朱嫦琳 陳展?jié)?李啟欣

佛山市第一人民醫(yī)院檢驗科（廣東佛山528000）

原發(fā)性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全世界最常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)位于常見癌癥死亡原因的第三位［1-2］。2019年國家癌癥中心發(fā)布的最新全國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肝癌發(fā)病率位于所有惡性腫瘤第四位［3］。由于具有早期隱蔽、進展期迅速、復(fù)發(fā)率高及對化療藥物不敏感等特點，HCC 預(yù)后較差［4］。甲胎蛋白（alpha?fetoprotein，AFP）及維生素K 缺乏誘導(dǎo)的異常蛋白（protein induced by vitamin K absence or antagonist?Ⅱ，PIVKA?Ⅱ）均為臨床上較常見的HCC 腫瘤標志物，而目前常用于預(yù)測腫瘤標志物對HCC 診斷價值評價的研究多采用受試者工作特征（receiver operating characteristic ROC）曲線，通過曲線下面積（area under curve，AUC）評判不同預(yù)測模型的優(yōu)劣，存在一定的不足。決策曲線分析法（decision curve analysis，DCA）是一種評價診斷方法或預(yù)測模型凈受益的方法，主要關(guān)注臨床效用問題［5］，是ROC曲線的一個良好的補充。本研究同時采用ROC及DCA方法評價PIVKA?Ⅱ和AFP單獨及聯(lián)合檢測對原發(fā)性HCC的診斷價值，報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2016年5月至2020年7月期間于佛山市第一人民醫(yī)院門診及住院患者、體檢健康者標本共982 例，按研究目的分為以下6 組：（1）原發(fā)性肝細胞癌組（肝細胞癌組）：經(jīng)本院病理確診且在本院初診為原發(fā)性HCC 患者共285 例，均為乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）陽性。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟和美國癌癥聯(lián)合委員會（International Union for Cancer Control/American Joint Committee on Cancer，UICC/AJCC）發(fā)布的第七版TNM 腫瘤分期標準，其中202例具備完整TNM 分期資料；（2）慢性乙型肝炎組（肝炎組）：均為HBsAg陽性且經(jīng)臨床確診為慢性乙型肝炎患者，并排除發(fā)生肝硬化的患者，共266 例；（3）肝硬化組：均為HBsAg 陽性且經(jīng)臨床確診為肝硬化患者共223 例；（4）肝內(nèi)膽管細胞癌組（肝膽管癌組）：經(jīng)本院病理確診的肝內(nèi)膽管細胞癌患者共23 例；（5）肝部繼發(fā)性惡性腫瘤組（肝繼發(fā)瘤組）：經(jīng)本院病理確診的肝部繼發(fā)性惡性腫瘤患者共17 例；（6）正常對照組：于本院體檢中心體查指標無異常，且經(jīng)B 超排除腹部疾病者共168 例。所有入選對象在采血前半年內(nèi)均未服用維生素K 制劑及維生素K 拮抗類藥物，均排除嚴重血液疾病、合并其他腫瘤患者。本研究經(jīng)過佛山市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會討論批準后實施，所有入選對象均知情同意。研究對象一般資料見表1。

表1 研究對象一般資料Tab.1 General information of subjects

1.2 診斷標準原發(fā)性肝細胞癌診斷依據(jù)為《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2017年版）》［6］。慢性乙型肝炎診斷依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》［7］。肝硬化診斷依據(jù)為《2015JSGE 循證臨床實踐指南：肝硬化》［8］。肝內(nèi)膽管細胞癌診斷依據(jù)病理學(xué)檢查結(jié)果。肝部繼發(fā)性惡性腫瘤診斷結(jié)合肝外腫瘤的病理學(xué)確診及影像學(xué)資料。

