祖珍玉 羅敏 申?yáng)|翔 張科 李軍鵬 陳潔 吳琳 申博文

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)（廣州510000）；2中國(guó)人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院（廣州510000）；3中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院（廣州510000）

宮腔粘連是一種以子宮內(nèi)膜損傷后宮腔前后壁部分或完全粘連為特征的婦科疾病［1］。IUA治療的主要目的是重建宮腔并恢復(fù)子宮內(nèi)膜功能［2］。宮腔鏡下經(jīng)宮頸粘連切除術(shù)（hysteroscopic transcervical resection of adhesion，TCRA）是宮腔粘連治療的標(biāo)準(zhǔn)方法，但術(shù)后粘連的高復(fù)發(fā)率和子宮內(nèi)膜容受性下降所致的低妊娠率仍然是臨床中重度IUA 患者重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題［3-5］。

普蘭尼克F?127（Pluronic F?127，PF?127）是一種可吸收的生物相容性支架材料，具有包括固有的生物相容性、低抗原性和生物降解性等優(yōu)異的生物學(xué)特性［6］。ADSCs 來(lái)源豐富，可通過(guò)分離、體外培養(yǎng)獲取且具有較強(qiáng)的分化能力［7］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)反復(fù)擴(kuò)增后功能旺盛，其抗炎抗纖維化作用和低免疫原性能抑制干細(xì)胞凋亡并能刺激干細(xì)胞再生，可在未來(lái)作為IUA 潛在治療方法［8-9］。目前鮮有將ADSCs和PF?127 水凝膠復(fù)合物應(yīng)用于中重度IUA 患者子宮內(nèi)膜再生修復(fù)的研究。本研究通過(guò)建立與臨床IUA 致病因素相似的化學(xué)損傷IUA 模型，并通過(guò)構(gòu)建ADSCs?PF?127 水凝膠復(fù)合物，探討其在體內(nèi)治療效果及其可能修復(fù)作用機(jī)制，以期為解決中重度IUA 患者子宮內(nèi)膜容受性下降的問(wèn)題提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通級(jí)健康成年未孕雌性新西蘭大白兔65 只，兔齡6～8 周，體質(zhì)量2.4～2.6 kg，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：［SCXK（粵）2019?0023］。兔子宮組織取材和相關(guān)實(shí)驗(yàn)于南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行［SYXK（粵）2019?0100］，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查（2019102502）。

1.2 主要試劑與儀器免疫組化試劑盒（Sigma，美國(guó)）；Masson 染色試劑盒（Sigma，美國(guó)）；BX?51 顯微鏡系統(tǒng)及數(shù)字圖像采集系統(tǒng)（Olympus，日本）；計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)Image?ProPlus6.0（SilverSpring，美國(guó)）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞負(fù)載PF?127 水凝膠復(fù)合物的制備兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)與鑒定按LI 等［10］研究方法，選擇25%的PF?127凝膠溶液包裹ADSCs 進(jìn)行細(xì)胞封裝，制備ADSCs?PF?127 水凝膠復(fù)合物以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及模型的制備選用25 只健康雌性普通級(jí)新西蘭大白兔并將其隨機(jī)分為假手術(shù)組、IUA 模型組、PF?127 水凝膠組、ADSCs 組、AD?SCs?PF?127 水凝膠復(fù)合物組，每組5 只。假手術(shù)組：打開(kāi)腹腔，暴露雙側(cè)子宮，不對(duì)子宮作任何處理，關(guān)腹；IUA 組：用95%乙醇損傷一側(cè)宮腔30 s，關(guān)腹；PF?127水凝膠組：建立IUA 模型14 d后，隨機(jī)選取一側(cè)兔子宮，使用注射器沿該側(cè)子宮角長(zhǎng)軸向腔內(nèi)注入2 mL PF?127溶液，靜置1~2 min，以確保注入宮腔內(nèi)的PF?127 溶液在生理溫度下已經(jīng)由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)；ADSCs 組：建立IUA 模型14 d后，隨機(jī)選取一側(cè)子宮，使用注射器沿該側(cè)子宮角長(zhǎng)軸向腔內(nèi)注入2 mL ADSCs 懸液（2×106個(gè)細(xì)胞）；ADSCs?PF?127 復(fù)合物組：建立IUA 模型后，隨機(jī)選取一側(cè)子宮，使用注射器沿該側(cè)子宮角長(zhǎng)軸向腔內(nèi)注入2 mL ADSCs?PF?127 水凝膠復(fù)合物；所有組別對(duì)側(cè)子宮均不予任何干預(yù)治療。干預(yù)治療術(shù)后，給予每組每只新西蘭白兔青霉素10 萬(wàn)IU/日，連續(xù)腹腔注射3 d。

