梁嘉穎 曾偉宏 張杰 賴有行 黃志承 鄭毅春

廣東省婦幼保健院1生殖健康與不孕癥科，2兒童遺傳代謝與內(nèi)分泌科，3檢驗(yàn)科（廣州510010）

精子異常是男性不育癥的最主要病因，嚴(yán)重少、弱精子癥病因及發(fā)病機(jī)制尚未明確，是男性不育研究的熱點(diǎn)。精子數(shù)目異常不是一個(gè)單獨(dú)的疾病，而是多種疾病的一種臨床表現(xiàn)或結(jié)果。致病因素可能包括藥物、內(nèi)分泌、免疫、感染、創(chuàng)傷等，由于重度少、弱精子癥的病因復(fù)雜，調(diào)控精子發(fā)生和運(yùn)動(dòng)能力的機(jī)制仍不明確，因此對此類疾病的治療尚處于經(jīng)驗(yàn)性治療階段［1］，嚴(yán)重的少、弱精子癥需通過卵泡漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）治療獲得后代。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)疾病特異性的靶點(diǎn)和標(biāo)記物，可以提供廣泛的診斷及預(yù)后信息。近年來，相對和絕對定量的等量異位標(biāo)簽（iTRAQ）多重標(biāo)記?串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅速。本研究在前期運(yùn)用iTRAQ 技術(shù)篩選發(fā)現(xiàn)HNRNPU 蛋白為嚴(yán)重少、弱精子癥組及正常生育組的精子表達(dá)差異蛋白質(zhì)，并且對HNRNPU 蛋白進(jìn)行初步驗(yàn)證。

在細(xì)胞核中，剪接體通用蛋白組件編碼基因HNRNPU 主要參與轉(zhuǎn)錄和剪接過程。剪接體是真核生物mRNA 前體去內(nèi)含子轉(zhuǎn)變成熟工具，由5 個(gè)亞基（U1、U2、U4、U5 和U6）和150 多種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白復(fù)合物（snRNP）［2］。HNRNPU在維持染色質(zhì)正常結(jié)構(gòu)中起著核心作用，被認(rèn)為是凋亡蛋白酶的關(guān)鍵靶點(diǎn)［3］。HNRNPU 缺陷會(huì)影響睪丸精原細(xì)胞分化，抑制精子發(fā)育和成熟［4］，但其相關(guān)的病理調(diào)控機(jī)制和對輔助生殖治療的預(yù)測能力尚不清楚。因此，本研究的目的是探討HNRNPU 與常規(guī)精子質(zhì)量參數(shù)的相關(guān)性，及其對ICSI 臨床妊娠結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象連續(xù)收集于2019年1-12月在廣東省婦幼保健院行ICSI 治療的嚴(yán)重少、弱精子癥患者和正常孕產(chǎn)婦丈夫的精液標(biāo)本各500例。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《WHO 人類精液檢驗(yàn)與處理實(shí)驗(yàn)室手冊》（WHO 第5 版）［5］，精子濃度≥15×106/mL，前向運(yùn)動(dòng)（PR）精子百分率≥32%，正常形態(tài)精子百分率≥4%為正常精子；按照本院生殖中心臨床操作規(guī)程，ICSI（嚴(yán)重少、弱精子癥）組納入標(biāo)準(zhǔn)：PR精子總數(shù)≤5×106/mL。排除標(biāo)準(zhǔn)：染色體核型異常及Y 染色體微缺失等遺傳性疾病，全身系統(tǒng)性疾病及先天性疾病，傳染性疾病及生殖道感染，睪丸外傷、隱睪等手術(shù)史，長期藥物或毒性物質(zhì)接觸史等。所有受試者均簽署知情同意書，研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2 試劑珠海貝索生物技術(shù)有限公司精子（細(xì)胞）形態(tài)學(xué)快速染色液（Diff?Quik 法）；Sigma 公司鈣離子載體A23187，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的豌豆凝集素（FITC?PSA）；深圳博銳德生物科技有限公司精子DNA 碎片檢測試劑盒（SCD 法）和苯胺藍(lán)染色液試劑盒（核蛋白）；Vitro Life 公司SpermGrad?梯度液、SpermRinse?洗精液；北京百泰克生物技術(shù)有限公司TRIpure 總RNA 抽提試劑，Agilent 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒及相關(guān)軟件等。

1.3 主要儀器西班牙Microptic 公司SCA 計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）；美國Applied Biosys?tems 公司ABI7500 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)；日本Olympus 公司BX53 普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡。

