李世洋 楊 陽 葛勝晗 林少玲

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福州 350002)

功能性油脂是一類具有預(yù)防內(nèi)源性疾病、抗衰老和抑癌等特殊生理功能的油脂，在傳統(tǒng)食用油脂(如大豆油)中添加功能性油脂可以大大提升食用油的營養(yǎng)品質(zhì)和保健功效，成為一種對人體更加有益的食用油，但功能性油脂目前存在產(chǎn)量低、成本高和油脂品質(zhì)差等問題[1，2]。不飽和脂肪酸是功能性油脂中的主要活性物質(zhì)，其中多不飽和脂肪酸具有降膽固醇、降血脂、改善老年癡呆等保健作用，對于調(diào)節(jié)人類生理功能有著非常重要的作用[3-5]。用不飽和脂肪酸替代功能性油脂添加到傳統(tǒng)食用油中，可以起到與功能性油脂相同的作用，同時(shí)也能彌補(bǔ)功能性油脂的不足。而小球藻中富含蛋白、多糖、油脂等營養(yǎng)活性成分，其中多不飽和脂肪酸在小球藻油脂中質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到70%以上，并且亞油酸和α-亞麻酸2種多不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別高達(dá)47%、13%[6]。并且小球藻在自然界中分布較為廣泛、生命力強(qiáng)、易于培養(yǎng)，所以在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用有很廣闊的前景[7，8]。

目前小球藻不飽和脂肪酸的提取方法主要有油脂水解法和堿提法等，油脂水解法需要先從小球藻中提取油脂，將油脂皂化水解后再萃取分離得到脂肪酸[9-11]，目前已有較多研究。油脂水解法中主要包括浸提法和超臨界萃取法。其中浸提法所需提取周期較長，并且需要大量使用提取溶劑，常用的提取溶劑有生物基溶劑[乙酸乙酯、乳酸乙酯、環(huán)戊基甲醚(CPME)和2-甲基四氫呋喃等]和有機(jī)溶劑(正己烷、甲醇、石油醚、氯仿等及其混合溶劑體系)[12]。生物基提取溶劑的使用會在一定程度上降低提取物中不飽和脂肪酸的含量[13]，此外，由于大多數(shù)有機(jī)提取溶劑對人體有害，所以在食品工業(yè)中的應(yīng)用中通常受到嚴(yán)格的管控。相較于浸提法，超臨界CO2萃取法是一種更加綠色溫和的提取方法，具有提取產(chǎn)品純度高、毒副作用產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，但對提取條件和提取設(shè)備的要求較高[14，15]。與油脂水解法相比較，直接堿提法可以從小球藻中直接提取得到小球藻不飽和脂肪酸，能有效提高不飽和脂肪酸的提取效率，減少提取過程中提取溶劑的使用，節(jié)省提取時(shí)間，更好地避免不飽和脂肪酸的氧化，能大大提高經(jīng)濟(jì)性和實(shí)用性[16]，但目前對于小球藻不飽和脂肪酸直接堿提法研究較少。

本研究對小球藻不飽和脂肪酸的直接堿提法進(jìn)行工藝優(yōu)化以及對小球藻不飽和脂肪酸的品質(zhì)進(jìn)行研究，并分析在大豆油中添加不同濃度的小球藻不飽和脂肪酸后對大豆油油脂特性的影響。以期得到更加適宜的小球藻不飽和脂肪酸的提取方法，以及為小球藻不飽和脂肪酸在功能性油脂開發(fā)中的潛在應(yīng)用前景提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 原料與試劑

小球藻干粉(噴霧干燥)、亞麻籽油標(biāo)準(zhǔn)品、大豆油；正己烷、尿素、甲醇、氫氧化鉀、35%鹽酸均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，多功能攪拌器、數(shù)顯恒溫水浴鍋，高效液相色譜儀。

1.2 方法

1.2.1 堿提法提取小球藻不飽和脂肪酸

小球藻不飽和脂肪酸的提取參考王玉仙[17]的方法，在其基礎(chǔ)上稍作改動。稱取 1 g 左右小球藻干藻粉于 1 L 的三角瓶中，向三角瓶中加入濃度為0.5 mol/L的KOH/甲醇溶液20 mL，60 ℃熱水浴中加熱攪拌 1 h得皂化液，抽濾分離除去藻體，濾液用鹽酸將 pH 調(diào)成酸性后移入萃取分離器中，加入正己烷充分萃取，獲得有機(jī)相，旋蒸除去正己烷溶劑得到小球藻混合脂肪酸。

