田林強(qiáng) 來?xiàng)?張玥 王玉華 翁孝剛 董新文 姚三巧 任文杰

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院1創(chuàng)傷與骨科研究所，2泌尿外科（河南新鄉(xiāng)453003）；3新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院（河南新鄉(xiāng)453003）

瓦斯爆炸是煤礦安全生產(chǎn)的常見危害，素有煤礦安全生產(chǎn)“第一殺手”之稱，其造成的礦難次數(shù)和死亡人數(shù)在煤礦安全生產(chǎn)事故中均居首位［1-2］。瓦斯爆炸的主要致傷因素包括爆炸沖擊波損傷、高溫火焰燒傷和有毒有害氣體中毒以及繼發(fā)災(zāi)害［3］。在瓦斯爆炸傷中，肺臟是最易受到損傷的器官［4-5］。筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)，吸入高溫氣體和有毒有害氣體均會(huì)造成肺臟的損傷，并伴隨出凝血功能的障礙［6］。在肺損傷及其修復(fù)過程中，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞均發(fā)揮重要的作用［7］。

研究表明，凝血異常會(huì)加重肺內(nèi)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)和加重肺損傷，而抗凝治療能夠減輕急性肺損傷的發(fā)生［8-9］。在顱腦損傷引起的肺損傷中，凝血功能障礙出現(xiàn)在急性肺損傷之前，說明其能夠誘導(dǎo)及加重急性肺損傷的發(fā)生［10］。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)，凝血異常在瓦斯爆炸傷害患者中常見，而且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，瓦斯爆炸傷大鼠肺泡灌洗液中凝血酶?抗凝血酶Ⅲ活性明顯升高，說明凝血異常的存在［6］。肽基輔氨酰順反異構(gòu)酶Pin1 能夠調(diào)控組織因子的轉(zhuǎn)錄和NF?κB的活性，進(jìn)而加重肺組織的損傷［11］。在瓦斯爆炸所導(dǎo)致的肺損傷中，抑制Pin1是否抑制炎癥反應(yīng)或凝血異常，從而改善肺功能，尚未見明確的報(bào)道。胡桃醌是胡桃楸和核桃中存在的活性物質(zhì)，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性［12］。其作為Pin1 的天然抑制劑，能夠抑制其促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移等作用，但其在急性肺損傷中是否發(fā)揮作用以及發(fā)揮作用的機(jī)制尚不清楚。本研究通過建立體外沖擊波損傷的A549細(xì)胞模型，闡明胡桃醌的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器A549 細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫，DMEM/F12K 購自上海培源生物科技股份有限公司，胎牛血清、青?鏈霉素雙抗、胡桃醌購自Sigma 公司，CCK?8 溶液購自碧云天生物技術(shù)公司，IL?6、IL?8ELISA 試劑盒購自聯(lián)科生物。RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑購自博士德生物科技有限公司、caspase?3、caspase?9 及β?actin 抗體購自Cell Signal Technology。體外沖擊波碎石機(jī)為交大南洋JDPN?V 型，化學(xué)發(fā)光成像儀為上海勤翔6100 型，全波長(zhǎng)讀數(shù)儀和CO2培養(yǎng)箱購自賽默飛。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及沖擊波建模A549 用含10%胎牛血清、1%青?鏈霉素的DMEM/F12K 培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合到80% ~90%時(shí)，消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［12］，采用間接定位法確定體外沖擊波焦點(diǎn)，將含細(xì)胞懸液的離心管固定在涂有螯合劑的焦點(diǎn)處，13.7 kV 固定能量沖擊，探索最佳沖擊次數(shù)。

1.3 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)將處理后的細(xì)胞以2 000個(gè)/孔的密度接種在96 孔板中，在沖擊后的24、48、72 h 檢測(cè)450 nm 處OD值，計(jì)算細(xì)胞生存率。細(xì)胞生存率=（實(shí)驗(yàn)組OD值?空白組OD值）/（對(duì)照組OD值?空白組OD值）×100%。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)炎性因子表達(dá)收集細(xì)胞上清液，300 g離心10 min去除沉淀，取上清，ELISA 試劑盒檢測(cè)IL?6、IL?8的含量。按說明書進(jìn)行操作，測(cè)定450 nm 處的OD值。通過標(biāo)準(zhǔn)品濃度計(jì)算擬合曲線，根據(jù)公式計(jì)算檢測(cè)樣本濃度。

