崔穎鵬 馮冰 彭雅琴 黃漢 伍眾文 廖康

中山大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學檢驗科（廣州510080）

鮑曼不動桿菌是一種非發(fā)酵、革蘭氏陰性的條件致病菌，可引起組織及傷口感染、血流感染、呼吸道感染、腦膜炎等［1］。隨著抗生素的普遍使用，導致多重耐藥及泛耐藥鮑曼不動桿菌的出現(xiàn)，而碳青霉烯類抗生素作為治療鮑曼不動桿菌的特效藥物，近年發(fā)現(xiàn)其耐藥性增加明顯［2］。鮑曼不動桿菌的耐藥機制主要是碳青霉烯酶的產生等［3］，該酶能夠顯著水解亞胺培南或美洛培南的β?內酰胺酶，Ambler（即Frere β 酶）分為A、B、C、D 4 類，目前在鮑曼不動桿菌中發(fā)現(xiàn)A、B、D 類，具體為Ambler A 類碳青霉烯酶（KPC 等）、B 類β?內酰胺酶（IMP 等）、D 類OXA 酶（OXA?23 等）。本研究主要對碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌進行表型分析，利用聚合酶鏈式反應（即PCR 技術）檢測碳青霉烯類藥物耐藥鮑曼不動桿菌的耐藥基因，了解耐藥基因的分布及其與耐藥菌株的相關性，為有效防控該類菌群耐藥基因型流行提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源收集2019年12月至2020年10月中山大學附屬第一醫(yī)院住院患者分離鑒定的對亞胺培南及美羅培南耐藥的鮑曼不動桿菌96 株，剔除同一患者重復菌株。

1.1.2 主要儀器與試劑PCR擴增儀（Veriti，ABI）；Fusion 凝膠成像儀（Vilber Louramt FusionFX）；HF?safe?TE 1500 生物安全柜（上海力新儀器有限公司）；VITEK?2 細菌鑒定儀（梅里埃生物有限公司）；GN 鑒定卡及GN335 藥敏卡（法國生物梅里埃公司）；金屬浴?V02（Vilet Biosciences）；高速離心機（himac）；移液槍（Eppendorf）；槍頭和EP 管（Axy?gen）；微波爐（Galanz）；天平（METT，AB204?S）；干式恒溫儀（奧勝，MK?2000?2S）；DYY?6C 電泳儀（北京市六一儀器廠）；PCR Mix（DSBIO）；瓊脂糖（BIOWEST）；Good View（北京賽百盛基因技術有限公司）；血平板、MH平板（法國生物梅里埃公司）。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)將耐藥鮑曼不動桿菌菌株劃線于血平板上復蘇，37 ℃下培養(yǎng)24 h。24 h 后刮取菌苔3~4 環(huán)到菌株保存管，-20 ℃下保存，復蘇菌株用血平板進行二次培養(yǎng)用于核酸提取。

1.2.2 細菌基因DNA 提取煮沸提取法：將菌株傳菌后，用一次性接種環(huán)挑取2 ~ 3 環(huán)到裝有300 μL 雙蒸水的EP 管中，置金屬浴于100 ℃下加熱15 min，15 min 后放置碎冰塊中5 min，最后12 000 r/min 離心3 min，取上清液即DNA 模板。

1.2.3 碳青霉烯酶表型檢測使用改良Hodge 試驗，將大腸埃希菌的質控菌株（ATCC 25922）用生理鹽水調為0.5 麥氏的菌液涂抹整個MH 平板，將美羅培南藥敏紙片貼在MH 平板中間，再使用一次性接種環(huán)挑取1 ~ 2 環(huán)待測菌株在紙片邊緣沿著平板邊緣劃線。孵箱37 ℃孵育24 h 后觀察結果。

1.2.4 酶抑制試驗在MH 平板上均勻涂布0.5 麥氏單位的被測菌株，貼上四張美羅培南紙片，一張紙片空白，另外三張紙片分別單獨加入10 μL 硼酸、10 μL EDTA、10 μL 硼酸+EDTA 復合物，37 ℃孵育24 h 后觀察結果。

1.2.5 鑒定及藥敏試驗本次實驗藥敏由VITEK?2細菌鑒定儀進行鑒定藥敏試驗。藥敏判斷標準參照CLSI M100?S30 藥敏試驗指南。

1.2.6 PCR 擴增耐藥基因PCR 技術擴增耐藥基因反應條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，最后72 ℃延伸10 min，共35 個循環(huán)。反應體系為：DNA 模板3 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、DS Mix 16 μL、超凈水4 μL，共25 μL。引物序列由上海生工生物有限公司合成，具體引物和擴增反應體系及條件見參考文獻［4-6］?；虻囊镄蛄屑伴L度見表1。

