王寶金 徐麗達(dá) 趙欣欣 林少?zèng)_ 李霞 杜俊鵬 王凱

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院1婦科，4小兒外科（鄭州450052）；2河南省卵巢惡性腫瘤國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室（鄭州450052）；3同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心（上海201204）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌［1］，病死率居女性生殖系統(tǒng)腫瘤的首位［2］。卵巢癌起病隱匿，術(shù)后易復(fù)發(fā)，缺乏有效的治療方法［3］。Krüppel樣因子4（Kruppel?like factor 4，KLF4）是一種參與調(diào)控上皮或者間充質(zhì)基因的含鋅指轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化等多種細(xì)胞過(guò)程［4］。KLF4 已被證實(shí)在多種癌癥中，包括胃癌［5］、乳腺癌［6］、前列腺癌［7］以及骨肉瘤［8］中起著抑癌基因的作用。然而，有研究表明［9］，在小細(xì)胞肺癌中KLF4促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和化學(xué)抗性。本課題組前期研究表明［10］，在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中KLF4 扮演著抑制調(diào)節(jié)劑的作用。然而，其具體分子機(jī)制尚未明確。上皮細(xì)胞?間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal cell transition，EMT）能有效地促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、耐藥性以及腫瘤的增殖。EMT 涉及多種不同的信號(hào)通路，TGF?β 信號(hào)通路為其中之一，且分為Smad 介導(dǎo)及非Smad 介導(dǎo)兩條途徑，其中最經(jīng)典的途徑是由胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Smad 介導(dǎo)的TGF?β 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［11］。

目前，在卵巢癌的相關(guān)研究中KLF4 的作用及機(jī)制尚不明確，本研究通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染建立KLF4過(guò)表達(dá)的SKOV3 細(xì)胞系，旨在探討KLF4 通過(guò)調(diào)控Smad 介導(dǎo)的TGF?β 通路減弱EMT 從而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，并通過(guò)建立原位小鼠移植瘤模型，驗(yàn)證KLF4 在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為尋找卵巢癌的治療尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料卵巢癌細(xì)胞系SKOV3 購(gòu)自美國(guó)菌種保存中心（ATCC）。胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。N?cadherian 及E?cadherian 抗體均購(gòu)于美國(guó)Cell signaling 公司；β?catenin、甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）及二抗抗體均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz 公司；Western blot 蛋白印跡電泳儀購(gòu)于美國(guó)英杰公司；Western Blot 蛋白印跡轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)于美國(guó)伯樂(lè)公司；熒光顯微鏡購(gòu)于日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的

293FT 細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞分為KLF4 過(guò)表達(dá)組和空白對(duì)照組，KLF4 過(guò)表達(dá)組加入包裝好的過(guò)表達(dá)KLF4 病毒，空白對(duì)照組加入空載體熒光素酶病毒轉(zhuǎn)染SKOV3 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后用嘌呤霉素篩選，將穩(wěn)定過(guò)表達(dá)KLF4 的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，Western blot驗(yàn)證KLF4 的表達(dá)。

1.2.2 MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的變化實(shí)驗(yàn)組為已建立穩(wěn)定KLF4 過(guò)表達(dá)的SKOV3細(xì)胞系，對(duì)照組為熒光素酶載體轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞，取對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種培養(yǎng)。不同時(shí)間點(diǎn)分別加入DMSO 試劑，避光孵育后檢測(cè)各孔的吸光度（波長(zhǎng)為570 nm），統(tǒng)計(jì)結(jié)果并分析后制圖。