1.5 胡桃醌細(xì)胞毒性檢測(cè)及預(yù)處理將A549 細(xì)胞以5 000 個(gè)/孔密度接種在96 孔板中，細(xì)胞貼壁后，加入0.25、0.5、1、1.25 μg/mL 胡桃醌，加藥3、6、12、24 h 檢測(cè)細(xì)胞活力，獲得后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度和作用時(shí)間。

1.6 Western blot 檢測(cè)caspase?3 和caspase?9 蛋白變化棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS 清洗細(xì)胞后加入含廣譜蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上裂解40 min，4 ℃、10 000 g 離心15 min，取上清。測(cè)蛋白濃度后加入上樣緩沖液，煮沸10 min，分裝備用。使用80 V 電壓在10% SDS?聚丙烯酰胺凝膠電泳至Marker 條帶分開，調(diào)整電壓為120 V，當(dāng)染料到達(dá)凝膠底部停止電泳。300 mA 電流轉(zhuǎn)膜2 h，封閉90 min，一抗4℃孵育過夜。洗膜后，相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，再次洗膜后，滴加ECL 發(fā)光液，成像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢測(cè)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外超聲波處理導(dǎo)致細(xì)胞活性降低和炎癥因子表達(dá)增加，提示細(xì)胞模型制作成功通過不同次數(shù)體外沖擊波損傷后檢測(cè)細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)明顯的變化，見圖1。細(xì)胞經(jīng)過1 000 次沖擊后培養(yǎng)24 h，細(xì)胞活力降至（49.2 ± 3.04）%，48 h 和72 h 有所回升，探究沖擊波損傷的機(jī)制，因此采用沖擊1 000 次、培養(yǎng)24 h 作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)條件。同時(shí)發(fā)現(xiàn)體外沖擊波沖擊1 000 次后細(xì)胞上清中IL?6 和IL?8 的水平分別為（55.6 ± 0.4）pg/mL 和（1 480.3 ± 19.1）pg/mL，均較正常對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

圖1 不同次數(shù)沖擊波損傷后不同時(shí)間點(diǎn)A549 細(xì)胞活力的改變Fig.1 Cell viability of A549 cells was detected by CCK?8 at different time after exposed to various times of shockwaves injury

圖2 胡桃醌預(yù)處理能夠降低經(jīng)過沖擊波處理的A549 細(xì)胞上清液中IL?6 和IL?8 含量Fig.2 Pre?treatment with Juglone，the concentration of IL?6 and IL?8 in the supernatants was decreased after 1 000 times shockwaves injury

2.2 胡桃醌能夠改善沖擊波導(dǎo)致的細(xì)胞活力下降通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胡桃醌在0.5 μg/mL濃度作用A549細(xì)胞6 h后，對(duì)細(xì)胞活力沒有明顯影響，因此采用這一濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖3。A549 細(xì)胞經(jīng)過0.5 μg/mL 的胡桃醌預(yù)處理6 h 后，進(jìn)行沖擊波處理，隨后檢測(cè)細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)沖擊波損傷組（shockwave group，SW）細(xì)胞活力為（52.5 ± 0.9）%，胡桃醌預(yù)處理組（shockwave+Juglone group，SW+Jug）細(xì)胞活力為（70.1±3.1）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖4，說明胡桃醌對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用。

圖3 不同濃度胡桃醌處理不同時(shí)間后A549 細(xì)胞活力Fig.3 Cell viability of A549 was detected by CCK?8 at different time after exposed to various concentration of Juglone

圖4 胡桃醌預(yù)處理A549 細(xì)胞能夠提高體外沖擊波損傷后的細(xì)胞活力，降低沖擊波對(duì)細(xì)胞的損傷Fig.4 A549 cells were pre?treated with 0.5ug/ml Juglone for 6h，then exposed to 1 000 times shockwaves，the cell viability was increased