表1 基因的引物序列及長度Tab.1 Primer sequence and length of gene

1.2.7 凝膠電泳成像制備1.2%瓊脂糖凝膠板，取0.5×TBE 80 mL 及瓊脂糖粉0.96 g 倒入100 mL錐形瓶中，置微波爐中加熱至煮沸，再加5 μL 的Good view，搖勻后倒入已插好梳子的膠板，冷卻后使用。在電壓120 V 條件下跑膠45 min，電泳結果經Fusion 成像儀觀察。

2 結果

2.1 標本類型及科室分布下呼吸道標本59 株，靜脈血18 株，引流液8 株，尿液4 株，分泌液4 株，組織3 株；其中ICU 標本菌株75 株（78%），康復醫(yī)學科5 株、神經科5 株，燒傷外科4 株，器官移植3株，其余分布在脊柱外科、消化內科、腎內科和全科醫(yī)學科各1 株。

2.2 表型檢測結果在收集的96 株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌菌株中，碳青霉烯酶陽性69 株（71.9%），陰性菌株27 株（28.1%）。見圖1。

圖1 碳青霉烯酶表型檢測Fig.1 Carbapenemase phenotype detection

2.3 酶抑制試驗結果對檢出的3 株KPC 耐藥基因進行酶抑制試驗，結果顯示3 株菌株皆表現(xiàn)為不可被硼酸抑制，在EDTA 及硼酸+EDTA 均發(fā)現(xiàn)抑菌圈，在復合試劑的抑菌圈稍微大于EDTA，但其與空白對照的抑菌圈都< 5 μm。酶抑制試驗與表型不符，可能是因為存在復合耐藥機制的原因，也可能是酶抑制試驗只適用于腸桿菌屬而不適用于鮑曼不動桿菌的酶型鑒定，另外將KPC 基因產物經上海生工測序，證實為KPC 型酶。KPC 基因PCR 產物的雙相測序結果與GENEBANK 中的KPC序列相一致。見圖2。

圖2 酶抑制試驗Fig.2 Enzyme inhibition test

2.4 96 株鮑曼不動桿菌藥物敏感性本次藥敏試驗對頭孢類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、磺胺類及β?內酰胺酶抑制劑等藥物進行藥敏試驗，結果顯示在所研究的菌株中，其對各類抗菌藥物的耐藥水平在一個相對高的水平。聯(lián)合用藥對治療CRAB作用不大，替加環(huán)素和多粘菌素作為碳青霉烯類耐藥后的后備選擇藥物，也出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象。本次研究的菌株中對多粘菌素的耐藥率為1.1%，而替加環(huán)素的耐藥率為4.2%，存在25%碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的敏感性降低。藥敏結果見表2。

表2 CRAB 藥物敏感性情況Tab.2 Drug sensitivity of carbapenem?resistant Acinetobacter baumannii

2.5 基因檢測結果在篩選出的96株CRAB菌株中，檢出KPC 3 株（3%），OXA?23 95 株（99%），OXA?51 93株（96.9%）。其余基因GES、SIM、NDM、OXA?24、OXA?58 等均未檢出。見圖3-5。

注：M，DL2000 marker

圖4 OXA?23 檢測結果Fig.4 OXA?23 test results

圖5 OXA?51 檢測結果Fig.5 OXA?51 test results

3 討論

《2019年全國細菌耐藥監(jiān)測報告》顯示，鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物耐藥率全國平均為56%，對亞胺培南和美羅培南耐藥率分別為55.5%和57.1%［7］。本研究中CRAB 臨床分離出的菌株主要分布在ICU 病房，占78%。且以呼吸道標本為主。96 株菌株中有18 株來自靜脈血，提示CRAB引起的血行感染占據(jù)一定比例，鮑曼不動桿菌可以在醫(yī)院環(huán)境長期存活，并且極易在危重患者中引起繼發(fā)感染，且大多數(shù)被感染的患者都是患有危重疾病或身體抵抗力弱等基礎疾病的患者，以及使用多種侵入性操作和長期接受廣譜抗生素治療的患者［8］。

96 株CRAB 藥敏實驗中，除對亞胺培南及美羅培南耐藥，還對環(huán)丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/克拉維酸均耐藥，復方新諾明、頭孢吡肟、妥布霉素、頭孢哌酮/舒巴坦、左旋氧氟沙星、多西環(huán)素、頭孢他啶的耐藥率均在80%以上，屬于極高的耐藥率。就環(huán)丙沙星而言，在浙江某家醫(yī)院報道其耐藥率為32%［9］，與本院的耐藥水平相差略大，與山東、湖北和泰國相關醫(yī)院文獻中報道的耐藥水平一致［10-11］，都表現(xiàn)為較高的耐藥水平。鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素及多粘菌素耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)也要引起注意，目前替加環(huán)素聯(lián)合其他藥物并未明顯降低患者28 d 病死率改善預后［12］，對于CRAB 的治療需更多的臨床資料，警惕菌株對替加環(huán)素及多粘菌素藥物耐藥廣泛流行，適度合理使用抗菌藥物。各個地區(qū)耐藥水平的差異與該院的醫(yī)療器械水平、經濟狀況、抗生素使用情況等諸多方面有關，比如CRAB 在ICU 病房的檢出率最高，抗生素的濫用、患者基礎疾病影響、器械通氣等［13］因素都會導致抗生素耐藥現(xiàn)象出現(xiàn)。環(huán)境因素也是鮑曼不動桿菌傳播的原因之一，這也要求臨床在操作中落實無菌操作，避免交叉感染。