1.3.3 病理組織切片及染色各組新西蘭大白兔在干預(yù)治療14 d 后，開(kāi)腹取出雙側(cè)子宮并分離，然后將分離出的子宮置于4%多聚甲醛浸泡固定后標(biāo)準(zhǔn)石蠟包埋，切成5 μm 切片以備后續(xù)蘇木精?伊紅（Hematoxylin and eosin，HE）染色和Masson 染色實(shí)驗(yàn)及免疫組化實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量檢測(cè)兔子宮組織樣本的石蠟切片行HE 染色。將染色的切片在室溫下風(fēng)干并用中性樹(shù)脂固定，然后，用顯微鏡觀察子宮的形態(tài)，計(jì)算腺體數(shù)量，并在每張切片上隨機(jī)選擇至少5 個(gè)高倍鏡視野圖像，計(jì)算平均值。

1.3.5 子宮內(nèi)膜纖維化程度檢測(cè)兔子宮組織樣本的石蠟切片行Masson 染色檢測(cè)子宮內(nèi)膜纖維化。應(yīng)用圖像處理軟件Image?ProPlus 6.0 計(jì)算每個(gè)視野中子宮內(nèi)膜間質(zhì)及腺體總面積的比值，并在每張切片上隨機(jī)選擇至少5 個(gè)高倍鏡視野圖像，計(jì)算平均值。

1.3.6 子宮內(nèi)膜厚度檢測(cè)兔子宮組織樣本的石蠟切片行HE染色和Masson染色。采用圖像處理軟件Image?ProPlus 6.0測(cè)量子宮內(nèi)膜厚度，計(jì)算平均值。

1.3.7 免疫組織化學(xué)檢測(cè)兔子宮組織樣本的石蠟切片行免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)TGF?β1的免疫表達(dá)量，采用圖像處理軟件Image?ProPlus 6.0 記錄每個(gè)視野子宮內(nèi)膜腺上皮和腔內(nèi)上皮的平均光密度（mean optical density，MOD），并在每張子宮切片上隨機(jī)選擇至少5個(gè)高倍鏡視野圖像，計(jì)算平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布和方差齊性的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析及Tukey 事后多重比較進(jìn)行分析，以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色評(píng)價(jià)損傷后子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目變化假手術(shù)組子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，IUA 模型組子宮內(nèi)膜表面被扁平的低柱狀上皮細(xì)胞覆蓋，子宮內(nèi)膜萎縮變薄、纖維化，上皮下有少量腺體，間質(zhì)水腫并伴有宮腔粘連帶出現(xiàn)，PF?127 水凝膠組和AD?SCs 組子宮內(nèi)膜稍增厚，ADSCs?PF?127 水凝膠復(fù)合物組中腺體出現(xiàn)大量增生。與假手術(shù)組相比，IUA模型組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目顯著下降（P< 0.05）；ADSCs 組和PF?127 水凝膠組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目與IUA 模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）；而ADSCs?PF?127 水凝膠復(fù)合物組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目與IUA 模型組相比明顯增加（P<0.05），見(jiàn)圖1、表1。

