劉文靜，李元芹，李 靜，張毛為，陳 碧

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 徐州 221000)

目前臨床上相當(dāng)多的支氣管哮喘患者對(duì)糖皮質(zhì)激素抗炎治療反應(yīng)差，表現(xiàn)出不同程度的不可逆氣流受限，導(dǎo)致病情持續(xù)惡化。目前認(rèn)為，氣道重塑(airway remodeling)是引起不可逆性氣流受限和難治性哮喘的病理基礎(chǔ)，其中ASMCs的過度增殖是氣道重塑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和中心性環(huán)節(jié)[1]。目前ASMCs已成為哮喘氣道重塑研究及治療的重要標(biāo)靶。

IL-17是一種強(qiáng)大的前炎性因子，它通過誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，介導(dǎo)局部或全身炎性反應(yīng)。越來越多的證據(jù)表明，IL-17與支氣管哮喘尤其是重癥哮喘的發(fā)病關(guān)系密切[2-3]，能夠誘發(fā)多種炎性因子的釋放，促進(jìn)氣道炎性反應(yīng)[4]。但目前對(duì)于IL-17參與氣道重構(gòu)的機(jī)制研究較少。近來等研究發(fā)現(xiàn)，IL-17能夠誘導(dǎo)人ASMC表達(dá)生長(zhǎng)相關(guān)性癌基因(GRO)的表達(dá)或激活ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)ASMCs的遷移，參與哮喘氣道重塑[5]。本研究旨在探討IL-17對(duì)于ASMCs增殖的影響及其可能的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1材料：IL-17(北京中杉公司);四甲基偶氮唑鹽(北京中杉公司)；兔抗大鼠ERK1/2、兔抗大鼠磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)抗體(碧云天生物科技研究所)；U0126(碧云天生物科技研究所)；羊抗兔二抗、兔抗鼠α平滑肌肌動(dòng)蛋白(SM-α-actin)抗體、磷酸鹽緩沖液(PBS)、D-Hanks緩沖溶液(北京中杉金橋)。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胰酶(美國(guó)GIBCO公司)；胎牛血清(FBS，杭州四季青生物有限公司)。

1.2大鼠ASMCs的體外培養(yǎng)：腹腔麻醉并處死大鼠，無菌摘取氣管，參照文獻(xiàn)利用組織塊貼壁法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)[6]。胰酶消化法進(jìn)行ASMCs傳代通并自然純化，采用第5～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。本研究遵循的程序符合徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，得到該委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3大鼠ASMCs的鑒定：倒置光學(xué)相差顯微鏡觀察傳代后的ASMCs大小、形狀、排列和生長(zhǎng)等形態(tài)學(xué)特征。利用細(xì)胞熒光免疫組織化學(xué)染色測(cè)定SM-α-actin的表達(dá)，具體過程如下：將第5代的大鼠ASMCs以1×105/ml細(xì)胞密度種于6孔板內(nèi)，制備細(xì)胞爬片，用4%多聚甲醛固定20 min，加入Triton-X100作用10 min透膜。常規(guī)免疫熒光染色，一抗為兔抗鼠SM-α-actin抗體，一抗4℃過夜后滴加生物素化二抗，37℃孵育30min。滴加SABC-FITC，37℃孵育30 min。利用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.4四甲基偶氮唑鹽(MTT)微量比色法測(cè)定ASMCs增殖：將傳代后的ASMCs按1×104/孔接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h同步化，換用含1%胎牛血清的培養(yǎng)液，隨機(jī)分為五組，每組6個(gè)復(fù)孔。①空白對(duì)照組：每孔加入DMEM 100 μl；②IL-17 1 ng/ml組；③IL-17 10 ng/ml組；④IL-17 100 ng/ml組；⑤U0126組(IL-17阻滯劑組)。將藥物處理過的細(xì)胞，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)不同時(shí)間(24 h、48 h、72 h)后，每孔加入MTT 50 μl孵育4 h，棄上清液后每孔加DMSO 150 μl，微型振蕩器混勻10 min。在波長(zhǎng)490 nm處，檢測(cè)各孔OD值。根據(jù)公式計(jì)算各組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(空白對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/空白對(duì)照組OD值×100%。

1.5Western blot測(cè)定ERK1/2、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白的表達(dá)：將大鼠ASMC以5×105/L的細(xì)胞密度接種培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。細(xì)胞密度接近70%時(shí)，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化于G0期。按以下分組對(duì)細(xì)胞給予相應(yīng)處理：①對(duì)照組；②IL-17 1 ng/ml組；③IL-17 10 ng/ml組；④IL-17 100 ng/ml組；⑤阻滯劑組，分別于培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h。收集細(xì)胞提取蛋白、SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后雜交，以NBT/BCIP顯色。一抗為兔抗鼠ERK1/2抗體、兔抗鼠p-ERK1/2抗體；條帶灰度分析用Image J軟件分析系統(tǒng)分析總ERK1/2蛋白、p-ERK1/2和內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)吸光度值(A值)，以目的蛋白條帶A值和內(nèi)參β-actin A值的比值代其相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1ASMCs鑒定：在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)的細(xì)胞呈梭形，貼壁平行生長(zhǎng)，束狀排列，密集與稀疏處相互交錯(cuò)呈峰谷狀，為ASMC的典型特征。免疫熒光染色法表明，超過95%的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見大量的綠色熒光，為SM-α-actin陽性染色，證實(shí)所培養(yǎng)細(xì)胞為ASMCs。見圖1。

A.倒置顯微鏡下的細(xì)胞呈“峰谷狀”(×100)

B.免疫熒光顯微鏡下ASMCs發(fā)綠色熒光(×400)