60 ℃水浴加熱配制0.2 g/mL尿素/甲醇溶液，稱取一定量混合脂肪酸加入到配好的尿素溶液中后放置于4 ℃環(huán)境過夜。取出后用少量去離子水洗滌，而后迅速抽濾，然后再加入相同體積的正己烷進(jìn)行充分萃取，萃取后正己烷相用濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮即得富集后的小球藻不飽和脂肪酸樣品。

提取完畢后，小球藻不飽和脂肪酸的得率按公式計(jì)算：

式中：m2為離心管與小球藻不飽和脂肪酸樣品質(zhì)量/g；m3為離心管空管質(zhì)量/g。m1為小球藻干粉質(zhì)量/g。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

以小球藻不飽和脂肪酸的提取率為指標(biāo)，控制提取料液比1∶20(g/mL)、提取時(shí)間、60 min不變，考察在提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃的條件下時(shí)小球藻不飽和脂肪酸得率的影響。

以小球藻不飽和脂肪酸的提取率為指標(biāo)，控制提取時(shí)間60 min、提取溫度60 ℃不變，考察在提取料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)的條件下時(shí)對小球藻不飽和脂肪酸得率的影響。

以小球藻不飽和脂肪酸的提取率為指標(biāo)，控制提取料液比1∶20(g/mL)、提取溫度60 ℃不變，考察在提取時(shí)間分別為30、60、90、120、150 min的條件下時(shí)對小球藻不飽和脂肪酸得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)

在以提取料液比(A)、提取時(shí)間(B)和提取溫度(C)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定提取條件的最優(yōu)范圍后，將A、B、C作為考察因素，小球藻不飽和脂肪酸得率作為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平的中心組合實(shí)驗(yàn)。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 中心組合實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.2.4 氣相色譜法分析小球藻不飽和脂肪酸成分

取小球藻不飽和脂肪酸樣品3 mL，色譜條件：色譜柱采用HP-5MS 石英彈性毛細(xì)管柱，規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.2 μm；溶劑：正己烷；載氣：氦氣(純度為99.99%) ；流速1 mL /min，進(jìn)樣量1.0 μL，分流比20∶1；升溫程序：柱子初始溫度80 ℃，保持1.1 min，先以17 ℃/min 的升溫速率升至240 ℃，維持0.7 min，然后再以1 ℃/min 的升溫速率升至253 ℃，保持4 min；進(jìn)樣口溫度253 ℃。質(zhì)譜條件：離子源為電子轟擊源(EI)，電離電壓70 eV，四級桿溫度150 ℃，EM 電壓1 024 V，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍40～600 u。

取大豆油樣品3 mL，分析條件：色譜柱用HP-88，規(guī)格為60 m×250 μm×0.2 μm；進(jìn)樣量1 μL；升溫程序：柱子初始溫度40 ℃保持在3 min，以40 ℃/min的升溫速率升至120 ℃，再以8 ℃/min的升溫速率升至160 ℃，持續(xù)1 min；以3 ℃/min的升溫速率升至181 ℃，持續(xù)10 min；以2 ℃/min的升溫速率升至212 ℃，持續(xù)5 min；共運(yùn)行48.5 min。檢測器為FID，汽化溫度250 ℃，氫氣流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min，尾吹流量19.5 mL/min[18]。

1.2.5 小球藻不飽和脂肪酸油脂品質(zhì)特性測定

空白對照組：純大豆油。實(shí)驗(yàn)組：在大豆油中添加不同濃度的小球藻不飽和脂肪酸，添加小球藻不飽和脂肪酸的比例分別為25、50 mg/mL；標(biāo)準(zhǔn)品組：在大豆油中添加亞麻籽油，比例為100 mg/mL；將4個組別分別標(biāo)記為：大豆油組(純大豆油)、C.PUFA 1組(將小球藻不飽和脂肪酸按25 mg/mL的比例加入大豆油中)、C.PUFA 2組(將小球藻不飽和脂肪酸按50 mg/mL的比例加入大豆油中)和標(biāo)品組(將亞麻籽油按100 mg/mL的比例加入大豆油中)。

1.2.5.1 酸價(jià)的測定

酸價(jià)采用優(yōu)化的國標(biāo)法進(jìn)行檢測。精確稱取3～5 g樣品將其放于錐形瓶中，加入50 mL乙醚-乙醇按比例2∶1混合的混合試劑，搖動錐形瓶使樣品充分溶解，然后加3滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L堿液(KOH)滴定至出現(xiàn)微紅色30 s不消失，記錄消耗的堿液體積。按公式計(jì)算酸價(jià)：

