沈亞芳，曹 華

(1.南京市江寧區(qū)婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心，江蘇 南京 211199；2.南京市江寧醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南京 211199)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活方式的轉(zhuǎn)變，肥胖和2型糖尿病在全球范圍內(nèi)迅速流行，并已成為我國(guó)面臨的重大公共衛(wèi)生問題之一。脂肪組織是機(jī)體重要的能量?jī)?chǔ)存和內(nèi)分泌器官，根據(jù)功能和形態(tài)學(xué)的不同可分為白色脂肪組織和棕色脂肪組織兩種類型。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在冷刺激或β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑作用下，白色脂肪組織中部分脂肪細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榻馀悸?lián)蛋白1(UCP1)陽性的米色脂肪細(xì)胞，其產(chǎn)熱耗能能力雖小于經(jīng)典的棕色脂肪細(xì)胞，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于白色脂肪細(xì)胞，這一生物學(xué)現(xiàn)象稱為白色脂肪棕色化。不同于白色脂肪細(xì)胞，棕色脂肪細(xì)胞和米色脂肪細(xì)胞的脂滴小而密集，線粒體內(nèi)高表達(dá)UCP1，在靜息狀態(tài)下能夠發(fā)揮強(qiáng)大的非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱作用并消耗大量熱量。目前，探尋增強(qiáng)棕色脂肪細(xì)胞功能和促白色脂肪棕色化的有效手段已成為治療肥胖及其相關(guān)代謝性疾病的新策略[1]。

越來越多的證據(jù)表明，棕色脂肪組織與骨代謝間存在密切聯(lián)系。骨密度與體內(nèi)棕色脂肪的含量呈正相關(guān)[2]，機(jī)制研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，脂肪組織和骨均可釋放多種具有生物活性的物質(zhì)實(shí)現(xiàn)器官間的互調(diào)，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、骨鈣素和硬骨抑素等[3]。重要的是，脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞均起源于中胚層，這提示，作用于骨組織的藥物可能對(duì)脂肪細(xì)胞存在潛在的作用。

目前，超過50%的糖尿病患者合并有骨密度減低，骨質(zhì)疏松骨折已成為老年糖尿病患者致殘致死的主要原因之一。唑來膦酸(Zoledronic acid，ZA)是臨床上治療骨質(zhì)疏松的一線藥物，它能抑制破骨細(xì)胞的功能，從而抑制骨吸收。作為糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥患者常用的臨床治療藥物，早期給予唑來膦酸治療可顯著預(yù)防糖尿病性骨質(zhì)疏松的發(fā)生[4]。值得注意的是唑來膦酸可顯著緩解肥胖小鼠的肝臟脂質(zhì)沉積和脂肪變性，發(fā)揮代謝改善作用。但是，唑來膦酸是否具有調(diào)控白色脂肪棕色化的作用尚不清楚。本研究使用高脂喂養(yǎng)的肥胖小鼠模型和C3H10T1/2誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞，在動(dòng)物和細(xì)胞水平探究唑來膦酸在白色脂肪棕色化中的作用。

1 材料與方法

1.1材料：C57BL/6小鼠(上海斯萊克有限公司)，唑來膦酸(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq TM(大連Takara公司)，UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16基因引物(上海英濰捷基有限公司)，高脂飼料(美國(guó)Research Diet公司)，UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16抗體(美國(guó)Abcam公司)，小動(dòng)物PET/CT(德國(guó)Siemens公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組：8周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠40只，分為普通飲食組(熱量比：蛋白質(zhì)26%，碳水化合物64%，脂肪10%)和高脂飲食組(熱量比：蛋白質(zhì)14%，碳水化合物32%，脂肪54%)，高脂喂養(yǎng)4周后將高脂組分為唑來膦酸干預(yù)組(HFD+ZA)和高脂對(duì)照組(HFD+PBS)，干預(yù)組腹腔注射唑來膦酸50 μg/kg，每周注射一次，正常對(duì)照組和高脂對(duì)照組腹腔注射等體積PBS，持續(xù)4周。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2.2小動(dòng)物PET/CT檢查：唑來膦酸干預(yù)結(jié)束后，小鼠腹腔注射18F-氟代脫氧葡萄糖(18F-FDG，100～140 μCi)，60 min之后麻醉小鼠，采用小動(dòng)物PET/CT對(duì)小鼠進(jìn)行掃描并采集PET信號(hào)，同步采集CT信號(hào)用來進(jìn)行PET圖像的衰減校正，分析小鼠皮下白色脂肪組織(subcutaneous white adipose tissue，sWAT)18F-FDG的最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(SUVmax)。