2.2IL-17對(duì)ASMCs增殖的影響：觀察不同濃度梯度的IL-17在分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h時(shí)對(duì)ASMCs增殖率的影響。隨著IL-17濃度的增加，ASMCs增殖率也隨之增加，0.1～1 ng/ml IL-17在24 h、48 h和72 h內(nèi)均可促進(jìn)ASMCs的增值，其中以48 h內(nèi)作用最為明顯，24 h內(nèi)作用較平緩，而72 h的作用則隨著細(xì)胞狀態(tài)的老化而變化不明顯。另外可以看出在濃度>1 ng/ml之后細(xì)胞增殖的趨勢(shì)可能為進(jìn)入平臺(tái)期。見圖2。

圖2 MTT法檢測(cè)不同濃度梯度IL-17作用不同時(shí)間對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞的促增殖作用

2.3IL-17對(duì)ERK1/2磷酸化的作用：其中1 ng/ml、10 ng/ml均能促進(jìn)p-ERK1/2的表達(dá)，而100 ng/ml因濃度過高反而導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加，ERK1/2的磷酸化降低。加入IL-17的阻滯劑則能拮抗其對(duì)ERK1/2的促磷酸化作用。而總ERK1/2無變化。見圖3。

(a)為不同濃度IL-17及其阻斷劑對(duì)p-ERK1/2的作用；(b)為對(duì)不同濃度IL-17及其阻斷劑對(duì)p-ERK1/2作用的分析；與對(duì)照組比較，①P<0.05；②P<0.05圖3 p-ERK1/2在不同濃度的IL-17及其阻斷劑作用下的表達(dá)

3 討論

哮喘氣道重塑主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞黏液性化生、ASMCs的增生和肥大、基底膜增厚及上皮下纖維化、血管形成的增加、ECM的沉積等[1]。ASMCs是參與氣道重塑的關(guān)鍵細(xì)胞，其過度增殖、肥大不僅增加了影響氣道管徑的收縮力，而且導(dǎo)致管壁增厚，引起氣道狹窄。因此，探尋促進(jìn)ASMCs增殖的作用因素、抑制ASMCs的增殖對(duì)于控制重癥哮喘、難治性哮喘具有非常重要的意義。

作為Th17細(xì)胞最主要的效應(yīng)分子，近年來IL-17在哮喘發(fā)病中的作用逐漸受到重視。體外研究證實(shí)，IL-17能夠刺激上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌IL-6、IL-8,IL-11,GM-CSF,VEGF等一系列炎性因子和細(xì)胞因子，促進(jìn)氣道炎性細(xì)胞的募集、增殖和活化[2-3]。IL-17受體缺陷的小鼠接受致敏原刺激后，中性粒細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞向氣道募集被抑制，氣道炎性反應(yīng)減輕[7-9]。此外，IL-17可以特異性激活黏液蛋白MUC5AC和MUC5B基因，參與氣道黏液高分泌的形成。但目前對(duì)于IL-17與氣道重塑研究較少[10]。

近年來有學(xué)者對(duì)于IL-17與ASMCs增殖的關(guān)系做了初步研究，但結(jié)果并不一致。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞數(shù)量與哮喘小鼠的黏液分泌、上皮下膠原沉積、氣道壁厚度程正相關(guān)[11]。給予anti-IL-17 mAb 干預(yù)后可以明顯減輕OVA誘導(dǎo)的氣道平滑肌增厚、肺組織膠原沉積。他們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Th17 cells 在體外并不能直接促進(jìn)ASMCs的增殖，而是通刺激氣道上皮細(xì)胞分泌HB-EGF，間接促進(jìn)ASMCs的增殖。而也有學(xué)者研究[10]發(fā)現(xiàn)，IL-17A在體外能夠直接促進(jìn)人ASMCs的增殖，應(yīng)用IL-17A單克隆抗體中和IL-17后其促ASMCs增殖作用被抑制。本研究利用應(yīng)用IL-17干預(yù)體外培養(yǎng)的大鼠ASMCs，結(jié)果顯示大鼠ASMCs增殖率較對(duì)照組增加，提示IL-17能夠直接促進(jìn)ASMC的增殖,參與氣道重塑。本研究在MTT試驗(yàn)在0.1～1 ng/ml做了濃度梯度研究，結(jié)果顯示在此濃度范圍間隨著IL-17濃度的增加，ASMCs增殖率也隨之增加，濃度大于1 ng/ml之后細(xì)胞增殖的趨勢(shì)已進(jìn)入平臺(tái)期。而在時(shí)間點(diǎn)上，本研究發(fā)現(xiàn)以48 h內(nèi)促增殖作用最為明顯，而72 h的作用則隨著細(xì)胞狀態(tài)的老化而變化不明顯。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)信號(hào)通路是把細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到核內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)的重要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，是多數(shù)生長(zhǎng)因子和炎性介質(zhì)調(diào)控ASMCs增殖的共同通路。ERK是該通道中的關(guān)鍵酶，已發(fā)現(xiàn)它在氣道平滑肌上廣泛分布，主要為ERK1、ERK2(ERK1/2)兩種亞型。在體外培養(yǎng)的人氣道平滑肌細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)，IL-17能夠激活ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)ASMCs的遷移[12]。本研究中Western blot結(jié)果顯示，IL-17干預(yù)后ASMC p-ERK1/2的表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，而總ERK1/2無變化。而加入ERK1/2抑制劑后IL-17組對(duì)大鼠ASMC促增殖作用被抑制，表明IL-17能夠通過激活ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)ASMC的增殖。

綜上所述，IL-17能夠促進(jìn)大鼠ASMC的增殖，可能與激活ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)。本研究結(jié)果為闡明IL-17參與哮喘氣道重塑的機(jī)制提供了新的依據(jù)，為以后臨床以IL-17為靶點(diǎn)治療哮喘提供了理論依據(jù)。