式中：V為滴定中使用的堿液體積/mL；N為堿液的濃度；56.1為堿液的毫克當(dāng)量；m試樣的質(zhì)量/g。

1.2.5.2 過氧化值的測定

過氧化值采用優(yōu)化的國標(biāo)法進(jìn)行檢測。精確稱取樣品2～5 g放到錐形瓶中，在錐形瓶中加入50 mL乙酸乙酯和冰乙酸按比例2∶3混合的混合溶劑，搖勻使樣品完全溶解。然后加入0.5 mL飽和碘化鉀溶液搖勻后避光放置3 min。立即加入30 mL蒸餾水搖勻，用硫代硫酸鈉溶液滴定至黃色幾乎消失。加入0.5 mL淀粉指示劑搖勻，再用硫代硫酸鈉溶液滴定至藍(lán)色消失即為滴定終點(diǎn)。滴定過程中均需不斷搖動。按公式計(jì)算過氧化值：

式中：c為硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度/mol/mL；0.126 9為每毫摩爾硫代硫酸鈉相當(dāng)于碘的克數(shù)；V1為試樣液消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/mL；V0為空白溶液消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/mL；m為試樣的質(zhì)量/g。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel2010，GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Standard Deviation，SD)差異顯著性分析使用SPSS軟件進(jìn)行，不同字母表示顯著差異(P<0.05)，響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在提取料液比為1∶20，提取溫度為60 ℃的條件下，改變提時(shí)間分別為30、60、90、120、150 min，分析提取時(shí)間對小球藻不飽和脂肪酸得率的影響，結(jié)果如圖1，提取時(shí)間對小球藻脂肪酸不飽和得率影響顯著。在提取時(shí)間為30～60 min之間時(shí)，提取時(shí)間越長，小球藻不飽和脂肪酸得率越高；60 min之后，隨著提取時(shí)間的增加，得率持續(xù)下降。這可能是由于在60 min之前，小球藻不飽和脂肪酸無法擁有足夠的時(shí)間被溶出，而60 min之后，由于時(shí)間過長，會導(dǎo)致提取溶劑的部分蒸發(fā)損失導(dǎo)致小球藻不飽和脂肪酸得率下降。并且提取時(shí)間過長會導(dǎo)致更多的雜質(zhì)溶出以及不飽和脂肪酸的氧化，使得脂肪酸品質(zhì)下降。因此選取最佳提取時(shí)間為60 min。

在提取時(shí)間為60 min，提取溫度為60 ℃的條件下，改變提取料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，分析提取料液比對小球藻不飽和脂肪酸得率的影響，結(jié)果如圖1，料液比對小球藻不飽和脂肪酸得率影響顯著(P<0.05)，當(dāng)料液比在1:(10～30)范圍內(nèi)，隨著料液比的增加，小球藻不飽和脂肪酸得率呈增加趨勢，適當(dāng)增加提取液的體積能夠充分穿透小球藻細(xì)胞壁，對細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)進(jìn)行充分水解。然而隨著料液比的持續(xù)增加，小球藻不飽和脂肪酸的得率并沒有得到明顯提高，可能是在這種提取條件下，能獲得的小球藻脂肪酸已達(dá)最高。繼續(xù)增加料液比會導(dǎo)致提取液的浪費(fèi)，故選擇料液比為1∶30。

在提取料液比為1∶20，提取時(shí)間為60 min的條件下，改變提溫度分別為40、50、60、70、80 ℃，分析提取溫度對小球藻不飽和脂肪酸得率的影響，結(jié)果如圖1所示，提取溫度對小球藻不飽和脂肪酸得率影響顯著，且在50 ℃時(shí)小球藻不飽和脂肪酸得率達(dá)到最高。這可能是由于當(dāng)溫度較低時(shí)，不利于甲醇溶液穿透細(xì)胞壁，從而影響脂肪酸的提取。而當(dāng)溫度較高時(shí)，本來就不利于KOH的溶解，且會使更多的甲醇處于蒸發(fā)的氣體狀態(tài)，進(jìn)一步不利于KOH的溶解從而不能有效提取小球藻不飽和脂肪酸，降低脂肪酸得率。因此選擇最佳提取溫度為50 ℃。