圖1 各組兔子宮內(nèi)膜腺體情況Fig.1 The endometrial glands of rabbits in each group

表1 各組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目的分析比較Tab.1 Analysis and comparison of the number of endometrial glands in each group ±s

表1 各組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目的分析比較Tab.1 Analysis and comparison of the number of endometrial glands in each group ±s

治療組別假手術(shù)組IUA 模型組PF?127 水凝膠組ADSCS 組ADSCs+PF?127 水凝膠組例數(shù)5 5 5 5 5子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目（個(gè)/HP）17.50±0.50 1.50±1.50 7.50±0.25 7.50±2.50 16.50±2.50 F 值30.25 P 值0.021

2.2 Masson染色評(píng)價(jià)損傷后纖維化增生的變化假手術(shù)組子宮內(nèi)膜間質(zhì)幾乎無(wú)膠原纖維沉積。IUA 模型組膠原纖維沉積增加，毛細(xì)血管充血水腫，間質(zhì)有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，ADSCs?PF?127 水凝膠復(fù)合物組子宮內(nèi)膜膠原纖維沉積量較IUA 組明顯減少。通過(guò)檢測(cè)各組子宮內(nèi)膜纖維化面積比率結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，IUA 模型組纖維化面積比率顯著增加（P< 0.05）；PF?127 水凝膠組子宮內(nèi)膜纖維化比率與IUA 模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）；ADSCs 組和ADSCs?PF?127 水凝膠復(fù)合物組纖維化面積比率較IUA 模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖2、表2。

表2 各組子宮內(nèi)膜纖維化面積比的分析比較Tab.2 Analysis and comparison of area ratio of endometrial fibrosis in each group ±s

表2 各組子宮內(nèi)膜纖維化面積比的分析比較Tab.2 Analysis and comparison of area ratio of endometrial fibrosis in each group ±s

治療組別假手術(shù)組模型組PF?127 水凝膠組ADSCs 組ADSCs+PF?127 水凝膠組例數(shù)5 5 5 5 5纖維化面積（%）4.20±0.32 59.60±3.68 35.09±4.37 29.45±3.54 4.32±0.57 F 值10.58 P 值0.002

圖2 各組兔子宮內(nèi)膜纖維化情況Fig.2 The fibrosis of endometrium of rabbits in each group

2.3 HE 染色和masson 染色評(píng)價(jià)損傷后子宮內(nèi)膜厚度變化在干預(yù)治療14 d 后測(cè)定各組兔子宮內(nèi)膜厚度。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，IUA模型組子宮內(nèi)膜厚度變?。≒< 0.05）；ADSCs 組和PF?127水凝膠組子宮內(nèi)膜厚度與IUA 模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；ADSCs?PF?127 水凝膠復(fù)合物組子宮內(nèi)膜厚度與IUA 模型組相比明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖3、表3。

圖3 各組兔子宮內(nèi)膜厚度情況Fig.3 The endometrial thickness of rabbits in each group

表3 各組子宮內(nèi)膜厚度分析比較Tab.3 Analysis and comparison of area ratio of endometrial fibrosis in each group ±s

表3 各組子宮內(nèi)膜厚度分析比較Tab.3 Analysis and comparison of area ratio of endometrial fibrosis in each group ±s

治療組別假手術(shù)組模型組PF?127水凝膠組ADSCs組ADSCs+PF?127水凝膠組例數(shù)5 5 5 5 5子宮內(nèi)膜厚度（μm）567.31±30.56 178.67±24.56 265.68±7.45 289.23±12.78 489.46±13.24 F值127.450.014 P值

2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)為了更進(jìn)一步量化各組宮腔粘連子宮內(nèi)膜纖維化程度，在干預(yù)治療14 d后通過(guò)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TGF?β的免疫表達(dá)量。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，IUA模型組TGF?β的免疫表達(dá)量明顯升高（P< 0.05）；ADSCs 組和PF?127水凝膠組子宮內(nèi)膜TGF?β 免疫表達(dá)很弱，與IUA模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而ADSCs?PF?127 水凝膠復(fù)合物組TGF?β 免疫表達(dá)量顯著低于IUA 模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.001），見(jiàn)圖4、表4。

