息相關(guān)，原料大米的液化、糖化及酒精發(fā)酵是提升米酒及米醋品質(zhì)的關(guān)鍵。好曲出好酒，通過提升微生物的糖化力、液化力及產(chǎn)酒、產(chǎn)酸性能，選育不同類型的微生物，如醋酸菌等的選育或者固定化[1-3]，高產(chǎn)糖化酶的米根霉、酵母選育[4-5]，進(jìn)行相應(yīng)的工藝優(yōu)化，均在米酒品質(zhì)提升上取得了不錯的進(jìn)展。隨著技術(shù)的進(jìn)步，酶在調(diào)味品中廣泛應(yīng)用[6]，2種微生物的協(xié)同制曲已在醬油中應(yīng)用，4種酶活力都不同程度地提高[7]，為米曲微生物共發(fā)酵帶來了新的思考。本文通過對傳統(tǒng)酒曲的篩選，獲得一株高糖化酶、高產(chǎn)酸性蛋白酶，不產(chǎn)黑孢子的根霉菌。采用該菌株與增香產(chǎn)酯酵母共同培養(yǎng)制備米曲，發(fā)酵米酒，再經(jīng)醋酸菌作用獲得米醋，可顯著改善液態(tài)發(fā)酵食醋的口感與風(fēng)味，提升米醋的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

原材料：以佛山市海天調(diào)味食品有限公司生產(chǎn)的酒曲作為菌種篩選原材料。

培養(yǎng)基的制備方法：初篩培養(yǎng)基的制備方法：稱取200 g馬鈴薯，洗凈、去皮、切碎，加水1000 mL煮沸0.5 h，用紗布過濾，再加10～20 g葡萄糖和15～20 g瓊脂，充分溶解，分裝，高壓蒸汽滅菌(121 ℃，20 min)。復(fù)篩培養(yǎng)基的制備方法：牛肉膏 5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉 5 g，可溶性淀粉2 g，水1000 mL，pH 7.0～7.2，瓊脂20 g，高壓蒸汽滅菌(121 ℃，20 min)。

1.2 菌種的選育與鑒定方法

1.2.1 初篩方法

在滅菌后的超凈臺內(nèi)，將酒曲粉碎后，過40目篩，稱取篩下物25 g加入裝有225 mL無菌三級水的三角瓶中，加入數(shù)顆玻璃珠，于150 r/min搖床中振蕩30 min，使得酒曲的微生物均勻分布形成菌懸液。

將所得到的菌懸液進(jìn)行梯度稀釋，添加無菌水制成不同的稀釋梯度10-3，10-4，10-5，10-6CFU/mL的稀釋液，吸取0.2 mL加入含有去氧膽酸鈉和鏈霉素的PDA固體培養(yǎng)基，用涂布棒涂布均勻。

將上述平板置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，挑選具有根霉菌典型菌落形態(tài)的單菌落，挑種至PDA培養(yǎng)基再培養(yǎng)，進(jìn)而純化出根霉純菌。

1.2.2 復(fù)篩方法

將上述純化的單菌落轉(zhuǎn)接到淀粉鑒別培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以水解圈大小對各菌落進(jìn)行編號，培養(yǎng)一段時間后，挑選水解圈/菌落圈最大的菌株。

將挑選后的菌株經(jīng)過多次初篩、復(fù)篩后，最終篩選出一株根霉菌，命名為ZH805。

1.2.3 菌種鑒定

采用常規(guī)微生物鑒定方法。

1.3 協(xié)同制備種曲的方法

1.3.1 小斜面培養(yǎng)

將選育的根霉菌接種于PDA固體培養(yǎng)基中，增香產(chǎn)酯酵母接種于麥芽汁固體培養(yǎng)基(制備方法：1000 mL麥芽汁，15～20 g瓊脂，高壓蒸汽滅菌(115 ℃，20 min)中，分別于30 ℃培養(yǎng)2～3 d，即活化為一代菌株。

1.3.2 三角瓶培養(yǎng)