圖1 提取料液比、時(shí)間、溫度對得率的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

以小球藻不飽和脂肪酸得率為指標(biāo)建立回歸模型，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。對表2中的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，可以得到小球藻不飽和脂肪酸提取工藝的數(shù)學(xué)模型：Y=3.36+0.013A-0.14B-0.15C-0.025AB+0.05AC+0.05BC-0.84A2-1.44B2-0.72C2，式中的Y代表小球藻不飽和脂肪酸得率、A代表小球藻不飽和脂肪酸的提取料液比、B代表小球藻不飽和脂肪酸的提取溫度、C代表小球藻不飽和脂肪酸的提取時(shí)間。對回歸模型進(jìn)行方差分析，得到如表3所示數(shù)據(jù)。根據(jù)表3可知，小球藻不飽和脂肪酸得率的回歸模型P<0.000 1達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)結(jié)果P值0.116 5不顯著，表明該模型和實(shí)際情況擬合度較好，可以通過此方程確定小球藻不飽和脂肪酸提取工藝的最優(yōu)參數(shù)。其中A2、B2和C2都達(dá)到極顯著水平，表明了提取料液比(A)、提取溫度(B)和提取時(shí)間(C)這幾個單因素對小球藻不飽和脂肪酸的得率均有顯著影響，而交互因素AB、AC、BC都不顯著，這說明各因素之間交互作用很小。

表2 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 小球藻不飽和脂肪酸脂肪酸得率回歸模型方差分析

2.2.2 各因素交互作用分析

通過建立的模型，研究表明小球藻不飽和脂肪酸得率的趨勢隨著提取料液比和提取溫度的上升表現(xiàn)為先增加然后有一定程度的下降，原因可能是小球藻中不飽和脂肪酸已經(jīng)被全部提取出，此時(shí)再升高提取溫度小球藻不飽和脂肪酸的得率也無法進(jìn)一步增加，且溫度過高會導(dǎo)致小球藻不飽和脂肪酸的品質(zhì)發(fā)生劣變[19]。根據(jù)等高線的密度和響應(yīng)面的陡峭程度，可以判斷出較高的料液比和較低的提取溫度對小球藻不飽和脂肪酸的得率影響更加顯著。

2.3 最優(yōu)工藝條件

2.3.1 最佳工藝參數(shù)

根據(jù)單因素及響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得出提取小球藻不飽和脂肪酸的最佳工藝參數(shù)為料液比為1∶25、提取溫度49.5 ℃、提取時(shí)間56.83 min。使用Design Expert 8.0.6軟件擬合回歸模型得到在此條件下，小球藻不飽和脂肪酸的理論得率為(3.37±0.006 9)%。

2.3.2 最優(yōu)工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)軟件對比分析得出的最佳工藝參數(shù)(料液比為1∶25、提取溫度49.5 ℃、提取時(shí)間56.83 min)結(jié)合實(shí)際條件取料液比為1∶25、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間60 min進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，小球藻不飽和脂肪酸的實(shí)際得率為(3.15±0.045)%，小球藻不飽和脂肪酸的實(shí)際得率符合模型預(yù)測，說明本次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果穩(wěn)定可靠。

2.4 小球藻不飽和脂肪酸成分分析

圖2為小球藻不飽和脂肪酸的GC-MS譜圖，對小球藻不飽和脂肪酸和大豆油的主要脂肪酸成分進(jìn)行分析，由表4可知，小球藻不飽和脂肪酸的主要脂肪酸成分為亞油酸(C18∶2N6C)，占比為(62.96±0.86)%；其次為棕櫚油酸(C16∶1)、棕櫚酸(C16∶0)和油酸(C18∶1N9C)，占比分別為(12.14±0.025)%、(9.88±0.068)%、(8.62±0.037)%。根據(jù)李雅[20]的研究，采用浸提法提取出的小球藻油脂中，脂肪酸中含量最高的亞油酸占脂肪酸總量的33%。相較而言，本研究所用直接堿提法提取的小球藻不飽和脂肪酸的亞油酸含量高于浸提法。此外，由圖2可知，采用直接堿提法提取所得小球藻脂肪酸種類較豐富，而浸提法提取所得脂肪酸種類較少，其原因可能是用浸提法提取時(shí)，所用的溶劑體系會對油脂中脂肪酸的成分造成降解[21],導(dǎo)致一些短鏈脂肪酸無法被提取。而堿提法則無需考慮溶劑對脂肪酸成分的影響。

