李海珍，祁 瑛，郭勝存，陳湘宏

(1.青海省人民醫(yī)院皮膚科，西寧 810007；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重醫(yī)學(xué)科，鄭州 450003；3.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，西寧 810001)

研究表明，高海拔地區(qū)紫外線(xiàn)(UV)的強(qiáng)度明顯高于平原地區(qū)，皮膚病的發(fā)病率較高[1-3]。皮膚光老化是臨床常見(jiàn)的皮膚病之一，尤其在高原地區(qū)發(fā)病率較高，臨床表現(xiàn)為皮膚松弛、下垂、色素沉著和角質(zhì)增厚等。研究報(bào)道，皮膚受損后，細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧自由基，可直接或間接地作用于細(xì)胞DNA，造成DNA的斷裂[4-5]。皮膚光老化的過(guò)程會(huì)引起炎癥因子的升高，激活相關(guān)信號(hào)通路。

蕪菁(Brassicarapa)為十字花科植物，是生長(zhǎng)在海拔3 800 m以上的藥食兩用植物?！侗静菥V目》記載“蕪菁苦溫?zé)o毒，利五臟，輕身益氣”?！毒е楸静荨酚涊d“蕪菁味辛，性溫，治培根病、隆病，生赤巴”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，蕪菁具有抗氧化、降血糖、抗衰老等作用，但在皮膚光老化方面的研究鮮有報(bào)道[6-7]。本研究通過(guò)探討蕪菁對(duì)UV誘導(dǎo)的皮膚光老化的保護(hù)作用，為蕪菁的臨床應(yīng)用提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 TL-D/BLB型紫外線(xiàn)殺菌燈(美國(guó)飛利浦有限公司)；HKJ-SK03P型彈性水分油光皮膚測(cè)試儀(日本HUNTKEY株式會(huì)社)；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher科技公司)；ABI Q5型熒光定量?jī)x(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)；TGL-16 B型高速冷凍離心機(jī)，KA-1000型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))；YDS-30型東亞液氮容器(樂(lè)山市東亞機(jī)電工貿(mào)有限公司)；BT224S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；XW-80A型漩渦混合器(上海醫(yī)大儀器廠(chǎng))。

1.2試藥 蕪菁?jí)K根，購(gòu)自青海省玉樹(shù)州稱(chēng)多縣，由青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院中藥教研室人員鑒定為十字花科植物蕪菁(Brassicarapa)。烏拉坦溶液(批號(hào)171101，上海展云化工有限公司)；超氧化物歧化酶試劑盒(SOD，批號(hào)20180204)，丙二醛試劑盒(MDA，批號(hào)20180204)，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶試劑盒(GSH-Px，批號(hào)20180204)，過(guò)氧化氫酶試劑盒(CAT，批號(hào)20180204)，均購(gòu)自南京建成生物有限公司。大鼠透明質(zhì)酸酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(HA，批號(hào)18110156)，大鼠羥脯氨酸ELISA試劑盒(Hyp，批號(hào)18110156)，大鼠Ⅰ型膠原酶ELISA試劑盒(Col Ⅰ，批號(hào)18110156)，大鼠Ⅲ型膠原酶ELISA試劑盒(Col Ⅲ，批號(hào)18110156)，大鼠彈性蛋白酶ELISA試劑盒(NE，批號(hào)18110156)，均購(gòu)自南京菲爾特生物有限公司。總RNA提取試劑盒(批號(hào)U85622，天根生化科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)558800500)，熒光定量PCR試劑盒(批號(hào)558800500)，均購(gòu)自安徽Biosharp生物有限公司。

1.3動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量為200～220 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(陜)2018-001，分籠飼養(yǎng)；每12 h明暗交替1次，自由飲水，溫度為(23±2)℃，相對(duì)濕度為50%～60%。

2 方法

2.1動(dòng)物分組及給藥 將40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、蕪菁揮發(fā)油高(40 g·kg-1)、低(20 g·kg-1)劑量組，每組10只。蕪菁揮發(fā)油的制備參照課題組前期研究方法[8-9]，取蕪菁干燥塊根300 g，研末，用超臨界二氧化碳萃取儀萃取，萃取條件:壓力30 MPa，溫度35 ℃，二氧化碳流量 18 mL。取萃取出的揮發(fā)油 5 mL，按油∶ 水∶ 阿拉伯膠粉=4∶2∶1的比例研磨均勻，配制成質(zhì)量濃度為 1 g·mL-1的混懸溶液，避光低溫保存?zhèn)溆?。造模成功后，蕪菁揮發(fā)油高、低劑量組灌胃給予蕪菁揮發(fā)油，對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水，連續(xù)14 d。