1.4 方法

1.4.1 精液采集受檢者禁欲2 ~ 7 d，手淫采集精液，隨即放置37 ℃恒溫水浴箱，1 h 內(nèi)檢測。

1.4.2 精液常規(guī)按照WHO 第5 版進(jìn)行精液常規(guī)參數(shù)檢測，采用CASA 系統(tǒng)分析精子濃度和PR%，自動(dòng)計(jì)算PR 精子總數(shù)。

1.4.3 精子形態(tài)按照WHO 第5 版，采用Diff?quik染色法，普通光學(xué)顯微鏡10×100 倍計(jì)數(shù)200 條精子，計(jì)算正常精子形態(tài)百分率。

1.4.4 鈣離子載體激發(fā)頂體反應(yīng)（ARIC）3~4 mL生理鹽水加入1 mL 待測精液，混勻，400 g 離心5 min，棄上清，將沉淀物加到1 mL SpermRinse 底部，上游1 h。取上游后精子加入另一管SpermRinse液中，活動(dòng)精子調(diào)至1×106/mL，孵育3 h 誘導(dǎo)精子獲能。獲能后精子分為測定和對照管。測定管中加入足量鈣離子載體A23187，終濃度為10 μmol/L；對照管中加入等體積DMSO，37 ℃孵育15 min，3%戊二醛終止反應(yīng)。400 g 離心5 min，棄上清。取沉淀20 ~ 30 μL 移至載玻片上，觀察精子密度與活動(dòng)率等情況后，吸取多余液體，空氣干燥。將載玻片浸泡于95%乙醇30 min，空氣干燥。迅速加入0.1 mg/mL FITC?PSA 40 μL，水平放置4 ℃濕盒內(nèi)10~12 h。蒸餾水浸泡3 次，每次2 min。熒光顯微鏡下觀察200 條熒光標(biāo)記染色精子，計(jì)算ARIC%。

1.4.5 精子DNA 碎片化指數(shù)（DFI）嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。普通光學(xué)顯微鏡10 × 40 倍計(jì)數(shù)500 條精子，計(jì)算大暈環(huán)、中暈環(huán)（無碎片）和小暈環(huán)、無暈環(huán)（有碎片）精子的百分率。

1.4.6 精子核成熟度嚴(yán)格按照苯胺藍(lán)染色液說明書操作。普通光學(xué)顯微鏡10 × 100 倍計(jì)數(shù)200條精子，計(jì)算精子核蛋白成份中魚精蛋白（成熟精子）與組蛋白（不成熟精子）的百分率。

1.4.7 實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)嚴(yán)格按照TRIzol 試劑說明書提取精子總RNA［6］，使用低起始量快速擴(kuò)增基因表達(dá)標(biāo)記試劑盒將純化后的RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此cDNA 為模板在ABI7500實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以GAPDH 作為內(nèi)參照，HNRNPU 的引物序列：

F：5?TGCCCAACAGAGGGAACTATAACC?3

R：5?CCTTGGTGATAATGCTGACTCCA?3

1.4.8 ICSI 治療嚴(yán)格按照診療規(guī)程對嚴(yán)重少、弱精子癥患者夫婦進(jìn)行ICSI 治療，胚胎移植后第13~15 天若月經(jīng)未來潮，抽血驗(yàn)β?hCG、E2、P4，術(shù)后5 周做B 超確認(rèn)臨床妊娠。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Spearman 秩相關(guān)分析；P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料正常生育組和ICSI 組患者年齡、精液量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），兩組精子濃度和PR 精子總數(shù)（#）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1。

表1 兩組受試者分組資料比較Tab.1 The baseline semen samples characteristics of two groups ±s

表1 兩組受試者分組資料比較Tab.1 The baseline semen samples characteristics of two groups ±s

正常生育組ICSI 組t 值P 值例數(shù)500 500年齡（歲）32.0±4.1 31.4±3.9 1.004 0.206精液量（mL）2.51±1.01 2.59±0.85 1.478 0.200精子濃度（×106/mL）49.11±22.34 15.82±9.38 7.328 0.001 PR#46.21±7.17 4.50±1.08 9.635<0.001

2.2 正常生育組和ICSI組的精液質(zhì)量參數(shù)比較兩組正常形態(tài)精子百分率、ARIC%、DFI、精子核成熟度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01），見表2。

表2 兩組受試者精液質(zhì)量參數(shù)比較Tab.2 The semen quality characteristics of two groups ±s

表2 兩組受試者精液質(zhì)量參數(shù)比較Tab.2 The semen quality characteristics of two groups ±s