1.3 方法

1.3.1 血清樣本采集1-5 組受試者在用藥或治療前清晨空腹采集血樣，6 組受試者在體檢當天清晨空腹采集血樣，采用帶分離膠促凝真空采血管采集靜脈血3 mL，3 000 r/min 離心15 min，取上層血清用于PIVKA?Ⅱ和AFP 測定，所有測定于采血當日完成。

1.3.2 儀器與試劑PIVKA?Ⅱ檢測采用采用LU?MIPULSETM G1200 全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)及其配套的異常凝血酶原（PIVKA?Ⅱ）檢測試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）、標準品及質(zhì)控品（日本富士瑞必歐株式會社）。AFP 檢測儀器采用Cobas E602 電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑、標準品和質(zhì)控品（Roche）。檢測系統(tǒng)所有性能參數(shù)均通過實驗室性能驗證，所有操作嚴格按照廠家提供的操作說明書進行，以40 mAU/mL 和20 ng/mL 作為PIVKA?Ⅱ和AFP 的參考范圍上限，超過上限值判斷為陽性（+），反之為陰性（-）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 25和Gra?phPad Prism 8。計量資料采用Kolmogorov?Smirnov（K?S）檢驗進行正態(tài)性檢驗后，計量資料采用均值±標準差或M（P25，P75）表示。多組間比較采用Kruskal?Walls 檢驗，組間兩兩比較采用Mann?Whit?neyU檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。ROC曲線分析采用Medcalc 軟件。決策曲線分析與臨床影響曲線的繪制采用R 語言3.5.1 軟件Deci?sion Curve包。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清PIVKA?Ⅱ和AFP水平比較6組研究對象血清PIVKA?Ⅱ和AFP 水平比較，6 組間PIVKA?Ⅱ和AFP 水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。經(jīng)兩兩比較，肝細胞癌組患者PIVKA?Ⅱ水平和AFP 水平均高于其他各組（P< 0.001），肝炎組患者PIVKA?Ⅱ水平和AFP 水平均高于對照組（P< 0.001），肝炎組AFP 水平高于肝繼發(fā)腫瘤組（P< 0.05），肝硬化組患者AFP 水平高于對照組（P< 0.001），其余各組水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 各組血清PIVKA?Ⅱ和AFP 水平比較Tab.2 Comparison of serum PIVKA?Ⅱand AFP levelsM（P25，P75）

2.2 各組血清PIVKA?Ⅱ和AFP 水平上升情況比較6組研究對象血清PIVKA?Ⅱ和AFP水平上升情況比較，肝細胞癌組、肝炎組及肝硬化組PIVKA?Ⅱ和AFP 增高不一致所占比例分別為35.44%、33.08%、35.43%，而在肝膽管癌組、肝繼發(fā)瘤組及正常對照組兩個指標上升不一致所占比例分別為15.40%、5.88%及10.71%。見表3。

表3 各組血清PIVKA?Ⅱ和AFP 水平上升情況比較Tab.3 Positive rates of serum PIVKA?Ⅱand AFP例（%）

2.3 ROC 曲線分析分別以所有非肝癌者（肝炎組、肝硬化組、肝膽管癌組、肝繼發(fā)腫瘤組、正常對照組）為對照組、肝細胞癌組為病例組以及以健康人群為對照組繪制ROC 曲線，比較血清PIVKA?Ⅱ和AFP 單項及聯(lián)合檢測診斷原發(fā)性HCC 的AUC，結(jié)果顯示，PIVKA?Ⅱ的AUC 優(yōu)于AFP，與兩者聯(lián)合檢測基本一致，見圖1-2。各種方法對HCC 的診斷性能比較見表4。

表4 PIVKA?Ⅱ及AFP 單項檢測及聯(lián)合檢測診斷性能比較Tab.4 Comparison of diagnostic performance of single and joint detection of PIVKA?Ⅱand AFP