本研究對A 類碳青霉烯酶（KPC、GES）、B 類β?內酰胺酶（IMP、VIM?1、VIM?2、SIM、NDM）、D 類OXA 酶（OXA?23、OXA?24、OXA?51、OXA?58、OXA?143）進行耐藥基因的檢測，發(fā)現(xiàn)OXA?51陽性93株，OXA?23陽性95株，3株KPC耐藥基因。說明本院鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥與產OXA?51 型酶和OXA?23 型酶有關，與國內外流行情況一致，都表現(xiàn)為高OXA?23、OXA?51 的檢出率。OXA?51 為鮑曼不動桿菌本身攜帶的基因，本研究中其在CRAB的檢出率96.9%，未達到100%檢出率，將OXA?51陰性的菌株經質譜技術鑒定為鮑曼不動桿菌，排除其菌株為皮特鮑曼不動桿菌的可能性，所以這3 株CRAB 可能受插入序列ISAbal 的影響，ISAbal 低表達或弱表達都會影響耐藥基因的出現(xiàn)，OXA?51 與gyrB 多重PCR 鑒定方法相比特異性低［14］。本院CRAB 最主要流行的耐藥基因為OXA?23，其檢出率達99%，中國地區(qū)的CRAB 80%產OXA?23 型酶［15］，在未來發(fā)展中OXA?23 型耐藥基因會不會成為CRAB 的耐藥基因流行傳播需持續(xù)監(jiān)控。宋志偉等［9］對CRAB 進行耐藥機制研究時還檢出VIM 耐藥基因，以及高東田等［10］在研究鮑曼不動桿菌時檢出OXA?58 型酶。耐藥基因bla NDM 在埃及和阿爾及利亞地區(qū)被報道［16］。不同地區(qū)所報道的耐藥基因類型有所異同，與地域差異性有關。葡萄牙某家醫(yī)院［17］在同一患者身上分離出的CRAB 和肺炎克雷伯桿菌同時檢出了blaKPC?3耐藥基因，而且其研究表明這兩種菌株有著相同的IncFrepB 復制源，證明了兩種分離株間可以通過質粒水平進行種間傳播。CANEIRAS 等［17］研究分析的多重耐藥鮑曼不動桿菌菌株中檢出耐藥基因KPC 亞型。從上述研究來看，國內外不同區(qū)域耐藥基因的流行情況因地域的不同而存在差異，各個地區(qū)除了防止本地流行菌株的暴發(fā)外，預防外來耐藥基因的侵入也是需重點關注的方面。

另外耐藥KPC 菌株在本研究中，除對粘菌素敏感外，對于其他藥物如環(huán)丙沙星、多西環(huán)素、頭孢吡肟、米諾環(huán)素、頭孢哌酮/舒巴坦、復方新諾明、替加環(huán)素等抗生素均表現(xiàn)為耐藥或中介，這導致臨床在藥物治療的選擇方面存在很大的局限性［18］。周洋等［19］研究發(fā)現(xiàn)替加環(huán)素聯(lián)合頭孢哌酮/舒巴坦治療多重耐藥鮑曼不動桿菌肺炎的療效顯著，聯(lián)合用藥顯得更加重要。與此同時，3 株KPC 陽性菌株還存在OXA?23 和OXA?51，為多重耐藥基因菌株。

綜上所述，本研究臨床分離出的CRAB 主要攜帶OXA?51、OXA?23 耐藥基因，應該對本地區(qū)碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌進行基因分析，確定是否存在KPC 耐藥基因的流行情況，及時采取措施，防止其在醫(yī)院內廣泛傳播。鮑曼不動桿菌對抗生素耐藥的因素有很多，比如外膜蛋白的改變、主動外排泵過表達及藥物作用靶點的變化［20］，都可影響抗生素在體內的殺菌活性，從而引起細菌耐藥。本研究對CRAB 的耐藥基因進行研究，了解本院耐藥基因的分布，能更好為臨床治療提供依據(jù)。本研究不足之處在于標本量少，未全面收集廣州各個醫(yī)院的菌株進行研究，僅局限于本院一兩年內臨床分離的菌株。同時下一步還需進行菌株的同源性分析，掌握流行克隆的傳播情況不容小視。