精子參數(shù)正常生育組ICSI 組t 值P 值例數(shù)500 500正常形態(tài)精子百分率（%）5.01±1.49 2.70±1.81 6.371 0.001 ARIC（%）6.86±1.43 2.42±1.31 6.498 0.001 DFI（%）16.58±3.37 27.30±2.69 5.358 0.002核成熟度（%）70.63±10.18 50.98±10.79 6.384 0.001

2.3 正常生育組和ICSI組的精子HNRNPU mRNA表達(dá)水平比較實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線顯示，熔解曲線均為單峰，無引物二聚體或其他雜峰出現(xiàn)，表明擴(kuò)增特異性良好。HNRNPU mRNA 在正常生育組和ICSI組的相對表達(dá)量分別為（0.14±0.03）、（0.38±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

圖1 正常生育組和ICSI 組的精子HNRNPU mRNA 表達(dá)水平Fig.1 Relative expressions of HNRNPU mRNA in the sperm of two groups

2.4 精子HNRNPU mRNA 表達(dá)水平與其他精液質(zhì)量參數(shù)的相關(guān)性精子HNRNPU 基因mRNA 的相對表達(dá)量與PR 精子總數(shù)、正常形態(tài)精子百分率、誘發(fā)頂體反應(yīng)率和精子核成熟度等均存在負(fù)相關(guān)（P< 0.01）；與精子碎片化指數(shù)存在正相關(guān)（P<0.01），見表3。

表3 精子HNRNPU mRNA 表達(dá)水平與其他精液質(zhì)量參數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果Tab.3 Correlation of different semen parameters with HNRNPU mRNA

2.5 精子HNRNPU mRNA 表達(dá)水平與ICSI 治療結(jié)局的相關(guān)性選擇研究時(shí)間內(nèi)，女方采用長效長方案促排卵，并行新鮮胚胎移植的104 個(gè)ICSI治療周期，男方精子HNRNPU 基因mRNA 的相對表達(dá)量與PR 精子總數(shù)、正常受精（2PN）率存在負(fù)相關(guān)（P<0.05），與男方年齡、精液量、精子濃度、卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率無顯著相關(guān)（P>0.05），見表4。按患者妊娠結(jié)局分為臨床妊娠組（n= 55）和非妊娠組（n= 49）。HNRNPU mRNA 在臨床妊娠組和非妊娠組精子表達(dá)量分別為（0.36 ± 0.03）、（0.39±0.06），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表5。

表4 精子HNRNPU mRNA 表達(dá)水平與ICSI 治療結(jié)局的相關(guān)性分析結(jié)果Tab.4 Correlation of ICSI outcome with HNRNPU mRNA

表5 ICSI 臨床妊娠組與非妊娠組患者基本情況和各項(xiàng)精液參數(shù)比較Tab.5 The patients characteristics and semen parameters of two pregnancy outcome groups ±s

表5 ICSI 臨床妊娠組與非妊娠組患者基本情況和各項(xiàng)精液參數(shù)比較Tab.5 The patients characteristics and semen parameters of two pregnancy outcome groups ±s

妊娠組非妊娠組t值P值例數(shù)55 49女方年齡（歲）29.0±1.6 30.3±3.2 0.564 0.773男方年齡（歲）33.5±3.8 32.8±2.7 0.782 0.609不孕年限（年）3.0±0.1 3.1±0.2 0.021 1.247女方BMI（kg/m2）20.91±2.22 20.94±1.30 0.186 0.853獲卵數(shù)（#）13.31±1.60 12.57±1.33 1.083 0.471 HNRNPU mRNA 0.36±0.03 0.39 ±0.06 0.671 0.715正常形態(tài)精子百分率（%）3.01±1.49 2.70±1.81 0.371 0.890 ARIC（%）2.86±1.43 2.42±1.31 1.498 0.225 DFI（%）27.30±9.69 27.58±4.37 1.358 0.337核成熟度（%）50.31±12.28 50.94±10.32 0.062 0.940

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)不孕不育癥患病率約為8%~12%，其中男性因素為主要病因的約50%［7］。男性不育癥的病因復(fù)雜，主要與影響精子生成的因素有關(guān)，如遺傳因素、精索靜脈曲張和脊髓損傷等；許多不良生活方式也會(huì)損害男性生育力，如吸煙、酗酒和肥胖等。近年對不育男性精子的蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示，無精子癥和少弱精子癥患者的精子中，精囊蛋白Ⅱ前體（semenogelin Ⅱprecursor）和硫酸糖蛋白1（clusterin isoform 1）表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致精子數(shù)量減少、活力受損［8-9］；原發(fā)和繼發(fā)性不育癥患者精子中，低表達(dá)的蛋白質(zhì)均與翻譯后修飾和折疊有關(guān)，如BAG6［10］，表明蛋白質(zhì)組學(xué)分析在不育癥男性精子功能評(píng)估的重要性。

