鐘育武 趙展慶

海南西部中心醫(yī)院1急診科，2重癥醫(yī)學(xué)科（海南儋州571700）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是指因冠狀動(dòng)脈不穩(wěn)定、血栓形成、心肌壞死而引起的嚴(yán)重心肌急性持續(xù)性缺血缺氧［1］。外泌體（exosome，exo）是由細(xì)胞分泌到胞外的直徑為30~200 nm的小囊泡，該囊泡中含有多種蛋白質(zhì)與核酸，作為媒介參與細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞［2］。exo 近些年來被認(rèn)為是極具潛力的生物診斷標(biāo)志物，被應(yīng)用于多種疾病的診斷與治療中［3］。先前研究表明心肌結(jié)節(jié)病與AMI 患者循環(huán)exo 中miR?NA 的表達(dá)具有差異，提示exo 源性miRNA 可作為疾病的生物標(biāo)志物［4］。有研究發(fā)現(xiàn)血清e(cuò)xo 分泌miR?939?5p 在心肌缺血中參與調(diào)控血管生成［5］，miR?939?5p 在AMI 中的表達(dá)較健康對(duì)照組顯著降低［6］，但是miR?939 在AMI 中發(fā)揮作用的具體機(jī)制未被揭示。腺苷酸環(huán)化酶6（ADCY6）是一種磷酸酶，主要分布于細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，可將ATP轉(zhuǎn)變成為cAMP，引起細(xì)胞的信號(hào)應(yīng)答［7-8］。據(jù)報(bào)道，腎上腺素通過轉(zhuǎn)錄因子CREB1 上調(diào)心臟中CIRC?HIPK3 進(jìn)而增加ADCY6 的表達(dá)，下調(diào)ADCY6 可以減輕小鼠心肌梗死后的心肌纖維化，并維持心功能［9］。

本研究通過建立缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞模型與AMI 大鼠模型，分離正常心肌細(xì)胞exo，干預(yù)exo 中miR?939 表達(dá)，對(duì)AMI 細(xì)胞模型與大鼠模型進(jìn)行exo 治療，探討exo 源性miR?939 在AMI 中的具體作用機(jī)制，為AMI 的診斷與治療尋找潛在的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 試劑與器材H9C2 細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所細(xì)胞庫）。HEK293 細(xì)胞（湖南豐暉生物科技有限公司）。SD 大鼠（江蘇艾菱菲生物科技有限公司）。血清外泌體提取試劑盒（北京全式金生物）。細(xì)胞外泌體提取試劑盒（武漢華美生物）。二氯化鈷（Sigma?Aldrich）。MTT 檢測(cè)試劑盒（上海翊圣）。Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑、PVDF膜、RPMI?1640 培養(yǎng)基、cDNA 合成試劑盒、Applied Biosystems 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光試劑、雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒（Thermo Fisher）。pcD?NA 質(zhì)粒與miRNA 模擬體、抑制劑（上海吉瑪基因）。qRT?PCR 引物序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。放射免疫沉淀裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、TTC 染色液（南京森貝伽生物）?？贵w均購自Abcam公司。結(jié)晶紫、Annexin V?FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶）。外泌體轉(zhuǎn)染試劑（上海覓拓生物）。FV3000 激光共聚焦顯微鏡（Copyright）。CytoFLEX 流式細(xì)胞儀（Beck?man Coulter）。Vevo 2100 超聲機(jī)（VisualSonics）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（GEO）中搜索關(guān)于AMI芯片并進(jìn)行分析。TargetScan（http：//targetscan.org/vert_72/）獲取miR?939 的靶基因。

1.2.2 血清收集收集2019年8月至2020年8月我院收治的52 例AMI 患者的血漿（男32 例，女20 例，平均年齡49.5 歲），健康人的血漿從體檢人群中進(jìn)行收集，取材前均簽署書面知情同意書。將血漿3 000×g離心30 min，得到血清。本研究經(jīng)海南西部中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.3 外泌體分離與鑒定血清中外泌體使用血清外泌體提取試劑盒分離并純化。細(xì)胞中外泌體的提取則使用CUSABIO 外泌體提取試劑盒來完成，具體步驟依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。透射電子顯微鏡觀察外泌體，Western blot 檢測(cè)exo 標(biāo)志物CD9、CD81、CD63。