1.2.3標(biāo)本采集：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，留取小鼠sWAT，一部分組織4%多聚甲醛固定，進(jìn)行HE和免疫組化染色分析，剩余組織立即液氮冷凍后保存待測(cè)。

1.2.4HE染色:取三組小鼠sWAT樣本4%多聚甲醛固定后脫水并包埋于石蠟中，在二甲苯和梯度酒精中脫蠟后使用蘇木精進(jìn)行核染色，而后置于伊紅染液中染色后脫水、透明、封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察和拍照。

1.2.5免疫組化：取小鼠sWAT樣本4%多聚甲醛固定后進(jìn)行梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、染色、洗脫和封片，在200倍顯微鏡視野下進(jìn)行觀察和拍照。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)：分別取三組小鼠sWAT 30 mg，置于無RNA酶的EP管中，加入1ml Trizol勻漿后，經(jīng)氯仿抽提、異丙醇沉淀、乙醇洗滌和DEPC水平溶解后提取RNA。取1μg RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用cDNA模板在ABI7300型定量PCR儀檢測(cè)棕色化相關(guān)基因的mRNA水平，使用β-actin作為內(nèi)參基因，采用Ct比較法(2-△△CT)計(jì)算目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的轉(zhuǎn)錄水平，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.7蛋白免疫印跡(Western blot)：取三組小鼠sWAT 150 mg，經(jīng)蛋白裂解、離心后提取總蛋白并使用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，每個(gè)樣本吸取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、抗體孵育、化學(xué)發(fā)光、顯影和定影后，使用Image-pro plus6.0軟件對(duì)目的蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值進(jìn)行分析，以相對(duì)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

1.2.8C3H10T1/2脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化：C3H10T1/2細(xì)胞在培養(yǎng)皿中長(zhǎng)滿后加入誘導(dǎo)液A(正常培養(yǎng)液含重組人胰島素5 μg/ml，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤0.5 mmol/L，地塞米松1 μmol/L，吲哚美辛125 nmol/L，三碘甲酰原氨酸1 nmol/L，羅格列酮1 μmol/L)，2 d后換成誘導(dǎo)液B(正常培養(yǎng)液含重組人胰島素5 μg/ml，三碘甲酰原氨酸1 nmol/L，羅格列酮1 μmol/L)，過2 d后換成正常培養(yǎng)液，待90%以上的細(xì)胞呈現(xiàn)圓形并出現(xiàn)脂滴后，表示C3H10T1/2脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)成功。

2 結(jié)果

2.1唑來膦酸恢復(fù)HFD小鼠sWAT中18F-FDG 攝取水平和UCP1表達(dá)：小動(dòng)物PET/CT的結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組小鼠相比，HFD組小鼠皮下脂肪的SUVmax水平明顯減低，而唑來膦酸干預(yù)后小鼠sWAT的SUVmax水平顯著升高。見圖1。HE染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，HFD組小鼠sWAT脂肪細(xì)胞的體積增大，而唑來膦酸干預(yù)后sWAT脂肪細(xì)胞的體積顯著減小。見圖2。進(jìn)一步利用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)對(duì)UCP1蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，相較對(duì)照組小鼠，HFD組小鼠sWAT中UCP1的表達(dá)下降，而唑來膦酸干預(yù)后小鼠sWAT中UCP1的表達(dá)明顯恢復(fù)。見圖3。

圖2 三組小鼠皮下脂肪組織HE染色形態(tài)圖

圖3 三組小鼠皮下脂肪組織UCP1免疫組化染色，黑色箭頭指示陽性染色

2.2唑來膦酸恢復(fù)HFD小鼠sWAT中棕色化相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達(dá)：定量PCR的結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，HFD組小鼠sWAT中UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16的mRNA水平顯著減低(分別是對(duì)照組的0.26±0.04、0.23±0.1、0.19±0.06、0.16±0.05倍，均P<0.01)，而唑來膦酸干預(yù)后顯著恢復(fù)上述基因的mRNA表達(dá)(分別是對(duì)照組的0.88±0.05、0.76±0.06、0.48±0.06、0.75±0.04倍)。見圖4。Wes-tern blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，相較于對(duì)照組小鼠，HFD組小鼠sWAT中UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而唑來膦酸干預(yù)可恢復(fù)上述蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖5。