1.2.3 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的變化取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3 細(xì)胞，胰蛋白酶消化并重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取1 × 104個(gè)SKOV3細(xì)胞配置懸液后加入上室。侵襲實(shí)驗(yàn)需要制備Transwell 小室內(nèi)的基底膜：將Matrigel 稀釋并加入Transwell小室內(nèi)基底層。下室均為含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，溫箱孵育細(xì)胞5 h 后取出Transwell小室，室溫下甲醇固定后結(jié)晶紫溶液染色（侵襲實(shí)驗(yàn)用HE 染色），置于熒光倒置顯微鏡下拍照統(tǒng)計(jì)，比較細(xì)胞遷移、侵襲能力的變化。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)EMT 及TGF?β 相關(guān)蛋白的表達(dá)取合適密度SKOV3 細(xì)胞提取細(xì)胞蛋白，測(cè)吸光光度值（在595 nm 波長(zhǎng)下），同時(shí)計(jì)算各樣品的蛋白濃度及所加樣品的體積。加熱變性后冷卻，置于膠孔內(nèi)，恒壓轉(zhuǎn)膜結(jié)束后封閉液封閉。孵育抗體后至于暗室曝光。掃描條帶，使用Image J對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.2.5 建立原位小鼠移植瘤模型驗(yàn)證KLF4 過(guò)表達(dá)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的影響將熒光素酶標(biāo)記的KLF4 過(guò)表達(dá)SKOV3 細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞原位注射至裸鼠卵巢包膜內(nèi)，建立原位小鼠移植瘤模型，通過(guò)Xenogen 生物成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移情況，每周一次持續(xù)8 周。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在SKOV3 細(xì)胞中慢病毒載體介導(dǎo)KLF4過(guò)表達(dá)后細(xì)胞增殖能力降低采用MTT 法檢測(cè)24、48、72、96 h 細(xì)胞增殖情況，同一時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比，KLF4 過(guò)表達(dá)后細(xì)胞增殖水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），說(shuō)明KLF4 過(guò)表達(dá)后明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。見(jiàn)圖1。

圖1 MTT 法檢測(cè)KLF4 過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組細(xì)胞細(xì)胞增殖情況Fig.1 Cell proliferation of KLF4 overexpression group and control group was detected by MTT assay

2.2 在SKOV3 細(xì)胞中慢病毒載體介導(dǎo)KLF4 過(guò)表達(dá)后細(xì)胞侵襲、遷移能力降低采用細(xì)胞侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)KLF4 過(guò)表達(dá)與對(duì)照組細(xì)胞的侵襲及遷移能力變化。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，KLF4 過(guò)表達(dá)細(xì)胞系的細(xì)胞侵襲（圖2A）及遷移（圖2B）能力明顯下降，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），說(shuō)明KLF4 對(duì)卵巢癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力起到抑制作用。見(jiàn)圖2。

圖2 KLF4 過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組細(xì)胞遷移、侵襲能力變化Fig.2 Changes of cell migration and invasion ability between KLF4 overexpression group and control group

2.3 過(guò)表達(dá)KLF4 抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3 EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)Western blot 結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，KLF4 過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的EMT 相關(guān)間質(zhì)標(biāo)志物N?cadherin、β?catenin 表達(dá)降低，上皮標(biāo)志物E?cadherin 表達(dá)升高（圖3），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。表明過(guò)表達(dá)KLF4 能夠明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的EMT 過(guò)程，即KLF4 可能通過(guò)抑制EMT過(guò)程從而抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。見(jiàn)圖3。

圖3 Western blot 檢測(cè)SKOV3 細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.3 Western blot detected the expression of EMT?related proteins in SKOV3 cells

2.4 卵巢癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)KLF4 抑制Smad 介導(dǎo)的TGF?β 通路Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，KLF4 過(guò)表達(dá)組細(xì)胞P?Smad2 的表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），Total?Smad 2/3 的表達(dá)水平無(wú)明顯差異。提示KLF4 可能通過(guò)抑制Smad 介導(dǎo)的TGF?β 通路抑制卵巢癌細(xì)胞EMT。見(jiàn)圖4。

圖4 Western blot 分析比較KLF4 在不同時(shí)間點(diǎn)作用的SKOV3 細(xì)胞中p?SMAD2 及Total?SMAD2/3 的表達(dá)Fig.4 Western blot analysis and comparison of p?Smad2 and Total Smad2/3 expression in SKOV3 cells treated with KLF4 at different time points