1.2.4 缺氧細(xì)胞模型的建立與分組H9C2 細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板，1.5×104個(gè)/孔，添加10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，加入二氯化鈷（CoCl2）用于建立缺氧心肌細(xì)胞模型。H9C2細(xì)胞被分為8 組：Control 組（常氧H9C2 細(xì)胞）、hypoxic 組（CoCl2處理的H9C2細(xì)胞）、exo組（CoCl2?H9C2+exo）、exo+NC 組（CoCl2?H9C2+exo?NC）、exo+inh?miR?939組（CoCl2?H9C2+exo+inh?miR?939）、exo+miR?939 組（CoCl2?H9C2+ exo+miR?939）、exo+miR?939+pcDNA組（CoCl2?H9C2+exo+miR?939+pcDNA）、exo+miR?939+ADCY6 組（CoCl2?H9C2+exo+miR?939+AD?CY6）。在轉(zhuǎn)染前1 天將H9C2 細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板中，每孔5 × 104個(gè)，第二天使用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h 后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 exo 與H9C2 細(xì)胞的共培養(yǎng)H9C2 細(xì)胞缺氧培養(yǎng)4 h 后，與正常H9C2 細(xì)胞共培養(yǎng)，未進(jìn)行共培養(yǎng)的缺氧H9C2 細(xì)胞作為對(duì)照組。使用qRT?PCR 檢測(cè)miR?939 的表達(dá)情況。

1.2.6 3?（4，5?二甲基噻唑?2?基）?2，5?二苯基四唑溴化銨（MTT）法將細(xì)胞制成單個(gè)細(xì)胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板，5 × 103個(gè)/孔，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后向孔板中加入MTT 工作液，每孔10 μL，放置在培養(yǎng)箱中4 h。加入甲臜溶解液，100 μL/孔。培養(yǎng)4 h 后使用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡分析（Western blot）細(xì)胞與exo使用放射免疫沉淀裂解液進(jìn)行裂解，吸取上清液使用BCA 蛋白定量試劑盒定量。行SDS?PAGE 凝膠電泳，在90 mA 時(shí)將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。5%脫脂牛乳將膜封閉，在膜上加入一抗CD9（1∶2 000）、CD81（1∶1 000）、CD63（1∶1 000）、GM130（1∶1 000）、ADCY6（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）在4 ℃下過夜孵育。第二天使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗山羊抗兔IgG（1∶2 000）室溫下孵育1 h。使用化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光試劑顯影，并在Bio?Rad 數(shù)字圖像系統(tǒng)上對(duì)蛋白進(jìn)行分析。

1.2.8 Transwell 分析胰蛋白酶處理細(xì)胞，并懸浮于RPMI?1640 培養(yǎng)基中，調(diào)整為3 × 105個(gè)/mL，在上腔室加入200 μL細(xì)胞，下腔室加入含有20%胎牛血清的600 μL 培養(yǎng)基，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。使用棉簽擦拭細(xì)胞。PBS 洗滌，4%多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色8 min，在顯微鏡下拍照觀察細(xì)胞并對(duì)遷移細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)收集細(xì)胞并根據(jù)Annexin V?FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒說明書的要求對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，借助流式細(xì)胞儀檢測(cè)觀察細(xì)胞凋亡情況，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.10 雙熒光素酶報(bào)告基因分析構(gòu)建含有miR?939 結(jié)合序列的ADCY6 野生型（ADCY6?WT）與突變型（ADCY6?MUT）質(zhì)粒，將以上質(zhì)粒分別與miR?939 NC、miR?939 mimic 共轉(zhuǎn)染到HEK293 細(xì)胞中，按照Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑的出廠商要求進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h 后收集細(xì)胞進(jìn)行裂解，應(yīng)用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)每組細(xì)胞的熒光素酶活性，檢測(cè)過程按照試劑盒要求進(jìn)行。