2.3 胡桃醌能夠抑制體外沖擊波導(dǎo)致A549 細(xì)胞炎癥因子釋放為了檢測(cè)胡桃醌對(duì)體外沖擊波導(dǎo)致的A549 細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，收集體外沖擊波損傷后24 h 的細(xì)胞上清，檢測(cè)IL?6、IL?8 的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和沖擊波損傷組（shock wave group，SW）相比，胡桃醌預(yù)處理組（shock wave + Juglone group，SW+Jug）IL?6、IL?8 的表達(dá)量分別為（37.3±1.2）pg/mL 和（1 281.9± 17.3）pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2，說明胡桃醌能夠抑制沖擊波導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，從而減輕細(xì)胞損傷。

2.4 胡桃醌能夠抑制caspase?3 和caspase?9 的表達(dá)在體外沖擊波導(dǎo)致的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷中發(fā)現(xiàn)，caspase?3 和caspase?9 的表達(dá)量明顯升高，說明也存在細(xì)胞凋亡。加入胡桃醌后，其能夠抑制caspase?3、和caspase?9 的表達(dá)，說明能夠抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕上皮細(xì)胞的損傷，為后期肺功能的恢復(fù)提供條件，見圖5。

圖5 胡桃醌預(yù)處理能夠降低caspase?3 和caspase?9 的表達(dá)量Fig.5 Caspase?3 and caspase?9 protein level were decreased by pretreated with julgone and exposed to 1000 times shockwave injury

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)胡桃醌能夠減輕沖擊波造成的細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活力，減少IL?6 和IL?8 的釋放，降低caspase?3 和caspase?9 蛋白表達(dá)水平，抑制肺泡上皮細(xì)胞凋亡［13］，從而減少?zèng)_擊波造成的損害，發(fā)揮保護(hù)作用，有成為臨床治療肺損傷用藥的可能。

肺爆震傷的發(fā)生機(jī)制尚未明確，沖擊波在其中發(fā)揮重要作用。沖擊波對(duì)生物體的作用包括峭化?撕裂效應(yīng)、空化?內(nèi)爆效應(yīng)、空化?生化效應(yīng)和非熱效應(yīng)，產(chǎn)生修復(fù)、血管生成和擴(kuò)張、解痙及鎮(zhèn)痛作用［14］。在低能量情況下，沖擊波能夠促進(jìn)ARDS大鼠肺內(nèi)線粒體轉(zhuǎn)移至特定細(xì)胞，發(fā)揮減輕炎癥反應(yīng)和降低損傷的作用［15］。但高能量的沖擊波能夠造成肺組織內(nèi)血液滲漏、炎癥反應(yīng)增加，活性氧簇表達(dá)增高和細(xì)胞凋亡增加，其中caspase?3蛋白和mRNA的表達(dá)水平均明顯增高［16-17］。炎性小體激活和炎癥反應(yīng)在急性肺損傷中發(fā)揮了重要的作用［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，使用過量的沖擊波刺激，會(huì)導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞炎性因子表達(dá)升高，caspase?3和caspase?9蛋白表達(dá)升高，發(fā)生細(xì)胞凋亡。

Pin1 在炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生中均發(fā)揮重要作用［19］，在小腸缺血?再灌注損傷中，抑制Pin1 能夠抑制炎癥反應(yīng)，減輕損傷［20］。胡桃醌作為Pin1 的天然抑制劑，具有抗炎、抗菌及抗腫瘤生物學(xué)活性。胡桃醌在濃度低于10 μmol/L 時(shí)對(duì)單核巨噬細(xì)胞沒有明顯毒性作用［21］。本研究采用的濃度低于此濃度，發(fā)現(xiàn)其作用6 h 對(duì)A549 細(xì)胞沒有明顯的損傷。胡桃醌能夠抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性小體的激活，從而抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，發(fā)揮抗炎的作用［21］。這和本研究結(jié)果相一致。

雖然本研究發(fā)現(xiàn)胡桃醌能夠抑制沖擊波造成的A549 細(xì)胞損傷，但是僅進(jìn)行了體外細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，沒有在沖擊波肺損傷動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，而且對(duì)損傷的機(jī)制研究也不夠深入，這是本研究的不足，也是下一步要研究的內(nèi)容。