2.2模型建立 模型組和蕪菁揮發(fā)油高、低劑量組大鼠每日進(jìn)行UV照射，UV波長(zhǎng)范圍為350～400 nm，每日照射60 min，光源與皮膚的距離為40 cm，持續(xù)造模50 d。對(duì)照組大鼠正常光照飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水。

2.3皮膚含水量測(cè)定 用皮膚含水量測(cè)定儀每周檢測(cè)皮膚含水量。按照公式計(jì)算皮膚含水量(V)：V=(M1-M2)÷M1×100%。M1為干燥前質(zhì)量(mg)；M2為干燥后質(zhì)量(mg)。

2.4ELISA法測(cè)定皮膚組織中的蛋白表達(dá) 頸椎脫臼處死大鼠，取1.5 cm×1.5 cm背部皮膚，用預(yù)冷的生理鹽水進(jìn)行沖洗，剪碎組織，加入9倍體積的生理鹽水和蛋白裂解液，組織勻漿，以3 000 r·min-1離心20 min，取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定透明質(zhì)酸、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、彈性蛋白和脯氨酸的蛋白表達(dá)。

2.5皮膚組織中SOD、GSH-Px和CAT的活性以及MDA含量測(cè)定 頸椎脫臼處死大鼠，取1.5 cm×1.5 cm背部皮膚，用預(yù)冷的生理鹽水進(jìn)行沖洗，剪碎組織，加入9倍體積的生理鹽水和蛋白裂解液，組織勻漿，以3 000 r·min-1離心20 min，取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定SOD、GSH-Px和CAT的活性以及MDA的含量。

2.6ELISA法測(cè)定血清中核因子-κB(NF-κB)、Toll樣受體4(TLR4)、分裂原激活的蛋白激酶(P38-MAPK)和磷脂酰肌醇激酶(PI3K)的蛋白表達(dá) 用0.2 g·mL-1烏拉坦麻醉大鼠(1 g·kg-1)，腹主動(dòng)脈取血，置于促凝管中，以3 000 r·min-1離心15 min，分離血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K的蛋白表達(dá)。

2.7real-time PCR測(cè)定血清中NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K的mRNA表達(dá) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K的mRNA表達(dá)，使用GenScript Real-time PCR (TaqMan) Primer Design 設(shè)計(jì)引物，見(jiàn)表1。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，以cDNA模板進(jìn)行real-time PCR。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃、10 min，變性95 ℃、15 s，退火55 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，共30個(gè)循環(huán)；以2-△△CT值表示目標(biāo)基因NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K mRNA表達(dá)。

表1 大鼠基因引物序列

3 結(jié)果

3.1蕪菁揮發(fā)油對(duì)皮膚光老化大鼠皮膚含水量的影響 見(jiàn)表2。由表2可知，與對(duì)照組比較，模型組大鼠皮膚含水量在造模后第28天開(kāi)始顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，蕪菁揮發(fā)油高劑量組在第35、42、49天皮膚含水量顯著升高(P<0.05)，低劑量組在第35、42、49天皮膚含水量顯著升高(P<0.05)。對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)皮膚含水量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 蕪菁揮發(fā)油對(duì)大鼠皮膚含水量的影響

3.2蕪菁揮發(fā)油對(duì)皮膚光老化大鼠透明質(zhì)酸、羥脯氨酸、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白和彈性蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)表3。由表3可知，與對(duì)照組比較，模型組大鼠皮膚組織中透明質(zhì)酸和羥脯氨酸的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，蕪菁揮發(fā)油高、低劑量組的透明質(zhì)酸和羥脯氨酸的蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。蕪菁揮發(fā)油高劑量組透明質(zhì)酸和羥脯氨酸與對(duì)照組透明質(zhì)酸和羥脯氨酸比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，模型組皮膚組織中Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白和彈性蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，蕪菁揮發(fā)油高、低劑量組Ⅰ型膠原蛋白，Ⅲ型膠原蛋白和彈性蛋白的表達(dá)均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。蕪菁揮發(fā)油高劑量組Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白和彈性蛋白的表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。蕪菁揮發(fā)油低劑量組Ⅲ型膠原蛋白與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 蕪菁揮發(fā)油對(duì)大鼠透明質(zhì)酸和羥脯氨酸蛋白表達(dá)的影響

3.3蕪菁揮發(fā)油對(duì)皮膚光老化大鼠抗氧化指標(biāo)SOD、GSH-Px和CAT活性及MDA含量的影響 見(jiàn)表4。由表4可知，與對(duì)照組比較，模型組大鼠的抗氧化指標(biāo)CAT、SOD活性明顯降低，GSH-Px活性顯著升高，MDA含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，蕪菁揮發(fā)油低、高劑量組GSH-Px活性顯著降低，CAT和SOD活性明顯升高，MDA含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，蕪菁揮發(fā)油可明顯抑制UV對(duì)大鼠皮膚光老化造成的脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。