將1.3.1步驟的選育根霉菌接種于已滅菌的PDA液體培養(yǎng)基(制備方法：稱取200 g馬鈴薯，洗凈、去皮、切碎，加水1000 mL煮沸30 min，用紗布過濾，再加10～20 g葡萄糖，充分溶解后趁熱用紗布過濾，分裝，高壓蒸汽滅菌(121 ℃，20 min)，于30 ℃，150 r/min培養(yǎng)24 h，使其菌體濃度為107～108CFU/mL，于4 ℃冰箱中保藏備用。

將1.3.1步驟的增香產(chǎn)酯酵母接種于已滅菌的PDA液體培養(yǎng)基中，于30 ℃,150 r/min培養(yǎng)24 h，使其菌體濃度為107～108CFU/mL，于4 ℃冰箱中保藏備用。

1.3.3 種曲培養(yǎng)

將麩皮與米糠按照7∶3(質(zhì)量比)進(jìn)行混合、潤水，裝于曲盤中，每盤裝5 kg曲料并進(jìn)行滅菌，然后將1.3.2步驟的選育根霉菌和增香產(chǎn)酯酵母分別接種于已事先滅菌的曲料中，于30 ℃條件下進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)2～3 d即可成熟，為種曲。

1.4 成曲及米酒制備方法

大米→洗凈→浸泡→蒸飯→淋冷→拌曲→糖化發(fā)酵→過濾處理→巴氏滅菌→成品米酒。

以大米為原料，加入自來水浸泡6～8 h，濾干水后，于0.15 MPa壓力下蒸煮30 min，待米飯冷卻后分別添加上述種曲，選育根霉菌接種量為1%，產(chǎn)酯酵母接種量為6‰～8‰，同時以根霉菌3.866、根霉菌Q303為對照，于30 ℃、相對濕度80%左右條件下培養(yǎng)48～72 h，培養(yǎng)結(jié)束即為成熟曲料，取成熟曲料檢測糖化酶、酸性蛋白酶和酯化酶活力。

將曲料加水，接入已活化好的活性干酵母，接種量為5%，接種后將曲料攪拌均勻。于28～33 ℃條件下靜置發(fā)酵4～5 d，發(fā)酵結(jié)束后通過板框過濾器進(jìn)行壓榨，得到米酒清液，并檢測米酒清液的酒精度。

1.5 發(fā)酵米醋制備方法

將上述米酒清液泵送至醋酸發(fā)酵罐，接入已活化好的醋酸菌進(jìn)行醋酸發(fā)酵，采用Frings深層液態(tài)發(fā)酵罐(德國福林斯公司)，獲得對應(yīng)米醋醋坯。

1.6 檢測方法

1.6.1 糖化酶活力、酯化酶活力的測定

參照國標(biāo)GB 1886.174-2016《食品添加劑 食品工業(yè)用酶制劑》中的方法。

1.6.2 酸性蛋白酶活力的測定

參照國標(biāo)GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》。

1.6.3 酒精度的測定

采用蒸餾-重鉻酸鉀比色法測定[8]。

1.6.4 還原糖的測定

采用國標(biāo)GB/T 5009.7-2016《食品中還原糖的測定》[9]。

1.6.5 總酸、氨基酸態(tài)氮的測定

參照國標(biāo)GB/T 13662-2008《黃酒》中的方法[10]。

1.6.6 總酯的測定

參考GB/T 19777-2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品 山西老陳醋》[11]。

1.6.7 不揮發(fā)酸的測定

采用酸堿中和滴定法。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 菌種的選育及鑒定

將篩選出的選育根霉菌進(jìn)行相關(guān)的生理生化特性檢測，其檢測結(jié)果與根霉菌3.866對比，基本一致。

依據(jù)1973年科學(xué)出版社出版的周德慶主編的《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊》、《常見與常用真菌》相關(guān)書籍作為菌株形態(tài)學(xué)特征的參考依據(jù)。

本文篩選的選育根霉菌的菌落形態(tài)為PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)15 h后，菌落直徑約為1.0～1.4 cm，菌絲致密。36 h后菌絲鋪滿整個平板，該平板的形態(tài)見圖1。