注：*表示與Control組相比，P<0.01；#表示與HFD+PBS組相比，P<0.01

2.3唑來膦酸上調(diào)C3H10T1/2脂肪細(xì)胞棕色化基因mRNA和蛋白表達(dá)：為探究唑來膦酸對(duì)白色脂肪棕色化的直接調(diào)控作用，C3H10T1/2脂肪細(xì)胞使用唑來膦酸(100 nmol/l)處理48 h后，檢測(cè)棕色化相關(guān)基因的mRNA和蛋白水平表達(dá)。定量PCR結(jié)果顯示，UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16的mRNA表達(dá)在唑來膦酸處理后均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別是對(duì)照組的4.26±0.98、3.01±0.16、2.44±0.28、1.95±0.29倍，均P<0.01)。見圖6。Western blot結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，唑來膦酸處理后顯著上調(diào)UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16的蛋白水平。見圖7。

注：*表示與Control組相比，P<0.01；#表示與HFD+PBS組相比，P<0.01。

3 討論

18F-FDG是一種葡萄糖類似物，可被代謝旺盛的器官攝取，使用小動(dòng)物PET/CT可檢測(cè)18F-FDG在體內(nèi)的分布情況，是評(píng)估棕色脂肪功能和白色脂肪棕色化的有力手段。本研究采用PET/CT分析小鼠皮下脂肪的18F-FDG攝取水平，發(fā)現(xiàn)唑來膦酸處理后小鼠皮下脂肪代謝活動(dòng)顯著增強(qiáng)，對(duì)18F-FDG攝取增加，免疫組化染色進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)皮下脂肪組織UCP1的表達(dá)升高。CIDEA、PGC1-α和PRDM16是白色脂肪棕色化中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控因子，筆者對(duì)棕色化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平分析后，發(fā)現(xiàn)唑來膦酸可明顯上調(diào)皮下脂肪中棕色化相關(guān)基因的表達(dá)。這些證據(jù)說明，唑來膦酸具有促白色脂肪棕色化的作用。

注：*表示與Control組相比，P<0.01；#表示與HFD+PBS組相比，P<0.01圖5 UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16在三組小鼠皮下脂肪組織中的蛋白表達(dá)水平

注：*表示與Control組相比，P<0.01圖6 C3H10T1/2脂肪細(xì)胞經(jīng)唑來膦酸(100 nmol/L)處理后，UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16的mRNA相對(duì)表達(dá)水平

唑來膦酸作為一種雙磷酸鹽類藥物，其靶點(diǎn)主要為法尼基焦磷酸合成酶，持續(xù)作用于破骨細(xì)胞[5]，除外作用于破骨細(xì)胞，體外研究還發(fā)現(xiàn)，雙磷酸鹽類藥物還可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化并抑制其成脂分化[6]，提示其藥理作用的復(fù)雜性。既往研究證實(shí)，骨細(xì)胞分泌的骨形態(tài)發(fā)生蛋白7和骨硬化蛋白具有促白色脂肪棕色化的作用，成骨細(xì)胞來源的神經(jīng)肽Y同樣參與了白色脂肪棕色化的調(diào)節(jié)[7]。本研究中唑來膦酸促白色脂肪棕色化是否依賴于骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分泌的生物活性物質(zhì)值得進(jìn)一步探索。筆者的細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞經(jīng)唑來膦酸處理后棕色化相關(guān)基因的表達(dá)顯示升高，這提示唑來膦酸具有促白色脂肪棕色化的直接調(diào)控作用，但其中的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。

注：*表示與Control組相比，P<0.01圖7 C3H10T1/2脂肪細(xì)胞經(jīng)唑來膦酸(100 nmol/L)處理48 h后，UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16的蛋白表達(dá)水平

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)唑來膦酸可上調(diào)白色脂肪棕色化相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)白色脂肪棕色化的發(fā)生，研究結(jié)果有助于為肥胖及相關(guān)代謝性疾病的治療提供新的思路。