1.2.11 qRT?PCR將細(xì)胞樣本中的總RNA 使用Trizol 試劑進(jìn)行提取，并測(cè)定RNA 的濃度與純度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 合成cDNA，mRNA 的表達(dá)使用SYBR?PCR 混合試劑與Applied Biosystems實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行分析，以上所有檢測(cè)步驟均按照試劑盒說明書進(jìn)行。miR?939 以U6 作為參考，ADCY6 以GAPDH 為參考。2?ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)是否屬于正態(tài)分布應(yīng)用Kolmogorov Smirnov 檢驗(yàn)，兩組間數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進(jìn)行比較，兩兩數(shù)據(jù)比較采用Sidak 檢驗(yàn)或Tukey 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR?939 在AMI 樣本中表達(dá)降低GSE34571數(shù)據(jù)集顯示與未接受治療降低患者相比，miR?939在治療后的患者中表達(dá)顯著降低。qRT?PCR 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與健康人血清相比，AMI 患者血清中miR?939表達(dá)降低（圖1A，P< 0.05）。與正常H9C2 細(xì)胞相比，缺氧H9C2 細(xì)胞中miR?939 表達(dá)降低（圖1B，P< 0.05）。另外發(fā)現(xiàn)較健康人血清外泌體，AMI患者血清外泌體中miR?939 表達(dá)顯著降低（圖1C，P< 0.05）。說明miR?939 可能在AMI 的發(fā)展中發(fā)揮作用。

圖1 miR?939 在AMI 樣本中表達(dá)降低Fig.1 The expression of miR?939 was decreased in AMI samples

2.2 exo可攜帶miR?939進(jìn)入H9C2細(xì)胞使用透射電子顯微鏡觀察exo 顯示為杯狀或球行狀，直徑在40 ~ 100 nm（圖2A）。Western blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD9、CD81、CD63 過表達(dá)，而GM130 不表達(dá)（圖2B），exo被成功提取。正常H9C2 細(xì)胞與缺氧H9C2 細(xì)胞共培養(yǎng)后，缺氧H9C2 細(xì)胞中miR?939 表達(dá)顯著上升，而加入外泌體抑制劑GW4869 后miR?939 的表達(dá)部分降低（均P<0.05，圖2C），說明miR?939可能由正常H9C2細(xì)胞分泌exo包裹進(jìn)入缺氧H9C2細(xì)胞。

圖2 exo 攜帶miR?939 進(jìn)入H9C2 細(xì)胞Fig.2 Exo carries miR?939 into H9C2 cells

2.3 正常H9C2細(xì)胞分泌的exo攜帶miR?939可減輕缺氧心肌細(xì)胞損傷與Control 組相比，hypoxic組細(xì)胞活力與遷移均降低，凋亡率上升（均P<0.05）。與hypoxic組相比，exo組H9C2細(xì)胞的活力與遷移均增加，而細(xì)胞凋亡率降低（均P<0.05）。與exo+NC組相比，exo+inh?miR?939 組的H9C2 細(xì)胞的活力與遷移均減少，并且細(xì)胞凋亡率上升（均P<0.05，圖3）。

圖3 miR?939 可減輕缺氧心肌細(xì)胞損傷Fig.3 miR?939 reduced hypoxic cardiomyocyte damage

2.4 miR?939和ADCY6存在靶向關(guān)系借助Target Scan 預(yù)測(cè)和miR?939 特異性結(jié)合位點(diǎn)的靶點(diǎn)，結(jié)果顯示ADCY6 和miR?939 存在特異性結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了二者間的靶向關(guān)系（圖4A）。檢測(cè)正常和AMI患者血清中ADCY6的表達(dá)結(jié)果顯示，AMI 患者血清中ADCY6 的表達(dá)顯著增強(qiáng)（圖4B）。與正常H9C2 細(xì)胞相比，缺氧的H9C2 細(xì)胞中ADCY6 的mRNA 與蛋白表達(dá)均提高（均P<0.05，圖4C）。

圖4 ADCY6 是miR?939 的一個(gè)靶點(diǎn)Fig.4 ADCY6 was a target gene of miR?939

2.5 ADCY6 可部分抵消miR?939 對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用與hypoxic 組相比，exo 組的細(xì)胞活力與遷移均上升，凋亡率下降，而與exo?NC 組相比，exo+miR?939 組的細(xì)胞活力與遷移均有所提高，凋亡率下降，與exo+miR?939+pcDNA 組相比，exo+miR?939+ADCY6 組中細(xì)胞的活力與遷移均下降，而細(xì)胞凋亡率有所上升（均P<0.05，圖5）。