圖1 根霉ZH805菌落形態(tài)圖Fig.1 The colony morphology of Rhizopus ZH805

由圖1可知，選育根霉菌均為白色孢子，無黑色孢子產(chǎn)生。

2.2 不同根霉菌制備成曲及發(fā)酵米酒關(guān)鍵指標(biāo)的檢測結(jié)果

對不同根霉制備的成熟曲料檢測糖化酶、酸性蛋白酶和酯化酶活力，對應(yīng)曲料發(fā)酵成熟后，檢測米醋的酒精度和還原糖指標(biāo)，其檢測結(jié)果見表1。

表1 不同根霉菌制備曲料及發(fā)酵米酒檢測結(jié)果Table 1 The testing results of koji materials prepared by different Rhizopus and fermented rice wine

由表1可知，采用選育根霉菌制備的米曲檢測糖化酶、酸性蛋白酶和酯化酶較根霉菌3.866分別提高了58%、43%、37.5%，較根霉菌Q303分別提高了17.4%、35%、31%。采用選育根霉菌發(fā)酵的米酒，其酒精度較根霉3.866和根霉Q303分別提高了24.4%和12%，且其清液殘留的還原糖也明顯高于其他兩株根霉，充分說明根霉ZH805較其他兩株根霉具有較高的原料利用率。

2.3 米醋關(guān)鍵理化指標(biāo)和感官鑒評結(jié)果

表2 不同曲料發(fā)酵米醋檢測結(jié)果Table 2 The testing results of fermented rice vinegar with different koji materials

由表2可知，對比現(xiàn)有工藝生產(chǎn)米醋與選育根霉菌制備的米醋，選育根霉菌的各項(xiàng)理化指標(biāo)均要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于常規(guī)的液態(tài)發(fā)酵米醋，特別是其氨基酸態(tài)氮、總酯與不揮發(fā)酸方面。對比不同根霉菌制備的米醋，選育根霉菌在酸度相近的情況下，其他各項(xiàng)理化指標(biāo)均優(yōu)于另外兩組根霉發(fā)酵的米醋。

將現(xiàn)有工藝生產(chǎn)的米醋、選育根霉菌與根霉菌3.866、根霉菌Q303發(fā)酵的米醋在色澤、香氣、刺激性、回甜度、酸味等方面進(jìn)行感官鑒評分析，感官鑒評由經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練的專業(yè)人員進(jìn)行，以上評價指標(biāo)的分值為0～5分，分?jǐn)?shù)越高，該項(xiàng)指標(biāo)越好，其鑒評結(jié)果見表3和圖2。

表3 米醋感官鑒評結(jié)果Table 3 The sensory evaluation results of rice vinegar

圖2 發(fā)酵米醋感官鑒評結(jié)果Fig.2 The sensory evaluation results of fermented rice vinegar

由表3和圖2可知，與原工藝生產(chǎn)的米醋相比，根霉菌大米制曲發(fā)酵的米醋在香氣、色澤、回甜度等方面均有較大改善，且選育根霉菌在香氣、色澤和回甜度3個維度上的表現(xiàn)均要優(yōu)于其他兩株根霉菌。綜上所述，采用選育根霉菌米曲制備工藝可以顯著改善液態(tài)發(fā)酵食醋的口感與風(fēng)味，全面提升米醋的質(zhì)量。

3 結(jié)論

本文通過從米曲中篩選優(yōu)勢根霉菌，結(jié)合我司優(yōu)秀的產(chǎn)酯酵母共同制曲后，進(jìn)行米酒發(fā)酵，進(jìn)而借助醋酸菌制備米醋。不同于同行業(yè)以往的思路，進(jìn)行單一優(yōu)勢菌種的選育，本文中選育的根霉來源于酒曲，增香酵母為我司自有優(yōu)勢酵母，借助這種優(yōu)勢微生物互補(bǔ)作用，首先增大工業(yè)化大生產(chǎn)下米酒工藝的穩(wěn)定性，進(jìn)而更加穩(wěn)定地提升米醋的品質(zhì)。