圖2 小球藻不飽和脂肪酸的成分分析圖譜

圖3 大豆油脂肪酸成分分析圖譜

由圖2、圖3可知，小球藻不飽和脂肪酸和大豆油的主要脂肪酸成分類似，半數(shù)以上均為亞油酸(C18∶2N6C)，但小球藻不飽和脂肪酸中亞油酸含量比大豆油高120.002 9%；其次為油酸，大豆油中的油酸含量比小球藻不飽和脂肪酸要高(6.000 0±0.007 4)%；小球藻不飽和脂肪酸中第二主要脂肪酸為棕櫚油酸，占比分別為(12.140±0.025)%，而大豆油中，棕櫚油酸含量極微。相較于大豆油，小球藻不飽和脂肪酸的譜圖有多個峰值指示，說明小球藻不飽和中脂肪酸種類更豐富。

表4 小球藻和大豆油不飽和脂肪酸主要成分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%

2.5 添加小球藻不飽和脂肪酸提取物對大豆油油脂品質(zhì)特性的影響

過氧化值體現(xiàn)的是油脂的氧化酸敗程度，反映油脂質(zhì)量的好壞。圖4為添加不同濃度小球藻不飽和脂肪酸大豆油的過氧化值比較。大豆油組的過氧化值和C.PUFA1組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，C.PUFA2和標(biāo)品組的過氧化值顯著高于大豆油組。這是由于C.PUFA2組和標(biāo)品組的不飽和脂肪酸含量較大豆油顯著升高，而油脂中的不飽和脂肪酸易發(fā)生氧化，油脂的不飽和程度越高氧化酸敗速度越快[22]。但整體而言4種油脂的過氧化值均處于較低水平，遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)。

注:大豆油組和各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行差異性分析，P<0.05*，P<0.01**。圖4 4種不同組分油脂的過氧化值

酸價(jià)能體現(xiàn)油脂中游離脂肪酸的多少，游離脂肪酸是油脂發(fā)生水解的產(chǎn)物，因此酸價(jià)指示油脂的新鮮程度。圖5為添加不同濃度小球藻不飽和脂肪酸大豆油的酸價(jià)比較，在大豆油中添加低質(zhì)量濃度(25 mg/mL)小球藻不飽和脂肪酸時(shí)，酸價(jià)無明顯改變，但添加較高質(zhì)量濃度(50 mg/mL)小球藻不飽和脂肪酸和100 mg/mL亞麻籽油時(shí)顯著提升大豆油的酸價(jià)。其原因是因?yàn)樵诖蠖褂椭刑砑痈邼舛鹊男∏蛟宀伙柡椭舅岷蛠喡樽延涂梢燥@著升高大豆油中不飽和脂肪酸的含量，不飽和脂肪酸含量的升高不可避免的導(dǎo)致油脂更容易發(fā)生劣變。但在相同儲藏條件下，4種油脂的酸價(jià)均未超過國家標(biāo)準(zhǔn)的4 mg KOH/g。

注:大豆油組和各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行差異性分析，P<0.05*，P<0.01**。圖5 4種不同組分油脂的酸價(jià)

3 結(jié)論

本研究通過單因素和響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)得到小球藻不飽和脂肪酸最佳提取工藝參數(shù)：提取料液比1∶25、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間60 min，在此工藝條件下小球藻不飽和脂肪酸得率可達(dá)到(3.15±0.045)%。通過GC-MS和GC分別對小球藻不飽和脂肪酸和大豆油進(jìn)行成分分析，發(fā)現(xiàn)小球藻不飽和脂肪酸相較于大豆油，在脂肪酸成分上其種類較豐富，品質(zhì)較好。除此之外，還將不同比例的小球藻不飽和脂肪酸添加到大豆油中，通過碘值、酸價(jià)和過氧化值對其進(jìn)行油脂品質(zhì)特性分析。結(jié)果表明，添加較高濃度小球藻不飽和脂肪酸的大豆油過氧化值和酸價(jià)都顯著升高，這是由于添加較高濃度小球藻不飽和脂肪酸會顯著升高大豆油中不飽和脂肪酸的含量，在提升其營養(yǎng)價(jià)值的同時(shí)導(dǎo)致油脂更容易酸敗。但過氧化值和酸價(jià)都在國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定范圍之內(nèi)，提示在大豆油中添加小球藻不飽和脂肪酸并不會使大豆油的品質(zhì)嚴(yán)重劣變。