圖5 ADCY6 可部分抵消miR?939 對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用Fig.5 The protective effect of miR?939 on hypoxic cardiomyocytes was partially offset by ADCY6

3 討論

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miRNA 可由exo 包裹攜帶進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮功能，而exo 中存在的miRNA 與血液中存在的miRNA 的表達(dá)具有差異，所以有必要對(duì)exo中的miRNA 進(jìn)行研究［10?12］。本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)研究exo 及分泌的miR?939 在AMI 中的潛在作用機(jī)制。

首先分析GEO 數(shù)據(jù)庫中名為GSE34571 的芯片。該芯片顯示AMI 患者接受治療后的心室舒張末期容積（LVEDV）顯著低于治療前［13］，該芯片數(shù)據(jù)顯示miR?939 在治療后的患者中表達(dá)顯著升高，之前有研究證明miR?939?5p 在AMI 患者中顯著下調(diào)［6］，本研究證實(shí)miR?939在AMI患者中表達(dá)較健康人下調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)miR?939可來源于血清e(cuò)xo［14］，本研究分離血清e(cuò)xo，發(fā)現(xiàn)在AMI 患者的血清外泌體中miR?939 表達(dá)顯著降低。為進(jìn)一步確認(rèn)miR?939 外泌體來源的細(xì)胞，本研究在正常心肌細(xì)胞中分離外泌體，與缺氧心肌細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)缺氧心肌細(xì)胞中miR?939 的表達(dá)上調(diào)，GW4869 能部分抑制該作用，進(jìn)一步證實(shí)正常心肌細(xì)胞分泌的外泌體作為傳遞miR?939 的介質(zhì)。

另外本研究發(fā)現(xiàn)exo 對(duì)缺氧心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，敲減exo 中miR?939 的表達(dá)可以降低exo對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，說明exo 可能是通過分泌miR?939 來發(fā)揮作用。據(jù)報(bào)道LncRNA Rp4 可通過下調(diào)miR?939 加重缺氧心肌細(xì)胞的損傷［15］。血清e(cuò)xo 通過miR?939?iNOS?NO 途徑促進(jìn)心肌缺血患者的血管形成。而本研究針對(duì)miR?939 對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的功能進(jìn)行探討。研究顯示exo 可以促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖、遷移，并抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)缺氧心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用，并且在exo 中過表達(dá)miR?939 比單獨(dú)使用exo 的治療效果更顯著。而敲減exo 中miR?939 的表達(dá)使exo 對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用大打折扣，進(jìn)一步證實(shí)exo 是通過分泌miR?939 發(fā)揮心肌保護(hù)作用。此外，本研究證實(shí)miR?939 可以靶向ADCY6，過表達(dá)ADCY6 可部分抵消過表達(dá)miR?939 對(duì)缺氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，有研究顯示敲除CircSLc8a1 可通過miR?133a 下調(diào)ADCY6 來減輕壓力超負(fù)荷所致的心肌肥厚［16］。YANG 等［17］通過PPI 網(wǎng)絡(luò)分析在心肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)6 個(gè)與心臟病相關(guān)的新基因其中就包括ADCY6。miR?182 通過降低ADCY6 的表達(dá)來調(diào)節(jié)心肌肥厚小鼠的心肌肥大反應(yīng)［18］。在體內(nèi)exo 可以提高AMI大鼠的LVEF 和LVFS，并減少心肌梗死面積。而在AMI 大鼠中轉(zhuǎn)染敲減miR?939 的exo 后，exo 的治療作用被部分抑制。

本次研究?jī)H僅觀察對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生的作用，AMI 的發(fā)病過程中仍有其他細(xì)胞在參與，如內(nèi)皮細(xì)胞。所以還需要大量研究進(jìn)一步驗(yàn)證本次研究結(jié)果并在臨床中實(shí)現(xiàn)利用價(jià)值。

綜上所述，證實(shí)exo 分泌的miR?939 可以通過下調(diào)ADCY6 減輕缺氧心肌細(xì)胞的損傷，保護(hù)AMI的心肌功能，為AMI 的預(yù)防與治療提供了新的分子靶點(diǎn)。