表4 蕪菁揮發(fā)油對(duì)大鼠GSH-Px、CAT和SOD活性及MDA含量的影響

3.4蕪菁揮發(fā)油對(duì)皮膚光老化大鼠氧化通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)圖1。由圖1可知，與對(duì)照組比較，模型組大鼠NF-κB、TLR4和P38-MAPK的蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，PI3K的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，蕪菁揮發(fā)油低、高劑量組大鼠的NF-κB、TLR4和P38-MAPK的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，PI3K蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。蕪菁揮發(fā)油高劑量組大鼠的NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K的蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 蕪菁揮發(fā)油對(duì)NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K蛋白表達(dá)的影響

3.5蕪菁揮發(fā)油對(duì)皮膚光老化大鼠氧化通路相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的影響 見(jiàn)圖2。由圖2可知，與對(duì)照組比較，模型組大鼠NF-κB、TLR4和P38-MAPK的mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)，PI3K的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，蕪菁揮發(fā)油低、高劑量組NF-κB、TLR4和P38-MAPK的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)，PI3K的mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。蕪菁揮發(fā)油高劑量組NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K的mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。蕪菁揮發(fā)油高、低劑量組的mRNA表達(dá)變化趨勢(shì)與蛋白表達(dá)一致。

圖2 蕪菁揮發(fā)油對(duì)NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K的mRNA表達(dá)的影響

4 討論

UV所致的皮膚光老化，中醫(yī)理論認(rèn)為是光毒侵襲、稟賦不耐。蕪菁味苦辛甘，具有利濕解毒的功效，基于中醫(yī)辨證的角度，蕪菁可以治療UV所致的皮膚損傷。本研究采用目前使用廣泛的紫外線(xiàn)燈制備UV誘導(dǎo)的皮膚光老化大鼠模型，該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，模型建立成功率高[10-11]。

Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白是皮膚組織膠原的主要成分，二者相互協(xié)作維持皮膚的張力和彈性。在UV照射反復(fù)刺激下，二者的比例或含量發(fā)生顯著變化，從而改變機(jī)體皮膚的質(zhì)量。皮膚發(fā)生光老化后，脯氨?；傅幕钚燥@著降低，羥脯氨酸的合成減少[12-13]。研究結(jié)果顯示，UV照射后皮膚組織中的含水量顯著降低，透明質(zhì)酸、羥脯氨酸、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、彈性蛋白均顯著降低，表明造模成功。在給予蕪菁揮發(fā)油后，皮膚含水量顯著升高，膠原蛋白、彈性蛋白的表達(dá)也顯著升高，提示蕪菁可抑制UV對(duì)皮膚的損傷。研究表明，皮膚光老化與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[14-15]。細(xì)胞可產(chǎn)生大量自由基，引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞造成損傷[16-17]。本研究通過(guò)氧化指標(biāo)和相關(guān)通路探討蕪菁揮發(fā)油對(duì)UV誘導(dǎo)的皮膚光老化大鼠的作用機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UV可顯著降低CAT、SOD的活性以及MDA的含量，但GSH-Px的活性顯著升高，與文獻(xiàn)報(bào)道不一致[18]。推測(cè)可能是由于氧化應(yīng)激所致，UV照射大鼠后，機(jī)體為清除更多的氧自由基，應(yīng)激性地升高抗氧化酶活力，從而加快細(xì)胞內(nèi)過(guò)剩的自由基，以此達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。

NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K是氧化通路中重要的蛋白，一定劑量的UV作用于大鼠后，導(dǎo)致皮膚組織細(xì)胞中ROS的含量顯著升高，過(guò)量的ROS激活NF-κB和TLR4通路，通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)釋放大量的炎性因子，引起細(xì)胞凋亡[19-20]。本研究結(jié)果顯示，蕪菁揮發(fā)油可顯著抑制NF-κB和TLR4的蛋白和mRNA表達(dá)，減輕氧化通路所致的細(xì)胞損傷。P38是MAPK的重要分支，位于NF-κB通路的上游，在氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要的作用。本研究結(jié)果顯示，蕪菁揮發(fā)油高、低劑量均可降低P38-MAPK的蛋白和mRNA表達(dá)。PIK3參與了細(xì)胞的凋亡過(guò)程，它的活化可以降低細(xì)胞凋亡。此外，蕪菁揮發(fā)油可顯著抑制UV所致的PIK3蛋白和mRNA表達(dá)的降低，減少皮膚細(xì)胞的凋亡，減輕UV對(duì)皮膚的損傷。

綜上所述，蕪菁揮發(fā)油可顯著減輕UV對(duì)皮膚的損傷，具有抗皮膚光老化的作用，其機(jī)制可能是通過(guò)NF-κB、TLR4、P38-MAPK和PI3K通路來(lái)抑制細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，清除體內(nèi)自由基，從而抑制光老化的發(fā)生。