表4 各組兔子宮內(nèi)膜組織TGF?β 免疫表達(dá)水平分析比較Tab.4 Comparison of TGF?β immune expression levels in endouterine tissues of rabbits in each group ±s

表4 各組兔子宮內(nèi)膜組織TGF?β 免疫表達(dá)水平分析比較Tab.4 Comparison of TGF?β immune expression levels in endouterine tissues of rabbits in each group ±s

治療組別假手術(shù)組模型組PF?127水凝膠組ADSCs組ADSCs+PF?127水凝膠組例數(shù)5 5 5 5 5 TGFβ?1免疫表達(dá)量0.01±0.00 0.04±0.01 0.03±0.02 0.02±0.01 0.05±0.02 F值0.21 P值<0.001

3 討論

宮腔粘連通常伴隨著正常子宮內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致月經(jīng)異常、不孕、反復(fù)流產(chǎn)和妊娠并發(fā)癥［11-14］。醫(yī)源性刮宮是子宮內(nèi)膜功能層丟失的主要原因［12］。宮腔鏡粘連松解術(shù)和激素治療是去除宮腔內(nèi)結(jié)締組織，重建子宮內(nèi)膜的常用方法，但術(shù)后粘連高復(fù)發(fā)率仍然是臨床難題［15］。間充質(zhì)干細(xì)胞由于具有豐富的可獲得性、自我更新和分化的潛力在再生醫(yī)學(xué)中顯示出巨大的應(yīng)用潛力［14］。PF?127 水凝膠可成為細(xì)胞運(yùn)輸載體，保證內(nèi)膜修復(fù)過(guò)程中干細(xì)胞的有效濃度［16-18］。本研究通過(guò)構(gòu)建ADSCs?PF?127 水凝膠復(fù)合物，比較評(píng)價(jià)其對(duì)化學(xué)損傷IUA 兔子宮內(nèi)膜的修復(fù)作用，從而為中重度IUA 的治療提供新的思路。

注：干預(yù)治療14 d 后行免疫組織化學(xué)染色（×400）

在本研究中，經(jīng)PF?127 水凝膠組干預(yù)治療后子宮內(nèi)膜仍有膠原纖維沉積，僅有少量腺體增生，TGF?β 表達(dá)量上調(diào)，這說(shuō)明僅用單獨(dú)PF?127 水凝膠治療不能使子宮內(nèi)膜腺體大量增生和減輕子宮內(nèi)膜纖維化；ADSCs 組子宮內(nèi)膜間質(zhì)仍有輕度纖維化，腺體數(shù)目下降，這說(shuō)明ADSCs 在減少子宮內(nèi)膜炎癥、增強(qiáng)腺體的增殖方面療效并不明顯。ADSCs?PF?127 水凝膠復(fù)合物組，宮腔形態(tài)基本恢復(fù)正常，纖維化程度明顯減低，腺體數(shù)目明顯增加，子宮內(nèi)膜纖維化標(biāo)志物TGF?β 較IUA 模型組明顯降低，這說(shuō)明其對(duì)宮腔粘連子宮內(nèi)膜纖維化及腺體的增殖均具有一定的改善作用。

綜上所述，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和PF?127 水凝膠聯(lián)合應(yīng)用于新西蘭大白兔IUA 動(dòng)物模型療效顯著，對(duì)其損傷子宮內(nèi)膜厚度、腺體數(shù)量和纖維化程度均有一定的改善作用，ADSCs?PF?127 水凝膠復(fù)合物可以作為一種有效的治療方法，從而為進(jìn)一步探討IUA 的病理機(jī)制提供基礎(chǔ)。