本研究組前期對不同生精功能的無精子癥患者睪丸組織和嚴(yán)重少、弱精子癥患者精液精子進(jìn)行蛋白鑒定和功能分析，經(jīng)KEGG 數(shù)據(jù)庫注釋歸類后，與轉(zhuǎn)錄后修飾相關(guān)的剪接體代謝通路富集，發(fā)現(xiàn)剪接體通用蛋白組件編碼基因HNRNPU 在正常對照組與病例組的睪丸組織或精液精子之間的表達(dá)均存在顯著差異，其在生精功能低下的睪丸組織表達(dá)顯著下調(diào)，在嚴(yán)重少、弱精子癥患者精液精子表達(dá)顯著上調(diào)，提示剪接體可能參與精原細(xì)胞的形成［11］。剪接體是一類調(diào)控RNA 之間相互結(jié)合并介導(dǎo)前體mRNA 轉(zhuǎn)化為mRNA 的大分子復(fù)合體［12-13］。本研究目的為探討需行ICSI 的嚴(yán)重少、弱精子癥患者精液精子中HNRNPU 的表達(dá)與精子質(zhì)量參數(shù)的相關(guān)性，并探討其對ICSI 臨床結(jié)局的影響。

本研究利用RT?qPCR 進(jìn)一步驗(yàn)證了HNRNPU mRNA 在ICSI 組（嚴(yán)重少、弱精子癥）精子中相對表達(dá)量高于正常組精子（P< 0.001），結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序一致，驗(yàn)證了測序結(jié)果，提示剪接體蛋白可能通過影響生精細(xì)胞的凋亡、死亡和生長而在生精過程中發(fā)揮重要作用。由于HNRNPU 在生精功能較差的睪丸組織顯著下調(diào)，使得mRNA 的轉(zhuǎn)錄后修飾第一步即無法進(jìn)行，HNRNPU 在精子中表達(dá)上調(diào)可能是由于剪接功能在睪丸組織中受阻后機(jī)體代償?shù)慕Y(jié)果。與WU 等［4］的研究相似，其認(rèn)為剪接體缺陷會(huì)影響睪丸精原細(xì)胞分化，抑制精子發(fā)育和成熟，并與非梗阻性無精子癥的發(fā)生相關(guān)。

研究還將HNRNPU mRNA 和常規(guī)精子質(zhì)量參數(shù)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示精子HNRNPU mRNA 的相對表達(dá)量與PR 精子總數(shù)、正常形態(tài)精子百分率、誘發(fā)頂體反應(yīng)率和精子核成熟度等均存在負(fù)相關(guān)，與精子碎片化指數(shù)存在正相關(guān)（均P< 0.01），提示其可能成為判斷精子質(zhì)量的潛在分子靶標(biāo)。

選擇研究時(shí)間內(nèi)，女方采用長效長方案促排卵并行ICSI 治療的104 個(gè)周期，男方精子HNRNPU基因mRNA 與PR 精子總數(shù)和2PN 率存在負(fù)相關(guān)（P< 0.05），與男方年齡、精液量、精子濃度、卵裂率和優(yōu)胚率無顯著相關(guān)（P> 0.05）；同時(shí)分析了臨床妊娠組和非妊娠組精子HNRNPU mRNA 表達(dá)量，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。提示HNRNPU對男性生育力的作用主要是對精子生成和受精能力的影響，可能與本研究女方年齡較小、卵子質(zhì)量較高、修復(fù)精子基因損傷的能力較強(qiáng)有關(guān)，說明ICSI 受精后，胚胎發(fā)育潛能可能與女方因素關(guān)系更大［14-15］。

在精子數(shù)< 5 × 106/mL 的不育男性中，遺傳異常的發(fā)生率是正常男性的10 倍，基因變異不可忽視［16］。精子發(fā)生需眾多基因協(xié)作，多個(gè)基因變異可導(dǎo)致生精阻滯［17］。因此，本研究中精子HNRN?PU mRNA 表達(dá)上調(diào)可能是嚴(yán)重少、弱精子癥發(fā)病的原因之一，對ICSI 受精率有一定的預(yù)測作用。在臨床工作中，應(yīng)更多關(guān)注男性精子特異基因的變化，其可能影響生育力。