2.5 KLF4 抑制原位小鼠卵巢癌移植瘤中原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移動(dòng)物成像結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)KLF4組的腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 KLF4 過(guò)表達(dá)組與對(duì)照組小鼠原位卵巢癌腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移情況Fig.5 Growth and metastasis of orthotopic ovarian cancer in mice of KLF4 overexpression group and control group

3 討論

由于卵巢癌起病隱匿，超過(guò)75%的女性患者確診時(shí)已為晚期階段［12］。目前的研究表明，KLF4在不同的癌癥中起著不同的生物學(xué)作用［5-9］。筆者前期研究結(jié)果表明［10］，KLF4 在卵巢癌中起到抑癌基因的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT 及Transwell 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了KLF4 過(guò)表達(dá)可以抑制卵巢癌的增殖、遷移及侵襲能力這一結(jié)論。然而KLF 具體的抑癌機(jī)制尚未明確，因此進(jìn)一步探究KLF4 在卵巢癌中的具體分子作用機(jī)制。

EMT 是一個(gè)上皮細(xì)胞極性和細(xì)胞?細(xì)胞連接缺失，以及遷移和侵入性特性增加的過(guò)程，是腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移、侵襲的基礎(chǔ)［13］。近年來(lái)大量研究表明，KLF4 在不同的癌細(xì)胞中通過(guò)激活上皮細(xì)胞標(biāo)記基因E?鈣黏蛋白（E?cadherin）的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)EMT 從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的［14］。同時(shí)EMT 參與多種信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中包含TGF?β［15］、AKT［16］、Notch［17］、ERK1/2［18］及WNT/連環(huán)蛋白［19］等通路。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子?β（TGF?β）是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和分化的細(xì)胞因子，通過(guò)不同機(jī)制在不同細(xì)胞類型中觸發(fā)G1 期細(xì)胞周期停滯。在JIANG 等［20］研究中，通過(guò)TGF?β/Smad2 信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)EMT?；谏鲜鲅芯?，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)慢病毒載體轉(zhuǎn)染建立空白對(duì)照組和過(guò)表達(dá)KLF4 組，進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)并檢測(cè)EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)。

本研究結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，KLF4 過(guò)表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白發(fā)生顯著變化；上皮細(xì)胞標(biāo)志物E?cadherin 表達(dá)增加，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N?鈣黏蛋白（N?cadherin）、β?連環(huán)蛋白（β?catenin）表達(dá)下降。研究表明，在EMT 的整個(gè)生物學(xué)過(guò)程中，伴有上皮標(biāo)志物E?cadherin 表達(dá)下調(diào)以及N?cadherin、β?catenin 表達(dá)上調(diào)［21］，這些變化可導(dǎo)致細(xì)胞粘附力降低，極性喪失和緊密連接，從而促進(jìn)腫瘤的遷移與侵襲。因此，過(guò)表達(dá)KLF4可通過(guò)抑制EMT，從而抑制與EMT 密切相關(guān)的卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：KLF4 過(guò)表達(dá)可以抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。同時(shí)，在本實(shí)驗(yàn)建立的原位小鼠移植瘤模型中，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)KLF4 組的腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移顯著降低，進(jìn)一步驗(yàn)證了過(guò)表達(dá)KLF4 可以抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。這將為卵巢癌的治療提供新的策略。

綜上所述，本研究通過(guò)探討KLF4 在卵巢癌中的作用及其作用機(jī)制，證明了KLF4 抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲是通過(guò)調(diào)控Smad 介導(dǎo)的TGF?β通路抑制EMT 實(shí)現(xiàn)的。有望成為卵巢癌診斷及治療的新靶點(diǎn)，為卵巢癌的治療提供新思路。然而目前的研究仍有不足，例如KLF4 在腫瘤的耐藥機(jī)制中起到何種作用以及KLF4 的上游基因調(diào)控機(jī)制等，仍需要進(jìn)行進(jìn)一步研究，以期為解決卵巢癌的耐藥特性提供新思路、為卵巢癌的治療提供新的依據(jù)。