圖1 以非肝癌者為對照組Fig.1 Patients without HCC as the control group

圖2 以健康人群為對照組Fig.2 Healthy controls as control group

2.4 決策曲線分析利用決策曲線分析進行不同模型的比較，見圖3。結(jié)合年齡及性別因素，PIVKA?Ⅱ與AFP 聯(lián)合檢測對原發(fā)性HCC 的診斷價值優(yōu)于AFP，除了風(fēng)險閾值為0.24 ~ 0.25 時［聯(lián)合檢測成本效益比vs.單獨PIVKA?Ⅱ檢測成本效益比為（0.501~0.478）vs.（0.642~0.524）］，聯(lián)合檢測對HCC 的診斷價值均優(yōu)于PIVKA?Ⅱ單獨檢測。

圖3 決策曲線分析PIVKA?Ⅱ和AFP 單獨或聯(lián)合檢測對HCC 的診斷性能Fig.3 Diagnostic performance of PIVKA?Ⅱand AFP in HCC by decision curve analysis

2.5 臨床影響曲線分析進一步對兩個指標聯(lián)合檢測的方案做臨床影響曲線分析，在各個閾值概率下，被聯(lián)合檢測方案劃分為高風(fēng)險的人數(shù)與真陽性人數(shù)，提示在閾值概率為0.2 時，兩者基本達到一致（圖4）。

圖4 臨床影響曲線驗證PIVKA?Ⅱ和AFP 聯(lián)合檢測方案對HCC 的診斷價值Fig.4 Diagnostic value of PIVKA?Ⅱand AFP joint detection for HCC verified by clinical impact curve

3 討論

HCC 生物標志物及治療靶點是目前研究熱點之一［9］。AFP 是臨床最常用的HCC 生物標志物，可作為篩選HCC 及判斷預(yù)后的指標［10］，但靈敏度較差，尤其在腫瘤< 3 cm 時常常檢測不出［11-12］，在診斷早期HCC 存在一定的漏診率。PIVKA?Ⅱ是一種異常的凝血酶原，在HCC 患者血清中顯著升高，其診斷靈敏度和特異性均較高［13-14］。本研究共納入982 例受試者，根據(jù)其疾病類型分成肝細胞癌組、肝炎組、肝硬化組、肝膽管癌組、肝部繼發(fā)腫瘤組及正常對照組，結(jié)果顯示，肝細胞癌組無論PIVKA?Ⅱ水平還是AFP 水平均顯著升高，提示這兩個指標與原發(fā)性HCC 密切相關(guān)，與報道基本一致［15-16］。對于PIVKA?Ⅱ，除了HCC 組顯著升高以外，其他組未見顯著升高，尤其在肝膽管癌和肝部繼發(fā)腫瘤患者中，提示PIVKA?Ⅱ?qū)τ谠l(fā)性HCC與其他類型的肝臟腫瘤具有很好的鑒別診斷價值。對于AFP，除肝細胞癌組外，其他組別患者升高不明顯，雖然肝炎組和肝硬化組AFP 水平與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但絕大部分患者均處于正常參考區(qū)間內(nèi)，表明AFP 診斷原發(fā)性HCC的特異性良好。

PIVKA?Ⅱ和AFP 產(chǎn)生機制不同，因此本研究對PIVKA?Ⅱ增高但AFP 無顯著增高、以及AFP 增高但PIVKA?Ⅱ無顯著增高的人群進行分析，發(fā)現(xiàn)在肝細胞癌組中，PIVKA?Ⅱ增高但AFP 無顯著增高的所占比例高達29.12%。文獻指出，在臨床中，以> 20 ng/mL 作為截斷值時，AFP 的靈敏度只能達到約50%［11］，本研究結(jié)果亦顯示在肝細胞癌組、肝炎組及肝硬化組PIVKA?Ⅱ和AFP 增高不一致所占比例均超過30%，提示兩個指標不存在相關(guān)性，兩者聯(lián)合檢測可大大提高早期肝癌的診斷率。

ROC 曲線是用于預(yù)測模型評價的重要方法之一，主要通過AUC 同時計算靈敏度和特異性評判不同預(yù)測模型的優(yōu)劣［17］。本研究結(jié)果顯示，在采用非原發(fā)性HCC 患者作為對照組時，PIVKA?Ⅱ的AUC 與聯(lián)合檢測基本一致，均顯著優(yōu)于AFP，當采用正常健康人群作為對照組時，聯(lián)合檢測的AUC為最優(yōu)，其次為PIVKA?Ⅱ，AFP 最差，但聯(lián)合檢測的AUC與PIVKA?Ⅱ差異不大。PIVKA?Ⅱ在不同的研究中所報道的靈敏度差異較大，是否能單獨作為原發(fā)性HCC 的診斷指標仍存在較大爭議［18-19］。而本研究結(jié)果則表明PIVKA?Ⅱ無論作為體檢人群的肝癌篩查指標，還是作為肝臟疾病患者HCC 的鑒別診斷指標，都具有良好的靈敏度和特異性，可以單獨作為原發(fā)性HCC 的診斷指標。

然而在某些嚴重疾病中，假陰性導(dǎo)致的漏診可能危及生命，比假陽性更應(yīng)該避免。DCA 通過引入閾值概率進行變量替換的方法，評價診斷方法或預(yù)測模型的凈受益，無需獲得醫(yī)療措施的具體獲益及患者的主觀偏好，對所有可能的行為及結(jié)果進行分析，指導(dǎo)臨床工作者選取最有利于患者的行為決策，尋找凈受益最大的方法［20-21］。由于目前原發(fā)性HCC 患者早期診斷仍存在較大困難，雖然多種標志物聯(lián)合檢測雖有利于提高靈敏度，但無疑也增加了患者的經(jīng)濟負擔，同時提高了假陽性。目前文獻報道的關(guān)于HCC 血清標志物聯(lián)合檢測方案的研究，大多采用ROC 分析方法，僅考慮檢測方案的準確性，并未關(guān)注預(yù)測信息應(yīng)用于臨床時可能導(dǎo)致的后果，例如診斷出現(xiàn)假陽性時患者可能需要進行肝臟穿刺進行病理學(xué)檢查，增加了患者不必要的痛苦和經(jīng)濟負擔，或出現(xiàn)假陰性導(dǎo)致原發(fā)性HCC 的漏診從而延誤患者的治療。本研究利用DCA 方法，分別對三種預(yù)測模型進行分析比較，結(jié)果顯示，結(jié)合年齡和性別因素時，在任何風(fēng)險閾值下，聯(lián)合檢測對原發(fā)性HCC均優(yōu)于AFP，除了風(fēng)險閾值為0.24 ~ 0.25 時，聯(lián)合檢測對原發(fā)性HCC 的診斷價值也優(yōu)于PIVKA?Ⅱ單獨檢測。這與ROC 分析結(jié)果不完全一致，認為在進行HCC 早期篩查及診斷時，應(yīng)綜合考慮患者的性別、年齡、PIVKA?Ⅱ及AFP 水平進行分析，而非從單一指標的水平進行診斷或排除，與文獻報道一致［22-23］。

綜上，原發(fā)性HCC 患者血清PIVKA?Ⅱ與AFP水平均顯著升高，兩者均為診斷原發(fā)性HCC 的良好生物標志物，在進行原發(fā)性HCC 早期篩查和早期診斷時，應(yīng)結(jié)合患者性別、年齡、PIVKA?Ⅱ及AFP 水平等因素進行綜合分析，為下一步的治療提供重要的參考依據(jù)。然而，本研究存在一定的不足，病例收集采用連續(xù)納入方法，由于HCC男女發(fā)病比例的差異，導(dǎo)致性別組成比懸殊，此外由于肝內(nèi)膽管癌及肝內(nèi)繼發(fā)性腫瘤發(fā)病率較低，在研究期間收集到的病例數(shù)較少等，以后的研究中應(yīng)加大樣本量或開展多中心研究進行驗證。